摘要：目的 觀察新型自組裝肽TRSAWmx水凝膠對在體外小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1細胞粘附效果、增殖能力及成骨分化能力的影響。 方法 通過原子力顯微鏡觀察新型水凝膠的自組裝性能；以倒置顯微鏡對貼壁細胞計數(shù)，比較不同材料細胞的粘附；以CCK-8檢測和評價不同材料上細胞的增殖；通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在材料表面的生長；茜素紅-S染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成；檢測材料上培養(yǎng)的細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性以及細胞ALP、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表達。結(jié)果 TRSAWmx能自組裝成納米纖維結(jié)構(gòu)；在接種30、60、90 min時，TRSAWmx組細胞粘附數(shù)明顯高于空白組(P<0.05)；3、5、7 d 時TRSAWmx組細胞有著更佳的增殖活力(P<0.05)；在成骨誘導培養(yǎng)3、7、14 d時，TRSAWmx組ALP活性明顯高于RADA16-Ⅰ組(P<0.05)；培養(yǎng)14 d后，TRSAWmx組茜素紅-S染色可見鈣結(jié)節(jié)形成多，成骨相關基因ALP、OCN、VEGF表達水平更高(P<0.05)。 結(jié)論 新型自組裝多肽納米水凝膠TRSAWmx在體外能有效提高MC3T3-E1細胞粘附、增殖和成骨分化能力。
目前臨床上應用的合成骨替代材料，如羥基磷灰石、陶瓷材料等，存在不利于細胞粘附以及生物相容性差等缺點[1]。為了解決上述的問題，需要新的材料來對其表面進行修飾或是替換，水凝膠材料是很好的選擇。RADA16-Ⅰ由16肽氨基酸組成，是自組裝多肽水凝膠的代表，其能在水相離子或生理鹽溶液觸發(fā)下，分子水平組裝成β折疊，并往復形成互補離子鍵，最終組裝成納米纖維，其纖維直徑10～20 nm，孔徑5～200 nm，含水量大于99%[2, 3, 4]。研究表明，水凝膠結(jié)構(gòu)能夠模擬細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及其微環(huán)境，為細胞提供良好的體外生長環(huán)境，有利于細胞的粘附、增殖和分化[5]；但是，目前作為支架材料的水凝膠缺乏促進成骨分化的能力。Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是甲狀旁腺類激素相關蛋白(PTHrP)C末端結(jié)構(gòu)域PTHrP(107～111)五肽片段，能夠介導PTH/PTHrP受體非相關性受體，在體外促進成骨細胞生長和分化[6, 7, 8]。此外，Osteostatin在骨缺損兔體內(nèi)能促進骨再生[9, 10]。本研究通過利用Osteostatin片段對傳統(tǒng)RADA16-Ⅰ進行修飾，期望得到兼顧粘附和促成骨相關性能的自組裝多肽納米水凝膠材料。
1 材料與方法
MC3T3-E1 Subclone 14小鼠成骨細胞前體細胞(ATCC)，多肽RADA16-Ⅰ(AcN-RADARADARADA-RADA-CONH2，相對分子質(zhì)量為1 671.76)、RADA16/TRSAW(相對分子質(zhì)量為2 387.54)和TRASW(相對分子質(zhì)量為619.58)，α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.04% EDTA (Gibco公司)，14 mm圓形蓋玻片(NEST公司)，CCK-8檢測試劑盒(同仁公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(南京建成)，茜素紅-S(Sigma公司)，羅丹明鬼筆環(huán)肽，DAPI(碧云天公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 通過肽固相合成法[11]將Osteostatin與 RADA16-Ⅰ C末端相連，合成自組裝多肽RADA16-TRSAW (AcN-RADARADARADARADA-GG-TRSAW-CONH2) 肽粉。自組裝多肽母液的制備向肽粉(每10 毫克分裝)內(nèi)加入1 mL無菌超純水，移液槍吹打混勻后，超聲波清洗機室溫超聲處理30 min去除溶液粘性，得到1%(質(zhì)量體積分數(shù))的多肽母液。取RADA16-Ⅰ和RADA16-TRSAW母液等體積混合，得到1%(質(zhì)量體積分數(shù))TRSAWmx母液。
用超純水分別稀釋TRSAW、RADA16-Ⅰ、RADA16-TRSAW和TRSAWmx母液，得到0.5‰(質(zhì)量體積分數(shù))的稀釋液，超聲波清洗機室溫超聲處理30 min。取不同多肽稀釋液各5 μL分別滴加到清潔的圓形云母片上，靜置15 s后，用100 μL超純水沿液滴邊緣沖洗3次。30 ℃室溫靜置，待云母片自然干燥 后，AFM進行觀察。AFM參數(shù)設置為輕敲模式，掃描區(qū)域為2 μm×2 μm，掃描頻率是1.0 Hz；掃描探針(Model：Arrow UHFAuD)參數(shù)：彈性系數(shù)(k)為6(1.5～21.0)N/m，材質(zhì)Si，無涂層，尖端半徑為(10±2)nm。
分別將1%(質(zhì)量體積分數(shù))RADA16-Ⅰ和TRSAWmx母液與20%(質(zhì)量體積分數(shù))無菌蔗糖溶液按體積比1 ∶1混合，制成0.5%水凝膠工作液。取14 mm 圓形清潔蓋玻片置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，向每張蓋玻片上分別滴加100 μL工作液。沿每孔內(nèi)壁，緩慢加入含10%胎牛血清+1%雙抗+50 μg/mL抗敗血酸+ 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM成骨培養(yǎng)液，培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的孵箱中靜置1 h。MC3T3-E1細胞常規(guī)消化離心后，成骨培養(yǎng)液制成5×104個/mL的單細胞懸液，待凝膠固化成型后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔接種1 mL MC3T3-E1細胞懸液于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。
