摘要：抗菌肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 是一種新型抗生素，對多種細(xì)菌，多重耐藥細(xì)菌均具有抗菌活性。然而，其副作用也是制約抗菌肽研發(fā)的主要障礙。研究者使用模式細(xì)胞膜，揭示抗菌肽與細(xì)胞膜之間的作用方式，開展抗菌肽開發(fā)和篩選研究。另外，研究者還將抗菌肽與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用，可以協(xié)同提高抗菌效果。研究初步揭示了 AMPs 和常規(guī)抗生素之間協(xié)同作用的機(jī)制。本綜述探討了模式細(xì)胞膜在 AMPs 發(fā)現(xiàn)篩選中的應(yīng)用，及 AMPs 和常規(guī)抗生素之間聯(lián)合用藥的研發(fā)現(xiàn)狀。
抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用，使得大多數(shù)傳染病得到了有效控制，但幾十年來抗生素的過度使用，導(dǎo)致病原微生物對常用抗生素產(chǎn)生了耐藥性。如果這種情況繼續(xù)惡化，將會(huì)對人類健康特別是手術(shù)和癌癥的治療等產(chǎn)生重大影響，此外，耐藥性問題也將使對抗艾滋病毒和瘧疾的斗爭復(fù)雜化。多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，新抗菌素研發(fā)減緩，抗生素的有效性下降，這就極需新型抗感染藥物的研發(fā)。
使用抗菌肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 是抗感染的一種新策略。從低級(jí)單核微生物到人類免疫系統(tǒng)中都發(fā)現(xiàn)了這類分子。一些天然 AMPs 是高等生物與細(xì)菌共同進(jìn)化數(shù)百萬年的產(chǎn)物，它們是免疫防御的第一道防線。AMPs 不如常規(guī)抗生素藥效高，但可以抑制多重耐藥菌的繁殖，并且起效快 [1]。
如同新型抗菌治療藥物的研發(fā)一樣，藥物的耐藥性無疑是核心問題，因?yàn)榭咕淖饔脵C(jī)制研究發(fā)現(xiàn)這些分子主要作用靶點(diǎn)是細(xì)菌的細(xì)胞膜，因此發(fā)生藥物耐藥性的概率要小于常用抗生素。細(xì)菌抵抗天然 AMPs 的機(jī)制有，外排泵功能上調(diào)，細(xì)胞膜和細(xì)胞包膜的生理改變，被蛋白酶降解，生物膜脂多糖修飾等。研發(fā)人員同時(shí)發(fā)現(xiàn)，將 AMPs 和抗生素聯(lián)合使用，可以抑制多重耐藥細(xì)菌繁殖 [2-3]。AMPs作為新型抗生素備選藥物，研究者正在努力發(fā)現(xiàn)其抗菌作用機(jī)制，降低細(xì)胞毒性，降低蛋白酶降解，使其更穩(wěn)定并可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
現(xiàn)在認(rèn)為抗菌肽作用機(jī)制是 AMPs 靶向陰離子細(xì)菌細(xì)胞膜，并且驅(qū)動(dòng)它們之間的初始接觸，第一作用力是帶正電氨基酸和帶負(fù)電細(xì)胞膜之間的靜電相互作用。第二作用力是肽的雙親性結(jié)構(gòu)域與膜磷脂之間的疏水相互作用。如果達(dá)到AMPs的閾值濃度，上述的這些作用力是劇烈的，進(jìn)而達(dá)到對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞。AMPs 對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用，取決于抗菌肽和脂質(zhì)膜的組成 [4]，因?yàn)?AMPs 靶向陰離子細(xì)菌細(xì)胞膜，因此 AMPs 產(chǎn)生耐藥性可能性較低。
另一個(gè)越來越受關(guān)注的研究領(lǐng)域是 AMPs 與常規(guī)抗生素的聯(lián)合用藥。由于常規(guī)抗生素和 AMPs 抗菌的作用機(jī)制不同，這些聯(lián)合療法似乎是一種有前景的方法。在這方面，人們相信通過 AMPs 對細(xì)菌膜的透化作用使得抗生素能夠更容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。新型協(xié)同療法的發(fā)展，需要深入地對“抗菌肽 - 細(xì)胞膜”的生物物理相互作用，以及抗生素生化活性進(jìn)行研究。
