摘要 備受關(guān)注的腫瘤免疫治療其核心在于能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的抗原表位。該文以納米金顆粒作為篩選載體, 偶聯(lián)腫瘤抗原, 體外與人外周血單個核細(xì)胞相互作用, 以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法精確檢測免疫原性來篩選具有免疫原性的抗原多肽。光譜分析證明了納米金顆粒與合成多肽的偶聯(lián),熒光顯微鏡和電子顯微鏡直接證明細(xì)胞攝取偶聯(lián)復(fù)合物, 通過檢測T細(xì)胞γ-干擾素分泌水平證實(shí)了不同多肽的免疫原性。該文優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)參數(shù)(如pH、緩沖液體系以及孵育時間等), 顯著地減少了從多肽合成到免疫原性分析的實(shí)驗(yàn)過程所需的時間, 同時, 實(shí)驗(yàn)規(guī)模也成功地縮小到了96孔板, 達(dá)到簡單快速篩選免疫原性多肽的最終目的。
腫瘤的免疫療法利用T細(xì)胞對腫瘤特異性抗原的應(yīng)答反應(yīng)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對腫瘤造成殺傷作用, 避免藥物帶來的常見不良反應(yīng), 改善患者的生活品質(zhì)[1], 給腫瘤治療帶來了希望, 成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。免疫治療藥物, 尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制抗體[如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和 程 序 性死亡受體-1[2](programmed death receptor-1, PD-1)已在某些腫瘤中具有顯著療效。由于其高度特異性、顯著的有效性以及相對可控的副作用[3], 腫瘤免疫治療已成為越來越多腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方式[4], 對延長存活率有很大的幫助[5]。腫瘤的免疫治療包括多細(xì)胞免疫療法[6]和特異性抗腫瘤療法[7]。殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 是T細(xì)胞的其中一小類, 在腫瘤細(xì)胞識別和殺傷過程中起重要作用[8]�？傮w而言, 特異性免疫治療的基礎(chǔ)在于腫瘤特異性抗原的識別與處理[9], 無論采用腫瘤抗原疫苗和嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)方法,其核心都是要支持免疫系統(tǒng)正確識別腫瘤細(xì)胞[10]。然而, 很多情況下, 能引起免疫的抗原性質(zhì)是不明確的[11]�？乖禺愋訲細(xì)胞群在體外培養(yǎng)后也可能發(fā)生顯著改變, 比如刺激后體外優(yōu)勢克隆型及次優(yōu)勢克隆型的減少[12]。因此, 確立一定數(shù)量的抗原表位(epitope)不僅是免疫治療的基礎(chǔ), 也是持續(xù)療效的保障。
雖然T細(xì)胞抗原在臨床藥物應(yīng)用和研究中非常有應(yīng)用前景, 但是一方面由于效應(yīng)T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜性, 另一方面是由于龐大的T細(xì)胞群和大量潛在T細(xì)胞表位的存在[13], 使得其發(fā)現(xiàn)和鑒定速度過慢, 導(dǎo)致無法滿足高效篩選的要求。在免疫干預(yù)實(shí)驗(yàn)中, 免疫原性的綜合研究或者T細(xì)胞表位的整體性研究非常困難, 因此通常利用混合多肽來監(jiān)測T細(xì)胞的應(yīng)答[14]。相比過程復(fù)雜的表達(dá)克隆[14-18]和高度儀器依賴的肽洗脫[19-22]方法,肽疫苗(peptide vaccine)能更大程度地縮短篩選潛在表位所需要的時間[23]及對大型儀器的依賴性, 提高效率及拓寬應(yīng)用廣度。此外, 新興的基于分子模型計算的T細(xì)胞表位預(yù)測已取得部分成果但仍需改進(jìn)[24]。多肽結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體分子(majorhistocompatibility complex, MHC)的計算機(jī)預(yù)測在基于表位的疫苗發(fā)展中具有重要的實(shí)際意義, 然而該預(yù)測方法基于具免疫原性的多肽, 現(xiàn)有的大部分MHC等位基因?qū)?yīng)的抗原表位之間存在明顯的差異[25]。因此, 可能需要較長時期的算法改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