分別向24孔板中放入14 mm圓形蓋玻片，并滴加RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液并使其成膠。在空白蓋玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠、TRSAWmx水凝膠上滴加1 mL MC3T3-E1細胞懸液，分別在第10、30、60、90分鐘吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗1次，以除去未粘附的細胞，隨機選取視野對細胞進行計數(shù)。
1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察MC3T3-E1細胞在水凝膠表面的生長
細胞在水凝膠中培養(yǎng)3、7、14 d后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，0.2%Triton X-100室溫通透10 min，PBS清洗3次，加入5% BSA封閉1 h，隨后PBS清洗3次，加入配置好的羅丹明 -鬼筆環(huán)肽(5 U/mL) 工作液，室溫避光孵育30 min。用PBS清洗3次， 10 μg/mL的DAPI染液浸沒樣本，室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次，封片后，激光共聚焦熒光顯微鏡拍照。
細胞在水凝膠中培養(yǎng)3、7 d和14 d后，吸凈孔內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入1%Triton X-100(100 μL)反復吹打，顯微鏡觀察細胞破碎。嚴格按照堿性磷酸酶試劑盒說明在96孔板內(nèi)進行加樣，以酶聯(lián)免疫檢測儀在520 nm處測定D(520)，同時用BCA法測定蛋白濃度，并計算ALP的活力。
細胞在水凝膠中誘導培養(yǎng)14 d后，吸凈孔內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲 醛固定20 min后，PBS清洗3次，加入茜素紅-S染液室溫下染色10 min，PBS清洗殘留染液，隨機取視野拍照。
使用SPSS 14.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以x±s表示。
2 結(jié)果
3 討論
自組裝納米多肽水凝膠RADA16-Ⅰ能夠在水相離子或生理鹽溶液觸發(fā)下，形成含水量可超過99%的納米纖維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究證明，這種含水量高的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠模擬天然細胞外基質(zhì)及微環(huán)境[12]，為細胞提供三維的培養(yǎng)系統(tǒng)，對細胞的粘附、增殖、分化和相關生長因子的分泌有良好的促進作用[13, 14, 15, 16]。同時，其納米級的直徑10～20 nm及形成的微小孔徑 5～200 nm[2, 3, 4]可用于骨髓中干細胞的富集，以提高成骨活性[5]。
目前，大量研究表明，通過向RADA16-Ⅰ 肽的C末端連接功能短肽片段，能夠提高肽支架的相關生物組織特異性功能[3, 17, 18]。運用此種方法得到的新 型肽水凝膠能夠在形成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的同時，功能基團并未參與納米絲纖維的β折疊形成，而是作為側(cè)鏈突出于β折 疊之外，以此種方式發(fā)揮作用[14, 17, 18]。Pan等[19] 證明將BMP-2相關蛋白(P24) 修飾RADA16-Ⅰ 后能增強材料促BMSCs增殖、黏附和異位成骨的能力。Tao等[20]采用BMP-7相關功能序列SNV和KPS改裝RADA16-Ⅰ所合成的水凝膠材料是一種較好的髓核組織工程材料。在課題組前期研究中，我們已經(jīng)將在細胞粘附過程中起重要作用的DGEA序列同RADA16-Ⅰ多肽C末端相接，成功地構(gòu)建了自組裝多肽納米水凝膠支架材料DGEAmx[21]，提高了細胞的粘附性。在成骨修復過程中，研究者更關注如何誘導細胞成骨分化。
PTHrP基因編碼翻譯后加工主要產(chǎn)生3個具有很高活性的氨基酸末端PTHrP(1~36)PTHrP(38~94)以及PTHrP(107~139)[22]，能通過調(diào)節(jié)成骨細胞作用，在新骨形成和骨塑形過程中起到重要調(diào)節(jié)作用[23]。Osteostatin是PTHrP C末端結(jié)構(gòu)域PTHrP(107~111)五肽片段，能夠介導PTH/PTHrP受體非相關性受體，在體外促進成骨細胞生長和分化[24]。
本研究中，我們通過肽固相合成法在RADA16-Ⅰ的C端與PTHrP(107~111)五肽連接得到RADA16-TRSAW，并將其與RADA16-Ⅰ等體積混合得到TRSAWmx混合液，創(chuàng)新設計并構(gòu)建出兼顧粘附和促成骨相關性能的自組裝多肽納米水凝膠TRSAWmx。TRSAWmx水凝膠纖維直徑大于RADA16-Ⅰ水凝膠纖維(P<0.05)，但其仍具有納米級的直徑，能自組裝成長的納米纖維。TRSAWmx的細胞粘附能力較RADA16-Ⅰ無明顯差異，說明功能片段的加入不影響細胞在水凝膠上的粘附。細胞在TRSAWmx水凝膠上培養(yǎng)有著更佳的生長活力和骨誘導分化性能。以上實驗結(jié)果表明，自組裝水凝膠TRSAWmx促進MC3T3-E1細胞粘附、增殖和分化效果優(yōu)于單純的自組裝水凝膠RADA16-Ⅰ。
本研究初步證明，通過將RADA16-Ⅰ的C末端與PTHrP(107~111)氨基酸活性末端相接，構(gòu)建的新型自組裝納米水凝膠TRSAWmx在體外能夠兼顧細胞粘附和促成骨相關性能。這為后期可與脫鈣骨基質(zhì)、羥基磷灰石等相復合，進一步研究復合后材料的體內(nèi)相關生物學性，以及進一步運用于臨床個體化治療[24]奠定了良好理論基礎。
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