摘要:目的 評價基于噬菌體展示技術(shù)的羥基磷灰石結(jié)合肽的解吸附特征。方法采用成品羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)作為結(jié)合底物,通過X射線衍射(X-raydiffraction,XRD)對其進行物相鑒定,提取噬菌體 DNA 測序讀取展示肽 的 序 列,擴增制備目標序列YSLHWGE(YSL)的 單 克 隆 儲 液,以肽庫中隨機挑選的序列 VTDSKPK(VTD)為陰性對照;滴度測試測定投入回收比,免疫熒光法驗證目標序列的標靶親和力。參照標準淘選方案,在不同pH 值(7.5、6.5、5.5、4.5)緩沖洗脫液中分析目標序列的解吸附特征。結(jié)果 YSL和 VTD 的單克隆儲液擴增后滴度均達到1011pfu/10μL,符合后續(xù)實驗要求。測序結(jié)果得到目標序列和隨機序列分別為 YSL和 VTD。通過重復3次滴度測試計算投入回收比發(fā)現(xiàn),目標序列 YSL與 HAP的親和度較高,投入回收比為隨機肽 VTD投入回收比的17.5倍。這種結(jié)合親和力也通過免疫熒光實驗得以驗證,結(jié)果顯示 YSL組羥基磷灰石粉末被熒光點亮的面積比例和平均吸光度分別為(71.98±2.30)% 和 (0.10090±0.00544),均 顯 著 高 于 VTD 組 的 (49.95±2.28)% (P<0.01)和 (0.04637±0.00117)(P<0.01);發(fā)現(xiàn)在不同pH 值環(huán)境中,YSL解吸附釋放的噬菌體數(shù)量占原吸附總量的比例均高于隨機肽 VTD解吸附的比例(P<0.01)。結(jié)論 羥基磷灰石結(jié)合肽序列 YSLHWGE 對結(jié)合底物羥基磷灰石有較好的親和力且具有一定的隨環(huán)境pH 值變化的緩釋能力。
羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)是人類骨組織和牙齒等天然硬組織組成部分中最穩(wěn)定的磷酸鈣,其具有優(yōu)異的理化、生物性能,能與有機成分特異性結(jié)合[1]。而羥基磷灰石結(jié)合肽(hydroxyapatitebindingpeptides,HABPs)是 指 能 識 別 并 結(jié) 合 于HAP表面的生物活性肽。不少研究通過噬菌體展示技術(shù)鑒定 HABPs,并研究其體外結(jié)合親和力[2-3]。眾所周知,HAP主要由Ca2+ 、PO43- 組成,具有兩性離子的特征,靜電引力是導致 HAP 與蛋白質(zhì)之間發(fā)生吸附最主要的一種作用力,而蛋白質(zhì)分子往往帶有一定量的電荷,所以 pH 值是一項重要的生理環(huán)境參數(shù),對蛋白質(zhì)在 HAP 表面的吸附具有重要影響[4]。我們前期通過噬菌體展示技術(shù)淘選目標HABPs時獲得了一系列理想的 HAP結(jié)合序列,因體外合成成品 HABPs成本高、周期長,我們嘗試利用 M13噬菌體作為載體以噬菌體展示狀態(tài)進行實驗。本文報道了其中一條與 HAP特異性結(jié)合力較好且解 吸 附 特 征 對 外 界 環(huán) 境 pH 值 改 變 敏 感 的HABPs序列 YSLHWGE(YSL),利用這種特質(zhì)可結(jié)合抗菌藥物制備口腔植入物的表面涂層,其可隨著口腔唾液pH 值改變釋放抗菌藥物,起到控制牙菌斑的效果,具有一定的臨床應用前景。
1 材料與方法
羥基磷灰石生物陶瓷 HAP(四川大學生物材料工程研究中心);X 射線衍射儀(德國 BrukerAXS,D8-Focus);倒 置 熒 光 顯 微 鏡 (OLYMPUS,TH4-200,日本 TOKYO);搖床(天呈,T-100C);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏,DNP-9082);生物安全柜(蘇州智凈,BHC1300 ⅡA/B2型);數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華,HH-4);超聲波清洗機(新芝生物科技股份有限 公 司,SB-3200DTD );pH 計 (奧 豪 斯,STARTER3100)。
