摘 要 目的:制備細胞穿膜肽PFV修飾紫杉醇(PTX)/青蒿琥酯(ART)共載靶向膠束,并考察其體外抗腫瘤活性。方法:按前期優(yōu)化的工藝,采用薄膜水化法制備PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束,并對其進行表征。以空白膠束作為空白對照,采用磺基羅丹明B法評價PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對人胃癌BGC-823細胞的毒性;以香豆素作為熒光探針取代PTX,制成相應的不同膠束,采用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定和觀察BGC-823細胞對各膠束的攝取情況和靶向性;并通過Transwell小室法考察PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細胞侵襲的影響。結(jié)果:PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的平均粒徑為(51.30±3.95)nm,分散系數(shù)為 0.19±0.01,Zeta 電位為(0.21±0.02)mV,PTX、ART的包封率均高于90%,形態(tài)呈圓球形?瞻啄z束對BGC-823細胞無明顯毒性,PTX膠束、PTX/ART膠束以及 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束對 BGC-823 細胞的半數(shù)抑制濃度分別為(3.09±0.22)、(1.93±0.24)、(1.11±0.15)μmol/L;不同膠束在BGC-823細胞核中的分布數(shù)量排序依次為PFV修飾香豆素/ART膠束>香豆素/ART膠束>香豆素膠束>空白對照,抑制細胞侵襲作用的大小依次為 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束>PTX/ART 膠束>ART 膠束>PTX 膠束>空白對照。結(jié)論:制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束符合《中國藥典》要求;其對BGC-823細胞具有較強的細胞毒性,可提高藥物的靶向性和細胞對藥物的攝取能力,并能抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
胃癌是消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。目前,化療是胃癌的主要治療方式,但化療后殘余的癌細胞會通過侵襲作用導致腫瘤轉(zhuǎn)移,且化療藥物會增加機體的毒副反應,導致患者預后較差[2]。紫杉醇(PTX)具有較高抗癌活性,在臨床用于多種癌癥的治療,但溶解性低、生物利用度差、無選擇分布是限制其臨床應用的主要原因[3]。提高PTX的靶向性以降低其毒副作用并抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移顯得尤為重要。細胞穿膜肽(簡稱“PFV”)具有細胞穿透能力強的特點,并且能增加藥物在腫瘤部位的蓄積[4]。青蒿琥酯(ART)具有抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增敏抗腫瘤化療藥物的作用[5-7]。膠束具有粒徑小和對機體毒性低等優(yōu)點,可增加化療藥物的溶解度并提高化療藥物對腫瘤的被動靶向性[8-11]。為提高PTX的腫瘤靶向性及其對腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用,本課題組前期優(yōu)化工藝后采用薄膜水化法制備了 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束,其中PFV用來提高細胞對藥物的攝取能力,PTX作為化療藥物,ART用來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本研究在前期研究基礎上,對所制膠束進行表征后并進一步考察PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的體外抗腫瘤作用,為膠束包載PTX的靶向給藥和ART抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關制劑開發(fā)提供參考。
1 材料
1.1 儀器
FA1004 型電子天平(上海越平科學儀器有限公司);SG3300H型超聲波清洗機(上海冠特超聲儀器有限公司);RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DZKW-S-4型恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械公司醫(yī)療器械五廠);HBS-1096A型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司);JEM-1200EX 型透射電鏡(日本 Tokyo 公司);Ac-curi C型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司);ZS90型激光散射粒徑測定儀(英國Malvern公司);WJ-80B-Ⅱ型細胞培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);SW-CJ-1D型超凈臺(上海滬凈醫(yī)療器械有限公司)。
1.2 藥品與試劑
PTX原料藥(批號:MB1178,純度:≥99%)、ART原料藥(批號:J0101A,純度:≥98%)、TPGS1000(批號:MB2036)、胰蛋白酶、磺基羅丹明B(SRB)、青鏈霉素雙抗;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);Soluplus兩親性接枝共聚物(德國BASF公司);二硬脂;字R掖及-聚乙二醇 2000-PFV(DSPE-PEG2000-PFV)修飾膠束的靶向材料由遼寧中醫(yī)藥大學藥學院藥劑實驗室合成;三氯甲烷、甲醇等試劑均為分析純,水為娃哈哈牌純凈水。
1.3 細胞
人胃癌BGC-823細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。
2 方法與結(jié)果
2.1 膠束的制備
按照文獻方法[12],精密稱取 DSPE-PEG2000-PFV 1.5mg、ART 2 mg、Soluplus 60 mg、TPGS1000 12 mg、PTX 0.5mg于50 mL圓底燒瓶中,加5 mL三氯甲烷使溶解,然后在40 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷。待燒瓶底部形成一層均勻白色膜時,加入磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)5 mL,在35 ℃水浴下振搖11 min,再以微孔濾膜(0.22 μm)濾過 2 次,隨后將濾過的膠束溶液轉(zhuǎn)移至 5mL量瓶中,以PBS定容至刻度,即得PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束。同時,按照上述方法制備空白膠束(空白對照)、PTX膠束、ART膠束和PTX/ART膠束,其中空白膠束只添加處方量的 Soluplus 和 TPGS1000,PTX 膠束只添加處方量的 Soluplus、TPGS1000和 PTX,ART 膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和ART,PTX/ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000、ART和PTX。