1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)
根據(jù) AMPs 的結(jié)構(gòu)，可以將其分為 5 大類：AMPs 拓展型、β- 折疊型、β- 發(fā)夾型、α- 螺旋型和環(huán)型 AMPs( 圖 1)。
AMPs 拓展型是不含二級(jí)結(jié)構(gòu)的富含甘氨酸、精氨酸或硫胺素的多肽，如吲哚菌素，富組蛋白和果蠅菌素等。β- 折疊型 AMPs 的特征是，存在兩個(gè)或多個(gè)由二硫鍵穩(wěn)定的 β- 鏈，包括 α-，β- 和 θ- 防御素。β- 發(fā)夾型 AMPs 具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過 II 型旋轉(zhuǎn)，并通過 β- 鏈之間形成的二硫鍵來穩(wěn)定，如乳鐵蛋白肽 B 是一種帶有單一二硫鍵的陽離子肽，在2 位和 20 位半胱氨酸殘基之間形成一個(gè) 18 元環(huán)。此類型其他肽還有，中國鱟肽和多孢菌素等。α- 螺旋型 AMPs 具有兩親性特征，這些 AMPs 在水性溶劑中無固定結(jié)構(gòu)，在人工細(xì)胞膜或天然細(xì)胞膜存在時(shí)形成 α- 螺旋。環(huán)型 AMPs 通過一個(gè)單鍵維持其環(huán)形結(jié)構(gòu)，同時(shí)它可能具有 α- 螺旋結(jié)構(gòu)、β- 折疊結(jié)構(gòu)，通常在 C 末端通過一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，而其 N 末端多為線狀結(jié)構(gòu)，如牛的環(huán)狀十二肽(dodecapeptide)、青蛙皮膚產(chǎn)生的 brevinins 等。
當(dāng)抗菌肽與細(xì)胞膜接觸，并超出肽脂臨界比后，AMPs 插入細(xì)胞膜中并形成跨膜孔，引起膜的不穩(wěn)定導(dǎo)致膜的去極化及最終細(xì)胞死亡。雖然 AMPs 可以擾動(dòng)細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)，但是膜破裂還需要 AMPs要達(dá)到一定的濃度閾值。研究發(fā)現(xiàn)，N- 末端的帶電殘基對于環(huán)形孔的形成至關(guān)重要，并且在與膜結(jié)合前后，AMPs 聚集是跨膜孔形成的先決條件，而并非多肽的螺旋結(jié)構(gòu)。掃描電鏡研究顯示，觀察發(fā)現(xiàn)兩棲動(dòng)物 AMPs 孵育的銅綠假單胞菌，幾乎所有細(xì)菌表面都被突出的囊泡覆蓋。這可能是 AMPs 導(dǎo)致細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，并破壞了革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)膜，細(xì)胞質(zhì)填充在周質(zhì)空間中由外膜包裹形成囊泡。
2 磷脂脂膜模型
模型膜系統(tǒng)為膜 - 肽相互作用研究提供了幫助，其優(yōu)點(diǎn)是測試條件易于控制。細(xì)胞膜主要結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)雙分子層，磷脂作為細(xì)胞膜的主要成分之一，具有良好的生物相容性，還具有自組裝、乳化和潤濕等特性。目前已經(jīng)開發(fā)的幾種模型系統(tǒng)用于模擬脂質(zhì)雙層特征。模型膜系統(tǒng)有，囊泡脂質(zhì)體、langmuir單層膜和固體支撐雙層脂質(zhì)膜模型。這些系統(tǒng)對于研究肽膜相互作用均存在優(yōu)缺點(diǎn)。