1.3 單克隆噬菌體儲液的制備及其展示肽序列的測定
利用噬菌體隨機肽庫對 HAP 進行篩選,經(jīng)多輪生物淘選和選擇、噬菌體擴增獲得多組具有不同底物親和力的多肽序列,其中 YSLHWGE(YSL)通過滴定測量回收后的噬菌體數(shù)量顯示對 HAP的結(jié)合親和力較高用于后續(xù)實驗。取目標序列(YSL)和隨機序列 VTDSKPK(VTD)甘油存樣各1μL,梯度稀釋到合適的倍數(shù),于IPTG/Xgal藍白篩選平板上培養(yǎng)。取單個藍色噬菌斑進行擴增,測試擴增液滴度并提取噬菌體 DNA 測序 (QIAprepSpin M13,NewEnglandBiolabs,USA)以確定產(chǎn)物序列的準確性。
將載有目標序列 YSL 或隨機序列 VTD 的單克隆噬菌體分別與 HAP 結(jié)合,通過滴定測量回收后的噬菌體數(shù)量,計算最初投入的噬菌體與回收液的噬菌體之間的比值以評價這2個結(jié)合肽序列對HAP的結(jié)合親和力。隨著噬菌體與底物結(jié)合親和力的提高,噬菌體的投入回收比值變大。
1.4.1 載有 YSL或 VTD的單克隆噬菌體與 HAP結(jié)合 配制pH=8.5的 TBST 緩沖液[含0.15(V/V)吐溫20]用于本實驗。依照常規(guī)洗脫方案,將底物 HAP依次使用去離子水、無水乙醇、去離子水超聲振蕩5min后高溫高壓滅菌40min,再置于90℃10%氫氧化鈉溶液中浸泡1h后使用大量去離子水清洗 HAP 至 中 性,加 入 10 mL TBST 緩 沖 液 中37℃溫 和 搖 床 過 夜,吸 取 過 夜 液 體 加 入 封 閉 液 1mL,37℃ 溫 和 搖 床 封 閉 1h,吸 取 封 閉 液 后 使 用TBST 緩沖液清洗 HAP 數(shù)次,分別于管中投入等量1.2×1011pfu的目標肽序列 YSL 及隨機肽序列VTD單克隆噬菌體,37℃溫和搖床進行孵育1h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體,然后用10mL新鮮配置的 TBST 緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體,加入非特異性緩沖液1mL37℃溫和搖床10min后加入150μLTris-HCl緩沖液。通過滴度測試測得目標肽序列 YSL 和隨機肽序列 VTD 用非特異性洗脫液洗脫的滴度結(jié)果,實驗重復3次。
1.4.2 單克隆噬菌體滴定測試 挑選目標序列和隨機序列的 LB/Tet培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)的宿主菌 ER2738的單克隆菌斑,于含10μL 四環(huán)素的10mLLB培養(yǎng)液中37℃劇烈振蕩6~8h培養(yǎng)至感染狀態(tài)備用。同期微波融化頂層瓊脂后分裝于新鮮滅菌的離心管中,48℃溫浴備用。將待滴度測試的噬菌體用 LB培養(yǎng)液做適當?shù)南♂尯蠹尤刖嚎焖倩靹虻谷胄迈r配置的 LB/IPTG/Xgal平板,室溫靜置3min后倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)37℃過夜培養(yǎng)。外膜蛋白上含有展示肽噬菌體能在 LB/IPTG/Xgal平板上形成藍色的噬菌斑。
計算大約含有100個噬菌體計數(shù)平板上藍色噬菌體的數(shù)量,按照下列公式計算噬菌體的滴度:噬菌體的滴度(pfu/10μL)=藍色噬菌斑數(shù)量×稀釋因子
