摘要 本文以三代聚谷氨酸肽類樹(shù)枝狀分子(G3-Glu)為大分子引發(fā)劑, 引發(fā) N-羧基-L-苯丙氨酸-環(huán)內(nèi)酸酐(NCA-Phe)的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng), 制備聚谷氨酸樹(shù)枝狀大分子-聚苯丙氨酸嵌段共聚物. 嵌段共聚物通過(guò)自組裝形成以聚苯丙氨酸鏈段為核, 聚谷氨酸樹(shù)枝狀大分子為殼的膠束. 將抗腫瘤藥物阿霉素負(fù)載到高分子膠束中, 研究其藥物釋放性能及體外抗腫瘤效果. 結(jié)果表明, 共聚物膠束具有良好的生物相容性. 載藥膠束具有藥物緩釋效果, 藥物持續(xù)釋放時(shí)間可達(dá) 60 h. 載藥膠束的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)肝癌細(xì)胞 HepG2 具有很好的殺滅效果, 共培養(yǎng) 48 h 后對(duì)癌細(xì)胞的殺死率可高達(dá) 75%.
自組裝在新型功能材料的構(gòu)筑中已顯示出巨大的潛力[1, 2]. 合成多肽分子通過(guò)自組裝形成的材料在其結(jié)構(gòu)、形貌和性能上具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[3]. 合成多肽自組裝材料不僅可以形成球形、棒狀、線性及囊泡等不同的結(jié)構(gòu)和形態(tài)[4~7], 并且還具有各種特異性的物理、化學(xué)或生物學(xué)功能[4, 8, 9]. 以天然氨基酸為原料的合成多肽, 由于其良好的生物相容性和生物降解性, 已成為一類重要的生物醫(yī)用材料, 在疾病診治和組織修復(fù)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用. 利用肽類大分子自組裝構(gòu)建的藥物/基因傳輸載體材料可被賦予優(yōu)越的智能環(huán)境響應(yīng)和靶向功能性[10~12]; 多肽自組裝水凝膠在組織修復(fù)中顯示出很好的組織再生誘導(dǎo)效果[13~15].
肽類樹(shù)枝狀大分子除了具有普通樹(shù)枝狀大分子特征如規(guī)整性、高度支化、表面高密度官能團(tuán)、納米尺度、分子量單一等外, 還具有類似蛋白的結(jié)構(gòu), 以及大量外圍官能團(tuán)賦予的良好水溶性[16]. 基于肽類樹(shù)枝狀大分子雙親性嵌段共聚物自組裝構(gòu)建的膠束與傳統(tǒng)的線形雙親性嵌段共聚物自組裝形成的高分子膠束相比, 不僅具有更高的穩(wěn)定性, 其外圍具有更多可供修飾的官能團(tuán), 有利于進(jìn)一步進(jìn)行智能、靶向等功能的修飾. 例如, 樹(shù)枝狀大分子嵌段聚合物在相行為上與線形嵌段聚合物就存在明顯差異[17]; 通過(guò)外圍的樹(shù)枝狀分子以改善自組裝體的溶解性能, 從而改變了自組裝體的物理、化學(xué)特性[18]; 利 用 dendron-like/linear/dendron-like 嵌段聚合可 構(gòu)筑形態(tài)均一的自組裝載體, 并用作藥物緩釋的載體[19].
2 實(shí)驗(yàn)部分
叔丁氧羰基-谷氨酸(Boc-Glu-COOH), 谷氨酸雙芐酯(H-Glu(OBzl)-OBzl), 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC), 1-羥基苯并三唑(HOBT), N,N-二異丙基乙胺(DIEA), 三氟乙酸(TFA), 芐氧羰基-苯丙氨酸(N-Cbz-Phe), 四氫呋喃, 二氯甲烷, 正己烷, 乙酸乙酯, 乙醇, NaHCO3, NaHSO4, NaCl, 無(wú)水 MgSO4, DMEM(高糖)細(xì)胞培養(yǎng)基等.
核磁共振波譜儀(NMR, Bruker AV-400); 傅立葉紅外光譜儀(FTIR, Necolet PE Spectrometer); 時(shí)間飛行質(zhì)譜(TOF, Bruker Autoflex III); 超聲波清洗器(KQ-300DE); 掃描電子顯微鏡(SEM, JSM-5900LV); 透射電子顯微鏡(TEM, JEM-100CX); 動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS); 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM, Leica TCP SP5).