囊泡脂質(zhì)體是一種封閉磷脂雙層，根據(jù)制備方式不同，脂質(zhì)囊泡的直徑大小有 10nm，如小單層囊泡 (small unilamellar vesicles, SUV)，1000nm；而 大型單層囊泡 (large unilamellar vesicles, Luvs) 或巨型單層囊泡 (giant unilamellar vesicles, Guvs)，其范圍直徑可達(dá)幾十微米。脂質(zhì)體也可由多層囊泡組成，稱為多層囊泡(multilamellar vesicle, MLV)。單層脂質(zhì)體，也稱“l(fā)angmuir 單層”，是空氣和液體界面處表面活性分子形成脂質(zhì)體單層。這種單層脂質(zhì)體模型形成較為簡單，將有機(jī)溶劑中脂類沉積到液體表面，溶劑蒸發(fā)后，脂質(zhì)極性頭部保持與液相接觸，而非極性鏈指向外側(cè)。該模型可用于脂質(zhì)膜的相變進(jìn)行研究，為肽引發(fā)的脂質(zhì)堆積變化提供信息。單層脂質(zhì)體模型具有獨(dú)特優(yōu)勢，即可以方便地測定和調(diào)節(jié)脂質(zhì)分子的排列和堆積，也可以控制脂質(zhì)層組成和密度 [5]。
固 體 支 撐 雙 層 脂 質(zhì) 膜 (supported lipid bilayers,SLB) 模型，是將脂質(zhì)雙層固定在固體基質(zhì) ( 如二氧化硅、玻璃或云母 ) 上，脂質(zhì)的親水性基團(tuán)面向固體基質(zhì)。由于它們的脂質(zhì)排列整齊并極易形成，SLB 成為最常用有價(jià)值的研究模型。此外，研究對象被限制于二維空間中，可以使用多種固相表面定量研究技術(shù)，如原子力顯微鏡 (atomic force microscope, AFM)，石英晶體微量天平 (quartz crystal microbalance, QCM)，紅外反射吸收光譜法等進(jìn)行研究。固體支撐雙層脂質(zhì)膜可以用于研究模型平面結(jié)構(gòu)的變化，也可以研究 AMPs 在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散。
使用磷脂脂膜模型研究的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以過調(diào)整脂質(zhì)組分來模擬不同種類細(xì)胞膜。研究者利用負(fù)電荷囊泡模擬細(xì)菌膜，中性 ( 或兩性 ) 囊泡模擬真核細(xì)胞膜，進(jìn)行了許多抗菌肽的篩選研究。例如，磷脂酰膽堿 (phosphatidyl choline, PC) 通常用于模擬哺乳動(dòng)物細(xì)胞的膜，因?yàn)?PC 是其細(xì)胞質(zhì)膜的主要成分之一，而磷脂酰甘油 (phosphatidyl glycerol, PG) 通常添加在細(xì)菌模型膜上，因?yàn)檎婧松锏募?xì)胞質(zhì)膜不含PG，而在細(xì)菌的細(xì)胞膜中廣泛存在。過去的幾十年，許多物理化學(xué)技術(shù)和膜模型技術(shù)被應(yīng)用于 AMPs 表征研究。應(yīng)該注意，使用不同磷脂脂膜模型對同一個(gè)AMPs 進(jìn)行研究時(shí)，得到的數(shù)據(jù)和結(jié)論可能不盡相同 [6]。
3 肽 - 膜的相互作用研究
細(xì)胞膜模型的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上的 AMPs 達(dá)到閾值濃度之后才會(huì)出現(xiàn)膜破裂。為了研究 AMPs 的作用機(jī)制，需要首先研究 AMPs 與細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。如，觸發(fā)細(xì)胞膜破裂時(shí)，細(xì)胞膜上 AMPs 的閾值濃度，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂的分子作用力等基礎(chǔ)科學(xué)問題。