通過免 疫 熒 光 技 術(shù) 再 次 驗 證 2 種 結(jié) 合 肽 與HAP的親和力。取等量 HAP 粉高壓滅菌消毒備用。用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothioc)標 記 的 抗 M13 單 克 隆 抗 體 (RLyanate,ph2,sc-53005FITC)對結(jié)合于 HAP 表面的噬菌體進行標定,對 M13噬菌體-HABPs的親和力進行半定量分析[5]。實驗組分別為投入等量的目標肽序列和隨機肽序列,以不加任何肽序列作為空白對照組,同時暴露于1mLPBST 緩沖液2h,溫和搖床。吸走目標序列組和隨機肽序列組未結(jié)合的噬菌體后,3組樣本同時加入200μLFITC 標記的抗噬菌體外殼蛋白pVⅢ的抗 M13單克隆抗體避光溫育1h,最后用新鮮配置的 PBST 緩沖液洗滌5次。依次將等量粉末懸浮液轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上,使用倒置熒光顯微鏡進行觀察,使用ImageJ軟件大致計算噬菌體顆粒表面被熒光覆蓋面積,將熒光圖像中噬菌體的覆蓋面積與白光下圖像中粉末的近似表面積進行比較[6],得到粉末被熒光點亮的面積比值(熒光視野下的噬菌體覆蓋面積/白光視野下的粉末面積)和其平均吸光度(A)值。
1.6 環(huán)境pH 值變化對 HABPs解吸附行為的影響
為了測定目標肽序列 YSL與隨機肽序列 VTD在不同pH 值 TBST 緩沖液浸泡洗脫1h后的解吸附性能,配制 pH 值為8.5、7.5、6.5、5.5和4.5的TBST 緩沖液(含0.15[V/V]吐溫20),依照常規(guī)洗脫方案,將底物 HAP 依次使用去離子水、無水乙醇、去離子 水 超 聲 振 蕩 5 min 后 高 溫 高 壓 滅 菌 40min,再置于90℃ 10%氫氧化鈉溶液中浸泡1h后使用大量去離子水清洗 HAP 至中性,加入10mLpH=8.5TBST 緩沖液中37℃溫和搖床過夜,吸取過夜液體加入封閉液1mL,37℃溫和搖床封閉1h,吸取封 閉 液 后 使 用 pH=8.5 TBST 緩 沖 液 清 洗HAP數(shù)次,分別于管中投入等量2×1010pfu的目標肽序列 YSL及隨機肽序列 VTD 單克隆噬菌體,37℃溫和搖床進行孵育1h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體,然后用10mL新鮮配置的pH=8.5TBST 緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體,再換新鮮配置的1150μLpH=7.5TBST 緩沖液浸泡1h后回收全部液體,再依次換用新鮮配置的1150μLpH 為6.5、5.5、4.5的 TBST 緩沖液重復上述操作回收浸泡液,最后再用1150μL 非特異性洗脫液洗脫并回收終末洗脫液。通過滴度測試測得目標肽序列 YSL和隨機肽序列 VTD 在這4組pH 值(7.5、6.5、5.5、4.5)TBST 緩沖液浸泡洗脫1h后回收液及終末非特異性洗脫液的滴度結(jié)果,實驗重復3次。
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計分析均使用 GraphPadPrism6.0軟件進行。計量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗的非配對雙側(cè)檢驗分析均值之間的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
從 HAP的 XRD 圖結(jié)果可得其與羥基磷灰石的(002)、(112)、(300)和(202)晶面的特征吸收峰匹配良好,表明粉末主要物相為羥基磷灰石。
YSL 和 VTD 噬 菌 體 投 入 回 收 比 結(jié) 果 顯 示,YSL噬菌體回收率為 VTD 噬菌體回收率的 17.5倍,且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0027),表明 YSL對底物 HAP具有較強結(jié)合力。