2.2 膠束的表征
2.3 細胞培養(yǎng)
將 BGC-823 細胞接種到含 1%青鏈霉素和 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)(下同)。第2天換液,隔天傳代,采用4~6代細胞進行細胞試驗。
2.4 膠束對BGC-823細胞的毒性作用考察
2.5 BGC-823細胞對膠束的攝取情況考察
以香豆素作為熒光探針考察細胞對膠束的攝取情況。以香豆素代替PTX,按“2.1”項下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束(香豆素的含量均為2 μmol/L[3],其余藥物和輔料的用量不變),并同時制備空白膠束作為空白對照。取對數(shù)生長期BGC-823細胞接種至6孔板中(2.5×105個/孔),分為不同膠束給藥組,先用不含藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基,然后加入新鮮含藥培養(yǎng)基[180 μL/孔,其中膠束給藥量均為20 μL/孔(含藥膠束中ART濃度均為100μmol/L)],繼續(xù)培養(yǎng) 3 h。然后以 PBS 洗板,以 0.25%胰蛋白酶消化細胞后加入 0.5 mL PBS。采用流式細胞儀測定各組細胞熒光強度,該值越大,說明細胞對膠束的攝取越多。
2.6 膠束對BGC-823細胞的靶向性考察
以香豆素作為熒光探針考察膠束的靶向性。以香豆素代替PTX,按“2.1”項下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束;同法進行細胞分組、給藥,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,以PBS洗板,加入4%多聚甲醛固定細胞8 min,在避光處用Hoechst 33258對細胞進行染色。采用熒光顯微鏡觀察細胞中藥物的分布情況,其中藍色熒光區(qū)域代表BGC-823細胞核,綠色熒光區(qū)域代表香豆素,藍綠色熒光區(qū)域為細胞與香豆素分布的疊加處。
2.7 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束對 BGC-823 細胞侵襲的影響
采用Transwell小室法進行測定。按“2.1”項下方法分別制備空白膠束(空白對照)、PTX 膠束、ART 膠束、PTX/ART 膠束和 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束,各含藥膠束中 PTX 濃度均為 10 μmol/L,ART 濃度均為100 μmol/L。取對數(shù)生長期BGC-823細胞,以0.25%胰蛋白酶溶液消化后,接種在 Transwell 小室中(1.5×105個/孔),分為不同膠束給藥組,各小室中加入相應含藥培養(yǎng)基[200 μL/室,給藥量為20 μL/室]。在24孔板中加入含 10%胎牛血清的培養(yǎng)基(700 μL/孔),將上述 Transwell小室放在24孔板中培養(yǎng)10 h后,用棉球擦去小室中未侵襲的細胞,并用4%多聚甲醛固定小室下方侵襲的細胞25 min,然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察,并隨機選取1個視野拍照,鏡下紫色信號的強度與侵襲通過小室基底膜的細胞數(shù)量成正比。
3 討論
近年來,膠束作為化療藥物的運送載體在抗腫瘤方面的應用受到越來越多的關注,其疏水嵌段組成的聚合物膠束內(nèi)核能夠為難溶性藥物提供貯藏空間,而疏水性化療藥物的溶解度也在親水外殼的共同作用下明顯提高[8];诖耍菊n題組將化療藥PTX和ART共同包埋于膠束內(nèi),使這兩種藥物達到協(xié)同增效的目的。PFV是一種疏水性的電中性短肽,經(jīng)PFV修飾的脂質(zhì)體等遞藥系統(tǒng)能明顯增加細胞對藥物的攝取[4]。本課題組前期通過;磻铣闪薉SPE-PEG2000-PFV,其可嵌入膠束中使PFV修飾于膠束外周。本研究制備的PFV修飾PTX/ART 共載靶向膠束呈圓球形,粒徑在 51 nm 左右,有良好的粒徑分布和形態(tài),藥物的包封率均大于90%,符合2015版《中國藥典》(四部)的要求[13]。
體外細胞毒性試驗中,PTX 的終濃度設置為 10μmol/L是為了保證在殺傷腫瘤細胞的前提下,還能保證本研究各項試驗中有足夠的細胞存活量;在 ART 的Transwell 小室預試驗中,當 ART 的濃度為 100 μmol/L時,恰能抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,因此本研究在膠束的處方中設置 ART 的濃度為 100 μmol/L。本研究結(jié)果顯示,空白膠束對BGC-823細胞無明顯細胞毒性,這提示膠束膜材安全性較高,可作為運送藥物的載體[14]。PFV修飾 PTX/ART 共載靶向膠束中 PTX 濃度為 0.63~10μmol/L時,與其他膠束樣品比較具有更強的細胞毒性。
因 PTX 和 ART 都不具有熒光活性,所以在細胞攝取和膠束靶向性試驗中,本課題組選擇具有熒光活性的香豆素作為探針藥物。香豆素作為熒光探針在研究脂質(zhì)體等給藥體系的藥物攝取情況中已有運用,具有簡便、易操作的特點[15]。本研究通過流式細胞儀和熒光顯微鏡對PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束進行定量和定性考察,發(fā)現(xiàn)香豆素的熒光強度在PFV修飾膠束組細胞中顯著增強,表明PFV修飾后可增加載藥膠束在腫瘤細胞中的分布,提高了藥物的腫瘤靶向性,并增強了腫瘤細胞對藥物的攝取。此外,本研究通過細胞侵襲試驗發(fā)現(xiàn),載有 ART 的膠束均呈現(xiàn)出對細胞侵襲的抑制作用,這表明 ART 的加入可抑制 BGC-823 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
綜上所述,本研究成功制備了 PFV 修飾 PTX/ART共載靶向膠束,其具有較強的細胞毒性,能提高藥物的腫瘤靶向性和細胞對藥物的攝取能力,并且可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。但由于試驗均在體外完成,并不能代表體內(nèi)結(jié)果,在接下來的研究中,筆者將進一步展開PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的體內(nèi)抗腫瘤作用研究。
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