Bouchet 等 [8] 研 究 結(jié) 果 顯 示，AMP([K108W111]107~115hLz)， 對 于 純 二肉 豆 蔻 酰 磷 脂 酰 膽 堿 的Kp 為 3.2×103，而在含 PG 的細(xì)胞膜上該值上升到17.3×103。由此，在 3mmol/L AMP 下，純二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿過量條件時(shí)的膜上多肽的摩爾分?jǐn)?shù)(molarfraction of the peptideon the membrane, XL) 為 0.88，當(dāng)將 AMP 轉(zhuǎn)移到帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜上時(shí)，該值增加到0.97，說明這時(shí)候幾乎所有多肽都與細(xì)胞膜相結(jié)合。AMPs 在細(xì)菌模型膜的分配常數(shù)顯著高于哺乳動(dòng)物模型膜的這一事實(shí)，解釋了 AMPs 的特異性和安全性，并且也為新抗菌肽的設(shè)計(jì)提供了依據(jù) [9]。
AMPs 和質(zhì)膜結(jié)合反應(yīng)方程為：P+nL PLn.其 中 P 為 peptide， 多 肽；L 為 脂 質(zhì)；n 為 等 效 的獨(dú)立結(jié)合點(diǎn)數(shù)量。當(dāng)可結(jié)合的脂質(zhì)過量時(shí)，反應(yīng)方 程 可 轉(zhuǎn) 化 為：kon[L][P]=koff [PLn]。其 中 kon和 koff 分 別 為 結(jié) 合 和 解 離 速 率 常 數(shù)。通 過 測 試不同的質(zhì)膜模型，可以獲得抗菌肽對于不同質(zhì)膜的篩選信息。研究肽 - 膜親和力可以使用光譜方法，如紅外 (infrared, IR)、紫外 - 可見光、熒光、旋 光 色 散 (opticalrotatorydispersion, ORD) 核 磁 共 振(nuclear magnetic resonance, NMR)，等離子體波導(dǎo)共振 (plasmon waveguide resonance, PWR)， 圓 二 色 性(circular dichroism, CD) 和動(dòng)態(tài)光散射 (dynamic lightscattering, DLS) 等。這些方法的最大優(yōu)點(diǎn)，即可實(shí)現(xiàn)親和力的溶液檢測 [10]。
分配系數(shù)和解離常數(shù)常用于 AMPs 與不同膜模型相互作用的描述，預(yù)測AMPs抗菌活性或細(xì)胞毒性。研究者還通過使用不同脂質(zhì)膜模型，對抗菌肽對于兩性離子質(zhì)膜或負(fù)電荷質(zhì)膜的選擇進(jìn)行研究，抗菌肽的這種對膜性質(zhì)的選擇性決定了其生物學(xué)活性。
分配系數(shù)和解離常數(shù)，不能描述抗菌肽吸附或是鑲嵌到細(xì)胞膜上的位置信息。該結(jié)構(gòu)信息可以通過使用光譜方法，如差示熒光猝滅 (differentialfluorescence quenching) 技術(shù)獲得，細(xì)胞膜不同區(qū)域放置猝滅劑分子，如碳酰亞胺基團(tuán)修飾的硬脂酸分子 5NS 和 16NS。16NS 對于埋細(xì)胞膜中的分子有很好淬滅效應(yīng)，而5NS對于接近細(xì)胞膜淺層、靠近脂質(zhì)-水界面的分子的淬滅效應(yīng)較好 [11]。當(dāng)猝滅劑 (5NS 或16NS) 和熒光基團(tuán) (AMPs 的 Trp 殘基 ) 之間發(fā)生接觸時(shí)，即發(fā)生猝滅效應(yīng)，猝滅效率與兩個(gè)基團(tuán)之間距離有關(guān)，由此可以計(jì)算出它們在細(xì)胞膜中的最終位置。熒光猝滅實(shí)驗(yàn)還可以確定來源不同 AMPs 的最終位置，有助于揭示這些抗菌肽的作用模式 [12]。
3.4 細(xì)胞膜的破裂
AMPs 是通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞膜最終滲漏破裂，殺傷細(xì)菌，發(fā)揮宿主防御或細(xì)胞毒性的作用。因此，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性是研究 AMPs作用雙層脂膜的關(guān)鍵內(nèi)容 [13]。