在發(fā)現(xiàn)抗原表位的實(shí)驗(yàn)方法中, 除了前述較為直接的肽洗脫法, 其他方法均采用間接的T細(xì)胞應(yīng)答觀察, 如熒光信號[26]、四聚體流式檢測[27]及細(xì)胞因子分泌檢測[28]等, 抗原信息導(dǎo)入也同樣有著各類方法[13]。納米金顆粒(gold nanoparticle, AuNP)能有效傳遞免疫原性物質(zhì)并且具有低生物毒性[29-30], 是一種潛在的腫瘤免疫治療的優(yōu)良載體。目前, TNF-α(tumor necrosis factor-α)偶聯(lián)的納米金顆粒(CYT-6091)在I期臨床實(shí)驗(yàn)階段中發(fā)現(xiàn), 其可以通過肝臟緩慢清除[31]。納米金顆粒被細(xì)胞攝取與清除的機(jī)制取決于尺寸,形狀和表面修飾特性。納米金顆粒大小在13 nm到100 nm之間, 能被淋巴引流及細(xì)胞攝取, 其中, 直徑在50 nm左右的顆粒顯示了最高的細(xì)胞攝取率, 小于15 nm的顆粒能通過核孔[32-34]。通過核定位信號肽(nuclear localization signal peptides, NLSs)、 細(xì) 胞 穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)或者受體靶向型多肽的作用, 納米金顆�？梢赃M(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞核。在實(shí)際應(yīng)用中還發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過紫杉醇修飾的納米金顆粒在腫瘤治療中顯示對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒性[35]。這種穩(wěn)定安全的特性也使納米金顆粒能夠成為表位篩選的理想載體。以納米金顆粒為載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法與傳統(tǒng)的電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[36-37]、腺病毒轉(zhuǎn)染法等相比, 在安全和穩(wěn)定方面均擁有更大的優(yōu)勢。
1 材料與方法
室溫下, 硫醇可以與納米金顆粒在溶液環(huán)境中形成共價鍵[27]。首先, 將20 μmol/L的PEG(methoxy PEGThiol, 5 kDa)和20 μmol/L的多肽在離心管中等體積混合, 形成多肽與含巰基聚乙二醇(PEG)摩爾比為1׃1。然后, 將混合物加入到15 nm檸檬酸鹽包被的納米金(1.16 nmol/L)膠體中, 形成巰基與納米金顆粒的摩爾比(以下簡稱為硫金摩爾比)為2 500׃1。室溫攪拌金/PEG/多肽混合物1 h, 使硫醇與檸檬酸在納米金顆粒中完全置換。然后, 12 000 r/min離心30 min富集偶聯(lián)復(fù)合物。棄上清, 并用合適體積的緩沖液重懸偶聯(lián)復(fù)合物。為了提高偶聯(lián)效率, 需調(diào)整實(shí)驗(yàn)過程中的pH及緩沖液, 偶聯(lián)結(jié)果通過納米金顆粒與偶聯(lián)復(fù)合物在380~610 nm波長之間吸收峰檢測得到。
用血細(xì)胞分離機(jī) (Fresenius Kabi公司 )分離收集病人外周血單個核細(xì)胞(pe riphe r a l bloodmononuclear cell, PBMC)。每個病人收集約2×109個PBMC, 用AIM-V培養(yǎng)基(Gibco公司)洗2遍后, 稀釋至4×106/mL。然后, 將PBMC按每孔約1×106/mL接種到96孔板中培養(yǎng)2 h。貼壁細(xì)胞加入樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)培 養(yǎng) 基(含100 ng/mL GM-CSF、1 000 U/mL IL-4和50 ng/mL FLT3-L)誘導(dǎo)培養(yǎng)未成熟DC細(xì)胞。所有細(xì)胞因子均購買自Novoprotein公司。
除DC細(xì)胞外, 本研究中還應(yīng)用到了293A細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。用DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)培養(yǎng)293A細(xì)胞, 1.0 mmol/L丙酮酸鈉,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素, 加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS), 在37 °C、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng), 每3 d傳代, 取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。小鼠腹腔注射500 μL液體石蠟, 饑餓處理72 h刺激巨噬細(xì)胞生成, 收集腹腔液, 于1 000 r/min離心3 min, PBS洗3次, 加RPMI 1640, 在37 °C、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng), 每3d更換培養(yǎng)基。