為分析 YSL和 VTD于不同pH 值緩沖液中在HAP表面的解吸附行為,我們對比兩者在新鮮配置的pH=7.5、6.5、5.5、4.5TBST 緩沖液中依次浸泡1h 后 各 回 收 液 的 滴 度 測 試 結(jié) 果 (圖 2),發(fā) 現(xiàn)YSL在各pH 值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量占原吸附總量的比例均明顯高于 VTD(均P<0.05),表明在相同pH 值緩沖液中 YSL較 VTD有明顯的解吸附行為。同時我們還注意到,YSL 在不同 pH 值緩沖液洗 脫 下 釋 放 的 噬 菌 體 數(shù) 量 也 有 差 異 (P<0.05),表明其對生理環(huán)境pH 值的改變反應敏感且明顯。在pH=6.5緩沖液洗脫下釋放的噬菌體數(shù)量最多,而后隨著緩沖液pH 值降低,回收液中的噬菌體數(shù)量逐漸減少。而 VTD 在不同 pH 值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量無明顯差別。
3 討論
HAP作為一種重要的生物醫(yī)學材料,在口腔醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應用,因其自身的復雜性使得其與多肽之間的作用機制一直都是該領(lǐng)域的研究難點。隨著以噬菌體隨機肽庫與展示技術(shù)為代表的生物文庫技術(shù)的出現(xiàn),這一高通量的篩選與平臺技術(shù)為研究 HAP等生物材料與多肽相互作用的機制提供了可能和便利條件[7]。大部分研究通過噬菌體展示技術(shù)獲得理想的肽序列之后往往會通過體外合成成品 HABPs進行后續(xù)的實驗,但人工合成 HABPs往往存在成本高、周期長的問題,而噬菌體展示狀態(tài)下的肽序列因噬菌體自身可增殖的生物特征可通過擴增的方法不斷重復獲得,具有成本低且周期短的優(yōu)勢。本研究直接使用通過噬菌體展示技術(shù)分離得到的一條對 HAP表面有較強親和力的新七肽序列YSLHWGE(即 HABPs),通過噬菌體滴度測試和免疫熒光實驗鑒定出該序列較隨機肽序列與 HAP底物有更強的結(jié)合力。再利用不同pH 值的 TBST緩沖液(pH=7.5、6.5、5.5、4.5)作為洗脫液依次浸泡1h,發(fā)現(xiàn)目標序列 YSL 較隨機肽序列 VTD 更容易受環(huán)境pH 值變化發(fā)生解吸附行為,具有一定的緩釋能力�；谶@一系列結(jié)果我們嘗試探討該結(jié)合肽序列有較高親和力且具有敏感解吸附特征的原因,以期為深入理解蛋白在 HAP 表面的吸附行為提供參考。
HAP的表面很復雜,目前我們得知 HAP等電點在pH=7左右,整體上偏中性,同時表面帶有電荷[8]。而蛋白 質(zhì) 的 HAP 界 面 吸 附 是 一 個 十 分 普遍、非常復雜而又極其重要的現(xiàn)象,受材料和蛋白質(zhì)的自身性質(zhì)以及溶液環(huán)境等內(nèi)外因素綜合影響,其主要驅(qū)動力包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力等。除了蛋白質(zhì)多肽鏈段上的自由氨基和羧基基團被認為是影響蛋白質(zhì)界面吸附的主要因素外,蛋白質(zhì)多肽鏈段的氨基酸組分和序列也被認為對蛋白質(zhì)的界面吸附有主導作用[9]。同時有研究表明,吸附體系中 pH 值的改變能夠調(diào)節(jié) HAP 的表面電荷量,進而改變 HAP 與蛋白質(zhì)分子之間靜電作用的類型和強度[10]。