囊泡內(nèi)染料滲漏的熒光檢測，被廣泛用于抗菌肽活性的量化分析。使用增加熒光強(qiáng)度檢測技術(shù)，可以對囊泡中釋放的熒光染料進(jìn)行檢測。常用的熒光染料和猝滅劑有，8- 氨基萘 -1,3,6- 三磺酸(8-aminonapthalene-1,3,6trisulfonicacid, ANTS) 和 對 -二 甲 苯 - 雙 吡 啶 溴 (p-xylene-bispyridiniumbromide,DPX) 等。當(dāng)細(xì)胞膜滲漏后，滲漏染料熒光和猝滅劑結(jié)合會(huì)改變?nèi)芤旱臒晒鈴?qiáng)度。鈣黃綠素和羧基熒光素，廣泛應(yīng)用于由 AMPs 引起的脂質(zhì)體滲漏。膜滲漏的難易程度取決于脂質(zhì)雙層膜的物理性質(zhì) [14]。
大 型 單 層 囊 泡 (large unilamellar vesicles, LUV)懸浮法的研究僅能提供細(xì)胞膜破裂反應(yīng)不同階段的熒光強(qiáng)度平均值，很難得到有關(guān)細(xì)胞膜破裂機(jī)制的更多信息，如染料 50% 滲漏，不能確定是 50% 囊泡釋放還是所有囊泡釋放 50%，在這兩種情況，檢測數(shù)值都是 50%。因此，LUV 懸浮法提供了一些AMPs 誘導(dǎo)滲漏的信息，但滲漏的基本過程和相互作用的機(jī)理細(xì)節(jié)仍不清楚。
因 此， 研 究 者 使 用 熒 光 共 聚 焦 熒 光 顯 微 鏡(confocal fluorescence microscop) 研 究 巨 大 單 層 囊泡 (giant unilamellar vesicles, GUV) 的破裂過程，以及針對單個(gè) GUV 破裂，進(jìn)行熒光探針滲漏的過程觀察。Tamba 等 [15] 使用染料 8- 羥基芘 -1,3,6- 三磺酸(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonicacid, HPTS) 包 裹 磷 脂酰甘油形成單層囊泡，當(dāng)將加入低聚 α-Synuclein 時(shí)，囊泡內(nèi)部HPTS熒光外流。他們使用同樣的GUV方法，發(fā)現(xiàn) AMP 爪蟾抗菌肽 -2 可以誘導(dǎo)細(xì)胞穿膜孔的形成，于細(xì)胞膜表面電荷密度和緩沖液鹽濃度有關(guān)。
4 抗菌肽與細(xì)胞膜相互作用的計(jì)算機(jī)模擬
研究者建立計(jì)算機(jī)模擬模型，用于抗菌肽和脂類相互作用的研究，每種模型系統(tǒng)建模的方式不同，適用的范圍也不同。分子動(dòng)力學(xué) (molecular dynamics,MD) 是計(jì)算機(jī)建模的基礎(chǔ)原理之一，可用于研究抗菌肽進(jìn)入脂質(zhì)雙層的動(dòng)力學(xué)及對周圍脂質(zhì)的影響。MD 建模的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠描述藥物進(jìn)入膜的可能位置和方向。MD 建模系統(tǒng)用于多種藥物預(yù)測，預(yù)測參數(shù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合。最近，Brgund 等 [16] 利用 MD 研究了已知抗菌脂肽多黏菌素 B1(polymyxinB1, PMB1)與大腸埃希菌細(xì)菌外膜異質(zhì)模型的相互作用，揭示了不同細(xì)菌膜模型下 PMB1 的行為差異 [17]。這種脂肽聚集在細(xì)菌外膜脂多糖的頭部區(qū)域，很少插入質(zhì)膜 [18]；另一方面，它更容易插入細(xì)菌內(nèi)膜，造成脂雙層不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂 [19]。
Sudheendra 等 [20] 對 人 β- 防 御 素 -3(humanβ-defensin-3, HβD-3) 不同類似物進(jìn)行了研究，使用POPC 雙層膜 MD 模型，將抗菌肽放入到雙層質(zhì)膜中，他們發(fā)現(xiàn)，模擬過程中抗菌肽末端殘基突出雙層質(zhì)膜之外。他們認(rèn)為，靜電相互作用決定了細(xì)胞膜的破裂，靜電作用下，抗菌肽末端殘基的正電荷破壞磷酸鹽頭部基團(tuán)，相應(yīng)的多肽延伸出雙層質(zhì)膜。