谷氨酸二代(G2-Glu)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下, 用 TFA 脫除 Boc 保護(hù), 減壓除去 TFA, 得到產(chǎn)物 2. 產(chǎn)物 2 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到 Boc-Glu-COOH 中, 通過(guò) HOBT/ EDC/DIEA 催化縮合 , 常溫反應(yīng) 24 h. 用飽和NaHCO3 溶液、NaHSO4 溶液、飽和 NaCl 溶液反復(fù)洗滌數(shù)次. 利用硅膠柱過(guò)柱分離, 得到聚谷氨酸三代樹(shù)枝狀大分子(G3-Glu)(產(chǎn)物 3, 圖 1).
聚谷氨酸三代樹(shù)枝狀大分子(G3-Glu)在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下, 用 TFA 脫除 Boc 保護(hù), 減壓除去 TFA 得到產(chǎn)物 4. 將產(chǎn)物 4 在 NaOH 醇溶液中調(diào)節(jié) pH 值, 充分?jǐn)嚢? 旋干溶劑, 將固體溶于 CH2Cl2, 濾除固體, 將濾液旋干待用.
2.4.2 N-羧基-L-苯丙氨酸-環(huán)內(nèi)酸酐(NCA-Phe)的合成
稱取無(wú)水干燥的芐氧羰基-苯丙氨酸(Cbz-Phe), 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶于 20 mL 無(wú)水 THF 中, 升溫至 40 ℃; 將 SOCl2 滴入上述反應(yīng)體系, 反應(yīng) 4 h. 把反應(yīng)液加入過(guò)量無(wú)水正己烷中, 低溫靜置 12 h. 將得到的白色沉淀用無(wú)水乙酸乙酯/無(wú)水正己烷反復(fù)重結(jié)晶 3 次, 真空干燥得到白色針狀晶體.
按照摩爾比 1:10 的比例, 準(zhǔn)確稱取干燥處理后的大分子引發(fā)劑和 L-Phe-NCA 投入反應(yīng)瓶中, 抽真空后通入氮?dú)獗Ｗo(hù). 加入 DCM/DMF 混合溶劑, 室溫反應(yīng) 48 h, 得到產(chǎn)物 5. 在壓力約為 0.8 MPa 的高壓釜中, 以 Pd/C 為催化劑, 加入 H2, 室溫反應(yīng) 24 h, 脫去 OBzl. 過(guò)濾分離, 減壓除去溶劑和芐醇.
以芘為熒光探針測(cè)定自組裝膠束的臨界膠束濃度, 在固定的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下, 測(cè)定 I338 和 I335 處的熒光吸收值.
將嵌段共聚物溶于甲醇中, 在超聲條件下緩慢滴加到去離子水中, 靜置, 減壓除去甲醇. 按照比例將嵌段共聚物和阿霉素配成甲醇溶液, 在超聲條件下緩慢滴加到去離子水中, 在 4 ℃下透析 24 h, 冷凍干燥后備用.
準(zhǔn)確稱取一定量的載藥膠束, 溶于良溶劑中, 測(cè)定該溶液在波長(zhǎng) 485 nm 處的熒光吸收值, 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線計(jì)算載藥膠束中阿霉素的量.
精確稱取載藥膠束溶于 PBS 緩沖溶液中(pH 7.4), 配成 1 mg/mL 溶液. 設(shè)置 3 組樣, 在截留分子量為2000 Da 的透析袋中加入 1 mL 的緩沖溶液, 置于 25 mL 37 ℃的 PBS 中. 根據(jù)不同時(shí)間, 取出 1 mL 釋放介質(zhì), 同時(shí)補(bǔ)充 1 mL PBS 溶液. 測(cè)定介質(zhì)在波長(zhǎng) 485 nm 處的熒光吸收值, 繪制載阿霉素膠束的體外釋放曲線. 并測(cè)定對(duì)照組鹽酸阿霉和阿霉素的釋放曲線.
將 3T3 細(xì)胞接種于 3 塊 96 細(xì)胞培養(yǎng)孔板(T = 12 h, 1×104個(gè)/孔; t = 24 h, 5×103個(gè)/孔; t = 48 h, 3×103個(gè)/孔). 培養(yǎng) 24 h 后, 加入空白膠束, 濃度分別為 150, 100 和 50 µg/mL, 每個(gè)濃度設(shè)置 3 個(gè)平行樣, 并設(shè)置對(duì)照組. 3T3 細(xì)胞在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng) 12、24 和 48 h后, 用 PBS 緩沖溶液(pH 7.4)沖洗后并更換新鮮的培養(yǎng)基, 加入 CCK-8, 繼續(xù)培養(yǎng) 2 h, 在酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光值, 計(jì)算細(xì)胞存活率.
