摘要： 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶( angiotensin converting enzyme，ACE) 通過(guò)作用于維持血壓正常的腎素-血管緊張系統(tǒng) ( rennin-angiotensin system，ＲAS) 和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng) ( kallikrein-kinin system，KKS) ，使其失衡導(dǎo)致血壓升高． 而 ACE 活性抑制肽可以競(jìng)爭(zhēng)性地與 ACE 的活性中心結(jié)合，從而抑制 ACE 的活性，使血壓降低． 天然來(lái)源的 ACE 抑制肽與傳統(tǒng)的降壓藥物相比效果較好，無(wú)毒副作用，對(duì)正常血壓沒(méi)有影響，對(duì)于高血壓的治療和人類健康具有重要意義． 本文以酪蛋白中提取的ACE 活性抑制肽KVLPVP為先導(dǎo)肽，根據(jù)ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一系列的類ACE肽( similar ACE-like peptides) ． 利用反相高效液相色譜法( ＲP-HPLC) 直接測(cè)定其體外 ACE 抑制活性． 結(jié)果表明，當(dāng)芳香性的氨基酸殘基 Phe、Tyr、His 和疏水性 Val 殘基位于 C-端時(shí)會(huì)提高多肽的ACE 抑制活性，尤其是 His 位于 C-端時(shí)，ACE 抑制活性更強(qiáng)． 通過(guò)對(duì)比先導(dǎo)肽與所合成的類 ACE肽的 ACE 活性抑制率，可以發(fā)現(xiàn)，類 ACE 肽的 ACE 活性抑制率均高于先導(dǎo)肽． 基于不同氨基酸殘基位于C-端時(shí)對(duì)多肽的 ACE 抑制活性的研究，可以為降血壓藥物分子設(shè)計(jì)和篩選提供基礎(chǔ)．
高血壓是最常見(jiàn)的慢性病，也是心腦血管病最主要的影響因素，它能引起腦卒中、心肌梗塞、心力衰竭以及慢性腎臟病等并發(fā)癥，潛 在 的 危 害 性大［1，2］． 近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，高血壓的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康［3-7］．血管緊張素轉(zhuǎn)化酶( angiotensin converting enzyme ，ACE) 是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的含 Zn2 + 外肽酶，它不僅可以將沒(méi)有催化活性的血管緊張素 I轉(zhuǎn)化為對(duì)血管收縮具有促進(jìn)作用的血管緊張素 II;而且也可以使舒緩肌肽失活［8，9］，對(duì)人體血壓的調(diào)節(jié)起到重要作用［10］． 目前，人們多使用合成的 ACE抑制劑如卡托普利等藥物來(lái)治療高血壓，但這些藥物存在一定的副作用和不良反應(yīng)，天然來(lái)源的 ACE抑制肽可最大程度地減少傳統(tǒng)降壓藥物產(chǎn)生的一些不良反應(yīng)，在控制和治療高血壓方面有著很大潛力，因此成為人們研究的焦點(diǎn)［9，11］．
1970 年，F(xiàn)erreira等［12］ 在蛇毒液中提取出ACE 抑制肽( ACE inhibitory peptides) ，目 前 已 有很多 ACE 抑制肽的研究報(bào)道． 其中 發(fā) 現(xiàn) 從 酪 蛋白源中提取分離出來(lái) 的KVLVPQ、MAIPKK，服 用很少劑量就能起到很顯著的降壓作用［13-15］． 但是，天然來(lái)源的 ACE 抑制肽結(jié)構(gòu)單一，較多的研究集中在其活性，而很少研究其構(gòu)效關(guān)系． 本文以天然提取的 ACE 活性抑制肽 KVLPVP( 酪蛋白源) 為先 導(dǎo) 肽，根 據(jù) ACE 抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用 Fmoc 固相 合 成 法( SPPS) 合 成 了 3 種 類 ACE抑制肽KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY，研究不同的氨基酸殘基位于 C-端時(shí)對(duì)多肽的 ACE 抑制活性的影響．