另一種計(jì)算機(jī)建模的基礎(chǔ)是分子對接，可以用于配體與靶蛋白的可能位點(diǎn)的定位研究。分子對接是通過特定評分函數(shù)循環(huán)評估配體構(gòu)象，直到溶液能量最低。Trott[21] 使用 Auto Dock Vina，計(jì)算比較不同構(gòu)象和配體產(chǎn)生的結(jié)合親和力。對接方法多用于篩選具有不同抗菌肽特異性，用于了解抗菌肽對細(xì)胞膜的生物學(xué)活性和特異性。例如，F(xiàn)antini 等[22] 研究 α-synuclein 的和膽固醇的潛在結(jié)合位點(diǎn)。Nsimba 等 [23] 通過應(yīng)用分塊矩陣方法，比較磷脂酰膽堿十六烷基甜菜堿氯化物 (hexadecyl betainatechloride, C16BC)、鞘磷脂和膽固醇的親和力。Deleu等 [24] 改進(jìn)了 HM 對接方法，計(jì)算作為表面蛋白的抗菌肽與不同脂質(zhì)之間的相互作用 [25]，如 DPPC、DOPC 和它們的二元混合物，可用于觀察分子之間優(yōu)先相互作用和相位差。
5 抗菌肽與生物膜的相互作用
我們對抗菌肽和細(xì)胞膜作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，都來自對上述細(xì)胞膜模型的研究。至今，我們尚不能確認(rèn)這種模擬情況，和真實(shí)細(xì)菌中的 AMPs 的作用機(jī)制是否一致。近年來，一些模型膜技術(shù)開始應(yīng)用于細(xì)菌研究，如 Zeta 電位和一些熒光方法作為偶極電位擾動(dòng)。
Alves 等 [26] 用抗菌肽 BP100 或 PEPR 進(jìn)行大腸埃希菌 zeta 電位評測，發(fā)現(xiàn)了抗菌藥物敏感性與細(xì)菌表面電荷中和有關(guān)。此外，通過全細(xì)胞 AFM 成像，實(shí)現(xiàn)上 AMPs 對大腸埃希菌的原子水平作用模式的研究。Malgieri 等 [27] 研究革蘭陰性菌細(xì)胞與抗菌肽的相互作用，抗菌肽遇到細(xì)菌細(xì)胞膜后 CD 檢測獲得抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，并證明 CD 適合抗菌肽與大腸埃希菌細(xì)胞相互作用研究。Roversi[28] 在PAMAP-23 類似物與大腸埃希菌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)結(jié)合的抗菌肽完全飽和細(xì)菌細(xì)胞膜 ( 每個(gè)細(xì)胞結(jié)合 106~107 肽 ) 時(shí)才會(huì)發(fā)生抗菌作用 [29]。上述這些研究發(fā)現(xiàn)，基于細(xì)胞膜模型和基于細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相似的，這些支持了模型膜的正確性。也就是說，其一定合理范圍內(nèi)，細(xì)胞膜模型對于 AMPs 的作用機(jī)制研究是可靠的。
但有些研究結(jié)果顯示，AMPs 對于模擬細(xì)菌細(xì)胞膜和真核細(xì)胞膜的親和性不同，但這可能只是實(shí)驗(yàn)假象，因?yàn)闇y定抗菌肽的抗菌和溶血活性所需要條件差異非常大，實(shí)驗(yàn)研究還很薄弱。但最近，利用偶極子電位法直接用于紅細(xì)胞的研究，為抗菌肽與細(xì)胞膜的親和力研究提供了有力支持，結(jié)果顯示和溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合。這種單獨(dú)檢測方法是基于假設(shè) AMPs 與特定細(xì)胞類型親和力不受不同細(xì)胞影響。抗菌肽 HDP PMAP-2315 在紅細(xì)胞存在時(shí)具有抗菌活性，抗菌活性不受紅細(xì)胞存在的影響。此外，當(dāng)細(xì)菌和紅細(xì)胞存在下，或只有一種細(xì)胞存在下，ESCultin 1A(1-21)NH2 僅在大量過剩紅細(xì)胞存在下，才會(huì)引起對抗菌活性的輕微抑制。ESCultin 1A(1-21)NH2 是一種來自 EsCultin 1A 的 AMP，該抗菌肽的抗菌活性很高。
6 抗菌肽的細(xì)胞毒性與抗菌活性