如前所述, 通過熒光顯微鏡檢測DC細(xì)胞攝取FITC標(biāo)記的納米金顆粒–多肽復(fù)合物情況。簡單地說, 將50 μL(多肽含量為60 nmol)按上述方法配制的納米金顆粒–多肽復(fù)合物加入到150 μL含有5×105個未成熟DC細(xì)胞的培養(yǎng)體系中, 培養(yǎng)2 h(37 °C、5%CO2及飽和濕度)。處理后細(xì)胞用生理鹽水洗2次, 保存在生理鹽水溶液中用于熒光顯微鏡檢測。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)直接觀察細(xì)胞攝取納米金顆粒能力時, 由于DC細(xì)胞樣本量的限制, 無法滿足切片要求以完成TEM觀察,因此改用293A細(xì)胞檢測細(xì)胞攝取納米金顆粒的情況。方法如下, 培養(yǎng)約1×108個293A細(xì)胞, 用15 mL納米金顆粒處理。處理后細(xì)胞收集并用多聚甲醛固定。使用HITACHI H-7650透射電子顯微鏡完成電鏡實(shí)驗(yàn)。
抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)是通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) 試 驗(yàn)(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)檢 測IFN-γ的釋放水平來實(shí)現(xiàn)的, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個對照組(分別為空白對照組、陰性對照組和陽性對照組)及不同濃度的實(shí)驗(yàn)組, 使用人IFN-γ預(yù)包被ELISPOT試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)進(jìn)行檢測。首先用200 μL培養(yǎng)基預(yù)包被每孔, 然后將100 μL含1×105個細(xì)胞的液體加入到除空白對照組外的各實(shí)驗(yàn)孔,空白對照組加對應(yīng)體積培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為PBMC, 在陽性對照組孔加入陽性刺激劑10 μL/孔,等體積培養(yǎng)基加入到陰性對照組孔, 濃度梯度的納米金顆粒–多肽復(fù)合物加入到各實(shí)驗(yàn)孔。37 °C、5%CO2孵育20 h后, 在4 °C用去離子水裂解10 min。用試劑盒提供的洗液洗5遍后, 每孔加100 μL生物素偶聯(lián)的IFN-γ單抗孵育1 h。重復(fù)上述清洗步驟后, 每孔加100 μL的鏈霉親和素-HRP后孵育1 h。再重復(fù)清洗步驟后, 每孔加100 μL新鮮配置AEC顯色液, 并將實(shí)驗(yàn)板避光20 min顯色。顯色完成后棄溶液, 用去離子水洗若干遍后, 自然晾干實(shí)驗(yàn)板, 用Bioreader4000-PRO-X(Bio-Sys, Germany)讀板儀進(jìn)行斑點(diǎn)讀取, 單次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔進(jìn)行均值統(tǒng)計, 3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后, 采用Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
2 結(jié)果
為 了 減 小 偶 聯(lián) 體 系 的 規(guī) 模, 使 用9號 多 肽[SIINFEK(FITC)L, H-2 KB restricted]在最佳pH5.8時, 與納米金顆粒偶聯(lián)。在同一離心管中, 混合20 μmol/L等體積7.2 μL多肽和PEG, 形成摩爾比為1׃1。將混合物加到粒徑為15 nm的檸檬酸鹽包被的100 μL納米金顆粒中, 室溫攪拌金/PEG/多肽混合物1 h, 使硫醇和檸檬酸在納米金顆粒表面完全交換。混合完全后, 將偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中, 12 000 r/min離心30 min純化偶聯(lián)復(fù)合物并去除上清。用100 μL含0.2% Tween 20的乙醇溶液重懸偶聯(lián)復(fù)合物。圖5顯示了380~610 nm的光譜吸收以證實(shí)偶聯(lián)成功。
3 討論