HAP表面有2種不同類型的結(jié)合位點,分別為帶正電的 C位點(富含鈣離子)和帶負電的 P 位點(富含磷酸根離子),被認為是蛋白質(zhì)在 HAP 表面的結(jié)合位點并提供蛋白質(zhì)吸附的主要驅(qū)動力;其中蛋白質(zhì)的羧基基團和氨基基團分別結(jié)合帶正電荷的C位點和帶負電荷的 P位點,C 位點對負電荷的親和力比 P位點對正電荷的親和力更強。除此以外,酸性氨基酸基團能夠強烈地結(jié)合 HAP表面的鈣離子,這也是大多數(shù)富含 γ-羧基化谷氨酸、聚谷氨酸以及磷酸化氨基酸等酸性氨基酸基團的非膠原類蛋白質(zhì)或多肽可參與礦化過程的原因[10]。同時,除靜電力外,疏水相互作用是誘導蛋白質(zhì)表面親和力增加的另一個重要途徑。一般來說,疏水表面對蛋白質(zhì)的吸附作用比中性荷電的親水表面強,因為蛋白質(zhì)的兩親結(jié)構(gòu)中存在疏水的殘基結(jié)構(gòu),通過疏水作用使蛋白質(zhì)傾向于吸附在疏水表面[11]。因此具有疏水性的 HAP 本身對蛋 白 質(zhì) 就 有 一 定 的 吸 附 能力。而經(jīng)研究鑒定出來的目標肽序列 YSLHWGE與隨機序列 VTD相比較含有酸性氨基酸 Glu(谷氨酸)且位于序列末端,意味著序列末端有2個羧基能與 HAP中 C位點的 Ca2+ 多一個相結(jié)合的位點,同時目標肽序列 YSL 其親水性平均系數(shù)(GRAVY)大于隨機組 VTD,意味著目標肽序列 YSL 親水性小于隨 機 組 VTD,與 HAP 的 疏 水 作 用 更 強。此外,有報道表明,較大的蛋白質(zhì)有更多的結(jié)合位點與底物表面相互作用[11]。因此,較大的分子有可能被更多地吸附在表面上。所以從分子量對比,YSL 可能比 VTD有更多的結(jié)合位點,以上這些都有可能是 YSL較 VTD對 HAP親和力更強的原因。
生理環(huán) 境 是 影 響 蛋 白 質(zhì) 吸 附 的 重 要 因 素,而pH 值是影響生理環(huán)境中電學性能的重要參數(shù)。研究表明,pH 值的降低會增加酸性蛋白的吸附。之前很多研究表明在不同 pH 值環(huán)境下,HAP 表面Zeta電位均為負電位[12],同時有報道表明,HAP顆粒對 BSA 的吸附能力隨 pH 值增大而減弱[10]。原因是隨著體系pH 值增大,溶液中 OH- 濃度增大,HAP表面吸附 OH- 逐漸增多;而 BSA 蛋白分子等電點為4.7,在 pH>pI時帶負電荷,HAP 與 BSA之間存在靜電斥力,使 BSA 分子難以擴散到 HAP微粒表面發(fā)生吸附,導致 BSA 在 HAP表面的吸附量逐漸減小。我們研究的 YSL 與 BSA 情況相似,等電點為5.14,所以當用pH 大于pI的 TBST 浸泡1h后,YSL因緩沖液中 OH- 濃度不同程度的增加從而帶有不等量的負電荷,與 HAP 存在靜電斥力而發(fā)生解吸附行為,導致釋放在浸泡回收液中噬菌體數(shù)目增多。當用pH 值(4.5)小于pI的 TBST 緩沖液浸泡1h時,YSL帶有少量正電荷,與 HAP之間發(fā)生靜電引力,因此對 YSL 的吸附量逐漸增加,此時釋放到溶液中的噬菌體數(shù)量明顯減少。此外,HAP的溶解度也是影響溶液性能的重要參數(shù)。研究表明[13],HAP在緩沖液 pH 值降低過程中會伴HAP的溶解,隨著酸性加強,H+ 增多,HAP 的溶解量隨 之 加 大,大 量 的 羥 基 發(fā) 生 脫 離 并 停 留 在HAP附近,加上 Ca2+ 的遠游破壞電中性以及磷酸根基團的脫離,使得 HAP表面 Zeta電位仍呈負電性,隨著酸性再增加,脫離的羥基、磷酸基團和 Ca2+數(shù)量進一步增加,則Zeta負電位絕對值又將有所增大。所以這兩方面機制使得吸附于 HAP表面帶有目標肽序列 YSL 的噬菌體數(shù)量隨著 pH 值降低而減少。
因此,我們可以利用這種解吸附特征隨生理環(huán)境pH 值改變的 HABPs序列與某些抗菌物質(zhì)相結(jié)合用作口腔植入物的表面涂層,在口腔唾液因進食等生理活動變化導致pH 值改變時可釋放該抗菌復合物,起到控制菌斑的效果,這將具有一定的臨床應用前景。
免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權(quán)歸原作者及原雜志所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。文章標注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻，可閱讀原雜志