AMPs 活性取決于靶細(xì)胞膜磷脂組成和凈電荷。實(shí)際上，AMPs 對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的作用是一種細(xì)胞毒，特別是針對紅細(xì)胞，因此在設(shè)計(jì)新 AMPs 時(shí)需要注重考慮。AMPs 對真核細(xì)胞膜或原核細(xì)胞膜的選擇性，通常使用治療指數(shù)表示，治療指數(shù)是指最小溶血濃度 (minimum hemolytic, MHC) 和最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentrations, MIC) 的比值表示。治療指標(biāo)反映了 AMPs 的抗菌性能，指標(biāo)越高，抗菌性能越好。
研究人員試圖開發(fā)低毒新型 AMPs 并提高其抗菌活性。因此，進(jìn)行了很多嘗試去發(fā)現(xiàn)控制 AMPs選擇性的參數(shù)。抗菌肽兩親性在抗菌或溶血中作用一直沒有定論。有研究指出，凈電荷是 AMPs 選擇性關(guān)鍵參數(shù)，而不是增加兩親性；然而，Takahashi等 [30] 證實(shí)，當(dāng)抗菌肽具有 α- 螺旋時(shí)，兩親性是AMPs 具有抗菌活性的必要條件。在任何情況下，抗菌肽兩親性的增加會(huì)引起溶血性和抗菌活性同時(shí)增加 [31]。
除了抗菌活性外，Dathe 等 [32] 還證明了抗菌肽的疏水性與膜選擇性和插入細(xì)胞膜方式有關(guān)。人們推測，疏水性增強(qiáng) AMPs 穿透兩性離子膜，引發(fā)溶血�？咕南嚓P(guān)研究，確定高疏水性 α- 螺旋抗菌肽與真核生物的膜親和力高，從而引發(fā)溶血。
7 抗菌肽與抗生素的協(xié)同作用
協(xié)同作用是指兩種藥物聯(lián)合所產(chǎn)生的藥效大于其單獨(dú)使用。AMPs抗菌作用方式與常規(guī)抗生素不同，AMPs 靶向細(xì)菌膜，產(chǎn)生膜不穩(wěn)定或形成穿膜孔，最后導(dǎo)致細(xì)胞破裂。當(dāng) AMPs 與常規(guī)抗生素藥物聯(lián)合使用時(shí)，AMPs 的這種特性可能會(huì)促進(jìn)常規(guī)抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，產(chǎn)生藥物協(xié)同活性 [35]。
常規(guī)抗生素抗菌活性表現(xiàn)在抑制 DNA 復(fù)制、DNA 轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁合成，或是靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶和青霉素結(jié)合蛋白 (penicillin-binding proteins, PBPs)。多重耐藥細(xì)菌的耐藥性機(jī)制，是抑制常規(guī)抗生素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，從而導(dǎo)致抗菌失敗。而 AMPs 可以增加細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性，抗生素可以滲透進(jìn)入細(xì)菌，發(fā)揮抗菌功能。聯(lián)合使用抗生素時(shí)必須考慮藥物的拮抗作用、重復(fù)感染、增加不良反應(yīng)和增加成本等問題。在臨床實(shí)踐中，抗生素聯(lián)合使用被廣泛應(yīng)用于危及生命的感染，或是為了避免耐藥性的出現(xiàn)。一些 AMPs 與常規(guī)抗生素的聯(lián)合使用，抑制人類病原體的協(xié)同作用已并被證實(shí)。
黏菌素是一種陽離子抗菌肽，與阿奇霉素、紅霉素和克拉霉素協(xié)同作用于，可用于多耐藥性肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。這種 AMPs 能增加細(xì)菌膜滲透，促進(jìn)抗生素進(jìn)入，從而抑制核糖體蛋白的合成活性，阿奇霉素和 LL-37( 一種陽離子 AMP) 之間的協(xié)同作用，抑制多重耐藥的革蘭陰性桿菌 [36]。