取 HepG2 細(xì)胞, 加培養(yǎng)液稀釋, 按 1 × 104 個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于玻璃培養(yǎng)皿中, 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后, 加入載藥膠束, 阿霉素的濃度為 10 µg/mL. 細(xì)胞培養(yǎng)2 h后, 用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察體外細(xì)胞攝取載藥膠束的情況. 激發(fā)光波長(zhǎng)為 485 nm, 散射光波長(zhǎng)為 595 nm.
取 HepG2 細(xì)胞, 按取點(diǎn)測(cè)定時(shí)間在每孔加培養(yǎng)液稀釋 t = 12 h, 1 × 104 個(gè)/孔; t = 24 h, 5 × 103 個(gè)/孔; t = 48 h, 3 × 103 個(gè)/孔. 加入載藥膠束, 控制阿霉素的終濃度分別為 15, 10 和 5 µg/mL. 分別培養(yǎng) 12、24 和48 h 后, 用 PBS 緩沖溶液清洗 3 次, 置換入新鮮的培養(yǎng)液, 加入 CCK-8 并輕微震蕩, 繼續(xù)培養(yǎng) 2 h, 在酶標(biāo)儀 490 nm 測(cè)定吸光度, 計(jì)算細(xì)胞存活率.
3 結(jié)果與討論
兩親性不對(duì)稱拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的肽類樹(shù)枝狀嵌段聚合物, 通過(guò)以三代谷氨酸扇形分子 G3(Glu)-NH2 為大分子引發(fā) NCA-Phe 的開(kāi)環(huán)聚合合成, 如圖 1 所示. 利用純化過(guò)的 G3(Glu)-NH2 在嚴(yán)格無(wú)水的條件下引發(fā)NCA 的開(kāi)環(huán)聚合. 利用 1H NMR 對(duì)合成過(guò)程中的重要產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征.
膠束細(xì)胞毒性的結(jié)果如圖 8 所示. 通過(guò) 3 個(gè)濃度梯度(50, 100 和 150 μg/mL)及 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12、24 和48 h)的檢測(cè)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn), 小鼠 3T3 成纖維細(xì)胞的存活率均未出現(xiàn)明顯降低, 說(shuō)明膠束對(duì)3T3細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性, 具有很好的生物相容性.
阿霉素只有進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核才能發(fā)揮藥效. 為了研究載藥膠束是否具有抗腫瘤效果和細(xì)胞內(nèi)緩釋作用, 通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察了肝癌細(xì)胞 HepG2 對(duì)載藥膠束的吞噬.
圖 12 為 HepG2 腫瘤細(xì)胞在與鹽酸阿霉素(a)、阿霉素(b)、載藥膠束(c)及空白對(duì)照組(d)共培養(yǎng) 48h 時(shí)的光鏡照片. 圖 12(a)顯示鹽酸阿霉素導(dǎo)致大量的腫瘤細(xì)胞死亡, 懸浮在培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)基底部基本沒(méi)有附著生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞; 圖 12(b)中有少量死亡的腫瘤細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中, 但底部還有大量的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng), 呈現(xiàn)良好的細(xì)胞形態(tài); 圖 12(c)中顯示了載有阿霉素膠束的抗腫瘤效果明顯好于阿霉素,有大量懸浮的死亡腫瘤細(xì)胞和少量貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞.
以聚谷氨酸樹(shù)枝狀大分子-聚苯丙氨酸嵌段共聚物為自組裝單元構(gòu)建的膠束, 具有良好的生物相容性. 與典型的線形高分子自組裝載藥膠束相比, 由不對(duì)稱拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的嵌段聚合形成自組裝膠束, 除了親疏水作用外, 同時(shí)還協(xié)同了共軛作用、空間效應(yīng)等作用, 顯示出良好的穩(wěn)定性、緩釋及體外抗腫瘤效果. 自組裝膠束外圍大量的化學(xué)活性官能也為進(jìn)一步功能化修飾提供了可能性.
4 結(jié)論
本文通過(guò)大分子引發(fā)劑合成了聚谷氨酸樹(shù)枝狀大分子-聚苯丙氨酸嵌段共聚物, 共聚物自組裝成為高分子膠束. 共聚物膠束具有良好的生物相容性. 載藥膠束具有藥物緩釋效果, 藥物持續(xù)釋放時(shí)間可達(dá)60 h. 載藥膠束的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 具有很好的殺滅效果, 共培養(yǎng) 48 h 后對(duì)癌細(xì)胞的殺死率可高達(dá) 75%. 通過(guò)對(duì)這類肽類樹(shù)枝狀大分子膠束的功能化, 可望賦予其智能、靶向等功能, 作為新型的藥物釋放載體.
免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者及原雜志所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。文章標(biāo)注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻(xiàn)，可閱讀原雜志