1 材料與方法
Fmoc-AA-Wang Ｒesin、Fmoc-AA-OH、HOBt、HBTU、DIEA、TFA、TIS ; 茚三酮、哌啶、無(wú)水乙醚、DMF 均為市售分析純?cè)噭? ACE、HHL 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; 馬尿酸( 生物純，上海晶純?cè)噭┯邢薰? ; 乙腈、甲醇( 色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司) ．
FF210 型多肽固相合成管; Agilent 1200 高效液相色譜儀; LGJ-10 冷凍干燥機(jī); Bruke Esquire-3000型離子肼液相色譜質(zhì)譜儀; UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)．
以 Wang Ｒesin 作為固相載體，F(xiàn)moc 保護(hù)的氨基酸 為 原 料，采用固相合成法［16，17］，用 HOBT /HBTU / DIEA 混合試劑進(jìn)行縮合，用體積比為 95∶2. 5∶ 2. 5 的 TFA / TIS / H2O 混合試劑把目標(biāo)肽從王樹(shù)脂上切割下來(lái)，即得到以 KVLPVP 為先導(dǎo)肽的類 ACE 抑制肽 KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY．
ACE 抑制劑的活性檢測(cè)方法主要有體外檢測(cè)法和體內(nèi)檢測(cè)法［10，18］，體外檢測(cè)方法主要包括紫外分光光度法［10，19］、高效液相色譜法［10，20］等． 高效液相色譜法具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，所以得到廣泛的應(yīng)用［10，11］． 本文也采用高效液相色譜法測(cè)定類 ACE 抑制肽的體外抑制 ACE 活性．
在 ACE 的作用下，三肽 HHL 被催化分解為二肽 His-Leu 和馬尿酸，緩沖溶液作為空白對(duì)照，當(dāng)ACE 抑制劑加入以后，抑制了三肽 HHL 的分解，使馬尿酸的生成量減少． 通過(guò)三肽 HHL 在加入 ACE抑制劑前后生成的馬尿酸的峰面積的不同，得出ACE 抑制劑的活性大小，計(jì)算公式為:
IＲ = ( A－B) /A × 100% ( 1)
式( 1) 中 IＲ 為 ACE 抑制肽樣品對(duì) ACE 的抑制率( % ) ; A 為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積; B 為添加 ACE 抑制肽組中馬尿酸的峰面積
ACE 溶液配制: 用1mL 0. 1mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3，含 0. 3 mol /L NaCl) 溶解 0. 1 U 的 ACE，即得所需溶液． 配制 類 ACE 抑 制 肽 溶 液 ( 2. 0 mg /mL) : 用 1 mL0. 1mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3，含0. 3 mol /L NaCl ) 溶解2. 0mg 多肽純品，即可配制成一系列所需肽溶液． 配制 HHL 溶液( 5. 0 mmol /L) : 用10 mL 0. 1 mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3，含 0. 3mol /L NaCl ) 溶解 0. 02167 g HHL，即配制成所需溶液． 配制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液( 1. 0 mmol /L) : 首先稱 18. 0mg 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其溶解于適量雙蒸水，然后定容到 100 mL，即得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液． 配制反應(yīng)液: 移取 40 μL ACE 抑制肽溶液 2. 0 mg /mL 多肽溶液，置于 1. 5 mL 離心管中，加入 ACE 溶液 30 μL，37 ℃下保溫 5 min，再加入 HHL 溶液 80 μL，混合均勻后反應(yīng) 60 min( 在 37 ℃ 恒溫水浴槽中) ，最后加入 1. 0mol /L HCl 200 μL 中止反應(yīng)，即配制成所需反應(yīng)液．配制空白對(duì)照液: 將上述反應(yīng)液中的 ACE 活性抑制肽溶液用40 μL 的0. 1 mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3，含 0. 3 mol /L NaCl ) 代替即可．