達(dá)托霉素是環(huán)狀脂肽類抗生素，可與鈣結(jié)合形陽離子復(fù)合物抑制革蘭陽性菌。Nsimba 等 [23] 報(bào)道了一例萬古霉素和氨芐西林耐藥的腸球菌 (vancomycinand ampicillin-resistant E. faecium, VRE) 引起的主動(dòng)脈瓣心內(nèi)膜炎病例，使用達(dá)托霉素和氨芐西林聯(lián)合使用進(jìn)行治療。他們研究了氨芐西林對VRE菌株的影響，證實(shí)氨芐西林引起細(xì)胞表面凈正電荷的減少，增大達(dá)托霉素與細(xì)胞表面的結(jié)合。
有研究顯示：人 β- 防御素 3(human β-defensin3,HBD3) 和 cathelicidinLL-37 聯(lián)合替加環(huán)素，莫西沙星、哌拉西林 / 三唑巴坦和美羅培南使用，對于難辨梭狀芽孢桿菌的治療具有協(xié)同作用 [37]。
另有研究證明，弱陽離子抗菌肽與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用對革蘭陰性菌 ( 大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌 )，革蘭陽性菌 ( 表皮葡萄球菌，肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌 ) 具有協(xié)同作用。幾乎所有抗菌他肽與頭孢吡肟，亞胺培南，萬古霉素和鹽酸左氧氟沙星聯(lián)合使用均具有協(xié)同作用。利用小鼠傷口感染模型，用 PL-5 和鹽酸左氧氟沙星聯(lián)合治療可顯著降低金黃色葡萄球菌的 CFU，進(jìn)一步證明了聯(lián)合用藥的協(xié)同作用 [39]。
陽離子肽 nicin 是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種3.5kDa 羊毛硫氨酸抗生素。Lewies 等 [42] 研究了乳鏈菌 nicin-Z 與常規(guī)抗生素對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌上的協(xié)同作用。他們發(fā)現(xiàn)，nicin-Z 與常規(guī)抗生素具有相加作用，尤其于新生霉素的協(xié)同作用更為顯著。
雖然在上述的實(shí)驗(yàn)表明了 AMPs 和常規(guī)抗生素的協(xié)同作用，但并非每一種 AMP 和常規(guī)抗生素聯(lián)合使用都能產(chǎn)生協(xié)同作用。有些可能表現(xiàn)為不相關(guān)，甚至為拮抗關(guān)系。有研究顯示，家蠅幼蟲抗菌肽亞型 MDL-3 與青霉素或鏈霉素聯(lián)用時(shí)均產(chǎn)生對鼠傷寒沙門菌 50013 的拮抗作用，抗菌肽在 N 端親水和 C端疏水結(jié)構(gòu)使功能具有一定相似性，但是對具體抗菌肽其高級(jí)結(jié)構(gòu)的不同表現(xiàn)出功能的差異。發(fā)生對抗關(guān)系的原因可能為：(1) 抗菌肽與抗生素之間對病原菌的結(jié)合位點(diǎn)具有競爭關(guān)系；(2) 抗生素影響病原菌的生理性質(zhì)可能改變了抗菌肽的結(jié)合位點(diǎn)；(3) 抗菌肽與抗生素可能導(dǎo)致了對方的失活。每種抗菌肽與抗生素作用機(jī)制不盡相同，加之與細(xì)菌的 3 者之間關(guān)系復(fù)雜，需要進(jìn)一步深入探究。
8 結(jié)論
抗菌肽是一種很有前景的抗生素，可以從頭設(shè)計(jì)，并可應(yīng)對多重耐藥細(xì)菌的挑戰(zhàn)，副作用小。深入了解這些分子與原核或哺乳動(dòng)物膜相互作用的選擇性機(jī)制，為降低細(xì)胞毒性和增加抗菌活性提供依據(jù)。AMPs 獨(dú)特的膜破壞活性，使其可以于常規(guī)抗生素聯(lián)合治療，產(chǎn)生藥物協(xié)同作用。研究顯示出 AMPs作為多重耐藥細(xì)菌療法中，抗菌活性增強(qiáng)劑具有廣闊應(yīng)用前景。
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