隨著基因測序的應(yīng)用推廣, 針對腫瘤的治療勢必將趨于精準(zhǔn)化和個性化, 其應(yīng)用主要包括兩個方面, 即精準(zhǔn)診斷和精準(zhǔn)治療。其中, 精準(zhǔn)診斷深入基因水平對腫瘤發(fā)生原因進(jìn)行定位; 治療上的精準(zhǔn)化則指的是針對病因的靶向用藥。精準(zhǔn)醫(yī)療作為一種新型的醫(yī)學(xué)概念及醫(yī)療模式, 目前正受到國家的大力支持, 基因測序政策的放開也打開了精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)業(yè)化的大門。免疫治療作為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù), 其核心要素抗原表位的篩選必將成為腫瘤免疫療法中的重要一環(huán)和常規(guī)技術(shù)。腫瘤相關(guān)免疫原性多肽來源于腫瘤, 作為識別腫瘤抗擊腫瘤最直接的武器, 其免疫原性強(qiáng)弱直接關(guān)系到腫瘤治療的效果。
本研究從納米金顆粒良好的理化性質(zhì)及廣泛的生物學(xué)應(yīng)用入手, 將其與抗原多肽進(jìn)行偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)快速且簡便的篩選。在實(shí)驗(yàn)過程中, 不斷優(yōu)化各種參數(shù), 如納米金顆粒與多肽偶聯(lián)時的pH、緩沖液體系、稀釋劑成分、硫金摩爾比、細(xì)胞攝取偶聯(lián)復(fù)合物的時間等參數(shù), 實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的偶聯(lián)條件、最少的偶聯(lián)損耗以及最短的實(shí)驗(yàn)時間。在多肽免疫原性實(shí)驗(yàn)中成功驗(yàn)證不同多肽的免疫原性。此外, 研究還成功實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)體系的縮小, 以適應(yīng)高通量篩選的需求�，F(xiàn)今, 納米科技在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用, 納米材料的優(yōu)良特性使其擁有廣泛的應(yīng)用前景。生化藥品的研發(fā)如抗癌藥、抗心血管病藥、抗艾滋病和糖尿病藥, 特別是DNA藥物都可引入納米材料。因此, 本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)成果在抗病毒感染、腫瘤治療、疫苗開發(fā)等方面都具有重要的理論和實(shí)際意義。已有研究表明, 粒徑小于50 nm的微粒, 能穿過肝臟內(nèi)皮或通過淋巴傳遞到達(dá)脾和骨髓, 或者攜帶小分子多肽或藥物跨越血–腦屏障。因此, 針對納米金顆粒的研究必將極大地推動腫瘤的免疫治療。此外, 本研究后期可致力于尋找和設(shè)計DC細(xì)胞靶向型多肽, 可以直接利用人外周血單核細(xì)胞, 無需分離DC及T細(xì)胞, 減少細(xì)胞分離與共培養(yǎng)步驟。
抗原表位篩選結(jié)果最終可通過合適的方式, 轉(zhuǎn)換為醫(yī)療數(shù)據(jù)呈現(xiàn)給研究人員、醫(yī)務(wù)工作者及患者。隨著數(shù)據(jù)量的逐漸豐富, 腫瘤的新的基因標(biāo)志或特異/共有的分子特征可能被發(fā)現(xiàn), 其治療方法也將隨著現(xiàn)有經(jīng)驗(yàn)的積累而得到簡化與快速采用。本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)方法可與計算機(jī)模擬及預(yù)測相結(jié)合,利用現(xiàn)有的MHC分子三維結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)篩選出的免疫原性差異明顯的幾種多肽進(jìn)行演算, 從抗原親和力微觀角度解釋其免疫原性的區(qū)別。隨著MHC分子的空間結(jié)構(gòu)越來越清晰化和準(zhǔn)確化, 多種MHC分子–抗原復(fù)合物的數(shù)學(xué)模型已被建立, 通過計算機(jī)模擬運(yùn)算能預(yù)估出每種抗原與MHC分子的親和力數(shù)值。但鑒于MHC分子亞型的多樣性, 新抗原前后氨基酸序列以不同組合、不同長度形成表位的多樣性,數(shù)據(jù)龐大。目前, 該預(yù)測方法仍不夠成熟, 假陽性或假陰性仍普遍存在, 需要后續(xù)耗時耗力的驗(yàn)證工作。因而, MHC分子與抗原的親和力的準(zhǔn)確預(yù)估, 仍有待于通過數(shù)據(jù)的不斷積累、預(yù)測模型的不斷優(yōu)化來完成。此外, 研究也可覆蓋MHC-I類分子及MHC-II類分子對抗原多肽的遞呈能力, 這兩類分子均可在免疫應(yīng)答過程中受細(xì)胞因子的誘導(dǎo)而表達(dá), 在腫瘤治療中可通過提高抗原遞呈細(xì)胞表面表達(dá)量達(dá)到更好的治療效果。當(dāng)多肽能穩(wěn)定均勻的分散在納米金顆粒上的時候, 進(jìn)行多肽與MHC-I類及II類分子的親和力模擬及預(yù)測, 通過計算機(jī)模擬找到這兩類分子中起結(jié)合作用的關(guān)鍵氨基酸, 可為預(yù)測抗原遞呈能力提供理論基礎(chǔ)。
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