色譜條件為流動(dòng)相: 乙腈/超純水 = 50 /50 ( 各含 0. 05 % TFA) ，流速: 0. 6 mL /min; 檢測(cè)波長(zhǎng): 228nm; 色譜柱: Agilent Eclipse XDB-C18( 4. 6 mm × 150mm，5 μm) ，柱溫 25 ℃ ; 進(jìn)樣量: 20 μL．
2 結(jié)果
通過(guò) Table 2 可以看出: 用芳香性的氨基酸殘基Phe、Tyr、His 和疏水性的 Val 替換先導(dǎo)肽 KVLPVP中 C-端的氨基酸殘基 Pro 后，相應(yīng)的 ACE 活性抑制率都升高了，其中抑制作用最大的是多肽 KVLPHY，其抑制率達(dá)到 100% ．
3 討論
大多數(shù) ACE 活性抑制肽目前都是采取天然分離提取的方法得到的［21，22］． 研究發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽的活性與氨基酸種類有關(guān)［7，9］． 由于天然提取的過(guò)程較為復(fù)雜，且提取的ACE活性抑制肽結(jié)構(gòu)比較單一，不便于對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究． 與天然提取方法不同，本文采用 Fmoc 固相合成法合成先導(dǎo)肽及其一系列類ACE抑制肽，經(jīng)ＲP-HPLC 分離純化并對(duì)其進(jìn)行 ESI-MS 表征．結(jié)果表明是所需要的目標(biāo)肽，這為活性研究提供了原料基礎(chǔ)． 然后，利用ＲP-HPLC 法直接測(cè)定類 ACE 抑制肽的體外抑制 ACE活性，對(duì)比加入類 ACE 抑制肽與空白對(duì)照液的液相色譜圖，可以看出多肽的加入對(duì)溶液中的ACE活性發(fā)生了不同程度的抑制作用． 這也表明，ACE 抑制肽的活性與其肽鏈C-端的氨基酸種類有著很大的關(guān)系． 通過(guò) Table 2 中不同的 6 肽的ACE活性抑制率的比較，表明當(dāng)先導(dǎo)肽 KVLPVP 的 C-端的氨基酸殘基Pro被芳香性的氨基酸殘基 Phe、Tyr、His 和疏水性 Val 替代后，類ACE抑制肽與ACE活性中心的結(jié)合作用力增強(qiáng)，其 ACE 活性抑制率提高且都高于先導(dǎo)肽，推測(cè)芳香性的氨基酸殘基 Tyr 因其側(cè)鏈上有具有親核性的吲哚基，可以增強(qiáng)多肽與 ACE 活性中心 Zn2 + 的作用力． 尤其是His位于C-端時(shí)，ACE抑制活性更強(qiáng)，推測(cè)是位于 ACE 活性中心的Zn2 +與His 殘基上的咪唑基與發(fā)生了配位作用，咪唑基在與 ACE 結(jié)合的過(guò)程中和緩激肽、血管緊張素 I 形成了競(jìng)爭(zhēng)性作用，使 ACE 的催化活性降低，從而提高其 ACE 抑制活性．
ACE 活性抑制肽降壓效果顯著，同時(shí)能減少傳統(tǒng)的降壓藥物所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，在治療和控制高血壓方面有著廣闊的的應(yīng)用前景． 基于以上不同的氨基酸殘基位于 C-端時(shí)對(duì)多肽的 ACE 抑制活性影響的研究，可以為降血壓藥物分子的進(jìn)一步設(shè)計(jì)和篩選提供了研究基礎(chǔ)． 但對(duì)于 His 殘基在肽鏈 C-端的具體位置以及它在肽中 C-末端的個(gè)數(shù)對(duì)肽鏈的ACE 抑制活性有什么影響，將在以后進(jìn)行進(jìn)一步的研究．
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