摘要：探討兩種或多種材料共修飾納米載體的構(gòu)建方法及其對體內(nèi)體外靶向性的影響，并從其制劑學(xué)特性、修飾材料的選擇及配合等方面進行分析。通過查閱近幾年國內(nèi)外文獻，對兩種配體結(jié)合類共修飾、配體結(jié)合類與細胞穿膜肽類共修飾、多糖類與配體結(jié)合類共修飾等不同類型的共修飾納米載體進行了綜合分析。兩種或多種材料共修飾的方法具有顯著提高納米載體的穩(wěn)定性、提高藥物對細胞膜的穿透性和對靶點的精準性等優(yōu)勢。與單一材料修飾的納米載體進行比較，共修飾納米載體的優(yōu)勢更為明顯。本文可為制備不同用途、類型納米載體時合理選擇修飾材料提供參考。
納米載體 (nanocarriers) 的粒徑為 1 ～ 1 000 nm，包括固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì)體 (LP)、膠束、納米乳、樹狀大分子等，其中脂質(zhì)體具有提高藥物生物利用度、降低藥物毒性、延緩藥物釋放并能被動靶向釋藥的特點。但是，一般脂質(zhì)體往往達不到器官或者細胞水平的精準靶向，同時穩(wěn)定性差的缺陷也阻礙其作為靶向制劑載體的發(fā)展與應(yīng)用。為了改善納米載體的靶向性及穩(wěn)定性，近年來國內(nèi)外學(xué)者不斷嘗試對其表面進行功能化修飾，以更好地達到主動靶向的目的 [ 1—2]。常用的靶向材料包括多糖及其衍生物類、聚乙二醇 (PEG) 及其衍生物、配體結(jié)合類、多肽類 [3]。然而這種單一材料修飾的納米載體易受到材料本身局限性及人體病理生理條件的影響，從而導(dǎo)致靶向治療的效果不佳。針對以上問題，本文系統(tǒng)綜述了多種材料共修飾的納米載體，重點闡述了不同功能的修飾材料對脂質(zhì)體的影響。
1 兩種配體結(jié)合類的共修飾
通常情況下，在腫瘤細胞表面往往存在多個與配體結(jié)合的位點。因此，采用 2 種特異性配體共同修飾的納米載體具有如下的優(yōu)勢 ：①提高納米藥物與腫瘤細胞表面結(jié)合位點的結(jié)合幾率 ；②解決單一配體飽和的問題 ；③克服不同類型腫瘤細胞的特異性結(jié)合問題。
葉酸 (folate，F(xiàn)) 與轉(zhuǎn)鐵蛋白 (transferrin，Tf)在許多腫瘤細胞膜表面均具有特異性的結(jié)合位點 [4—6]。腫瘤細胞增殖速度快，導(dǎo)致對鐵元素的需求量增大，因而腫瘤細胞中葉酸受體的表達量遠高于正常細胞�；谏鲜鎏攸c，葉酸修飾和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體均較未修飾脂質(zhì)體表現(xiàn)出更好的抑瘤效果 [7—8]。
利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與葉酸受體在腫瘤細胞中過表達、在正常細胞中低表達的特點，Sriraman 等根據(jù)導(dǎo)向分子的不同，分別制備了 4 種脂質(zhì)體：PEG 修飾的脂質(zhì)體 (PL)、轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體(TfL)、葉酸修飾的脂質(zhì)體 (FL)、雙重修飾的脂質(zhì)體 [(F+Tf)-L][9]。4 種脂質(zhì)體粒徑均小于 165 nm，包封率達 98％以上。體外試驗結(jié)果顯示，(F+Tf)-L組的 IC50 值為 25.8 µmol/L，明顯低于前 3 組脂質(zhì)體 ( 分別為 65.4、56.4 和 35.4 µmol/L)，表明該組藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的能力最強。在體內(nèi)試驗結(jié)果中，(F+Tf)-L 組也表現(xiàn)出高的腫瘤抑制率 (79％ )，而其他 3 組的腫瘤抑制率較低 ( 分別為 42％、50％和75％ )。
呂清等以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE) 作主要磷脂成分，亦成功制備了高包封率和穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)鐵蛋白與葉酸雙配體修飾的多柔比星 (DOX) 脂質(zhì)體 [10]。bEnd3 細胞對其的攝取效率遠大于普通脂質(zhì)體，并且攝取過程受葉酸和轉(zhuǎn)鐵蛋白的影響 ；同時在血腦屏障 (blood brain barrier，BBB) 模型中的藥物透過率也顯著高于其他脂質(zhì)體組。
綜上所述，構(gòu)建 2 種特異性配體修飾的脂質(zhì)體，可利用多種特異性配體同時識別定位靶細胞，實現(xiàn)對靶向受體的協(xié)同作用。同時，減少對非靶細胞的識別，降低對非靶向細胞的毒性作用。
2 配體結(jié)合類與細胞穿膜肽類 (CPP) 共修飾
轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤細胞表面具有飽和性，葉酸在生理條件下透膜性能極低 [13]，這也就大大限制了納米藥物進入腫瘤細胞的效率。理想的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)不僅需要在全身給藥后將藥物濃集在腫瘤組織，還需要將藥物有效地傳遞到腫瘤細胞內(nèi)，從而將治療作用最大化并減輕抗腫瘤藥的不良反應(yīng)。TAT 肽 (transcriptional activator protein) 是一種常用的細胞穿膜肽，可以通過非共價鍵結(jié)合的方法實現(xiàn)大分子物質(zhì)的胞內(nèi)遞送并保留其活性 [14]，但不能區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞的缺點限制了其應(yīng)用。
將 TAT 和特異性配體 Tf 共同修飾在脂質(zhì)體表面，可以互補各自的劣勢。文獻對比研究了 Tf/TAT-LP、TAT-LP 和 Tf-LP 對縮小腫瘤球體積作用的影響 [15—19]。結(jié)果顯示，共修飾脂質(zhì)體對腫瘤球的生長抑制作用顯著強于單獨修飾脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體。類似地，通過試驗對比證實了 F-TAT-LP 較普通脂質(zhì)體而言，對腫瘤細胞的抑制作用和被細胞攝取的能力亦明顯增強 [20—22]。
藺偉等采用薄膜分散法制備 RGD 肽和 TAT肽共修飾的載 microRNA-34a 脂質(zhì)體 (RGD/TATmiLPs-34a)，荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗顯示 RGD/TATmiLPs-34a 組的腫瘤生長抑制率為 73.7％，遠高于TAT-miLPs-34a 組的 42.6％和 RGD-miLPs-34a 組的39.6％ [26]。經(jīng) RGD 肽和 TAT 肽共修飾能增強脂質(zhì)體的入胞能力，增強載藥脂質(zhì)體對腫瘤細胞增殖的抑制力。
3 PEG 與 CPP、配體結(jié)合類共修飾
PEG 可顯著延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時間，通過增強滲透和滯留 ( enhanced permeability and retention，EPR) 效應(yīng)將藥物蓄積在腫瘤部位，PEG修飾的脂質(zhì)體被廣泛用于納米系統(tǒng)的構(gòu)建 [27—28]。藥物的聚乙二醇化 (PEGylation) 是將活化的 PEG 通過化學(xué)方法偶聯(lián)到藥物的過程，即 PEG 修飾。疏水性的小分子抗腫瘤藥經(jīng) PEG 修飾后，可增加其水溶性 [29]，但 PEG 修飾也減弱了藥物穿透細胞膜的能力，而與細胞穿膜肽的結(jié)合正好可以彌補此項不足 [30]。當(dāng)還原敏感型可斷裂 PEG-TAT 共修飾脂質(zhì)體在腫瘤組織中高度蓄積后，外源性
給予還原劑半胱氨酸 (Cys) 可使 PEG 從脂質(zhì)體表面斷裂脫離，顯著提高了藥物進入腫瘤細胞的效率 [31—32]。
腫瘤細胞外的 pH 值 (6.5 ～ 6.8) 普遍低于正常組織和血液 (pH 7.2 ～ 7.4)，這是由于腫瘤細胞的增殖分化能力強，腫瘤部位供氧不足，使得葡萄糖在缺氧條件下轉(zhuǎn)化為乳酸造成的 [33]。因此可以利用腫瘤組織這一特殊微環(huán)境構(gòu)建 pH 敏感型 PEG 與細胞穿膜肽共同修飾的靶向藥物傳遞系統(tǒng)。文獻報道，當(dāng)預(yù)孵育時間為 2 h 時，腫瘤細胞對 pH 6.5 和pH 6.0 預(yù)孵育條件下的共修飾脂質(zhì)體攝取率是 pH 7.4 預(yù)孵育條件下的 3.8 倍以上 [34—35]。
在聚合物類修飾材料中，PEG 是最為常用的修飾材料。PEG 有 2 個末端羥基可通過化學(xué)鍵與藥物分子間形成不穩(wěn)定的化合物，如 pH 敏感型 PEG、酶敏感型 PEG、氧化-還原敏感型 PEG 等 [29]。將上述配體連在 PEG 長鏈上，可起到靶向性與長循環(huán)的加和作用。岳楓等制備了氧化 - 還原敏感的可斷裂 PEG 與 RGD 肽共修飾脂質(zhì)體 (C/RGD-LP)，粒徑為 (104.8±5.5)nm，z 電位為 (-4.45±1.75)mV，在血清中有良好的穩(wěn)定性 [36]。加入還原劑 Cys 后PEG 斷裂，該組細胞的熒光強度顯著強于未加入Cys 組和無 RGD 肽修飾的普通脂質(zhì)體組 (P<0.01)。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體表面大量 PEG 的存在能夠有效屏蔽 RGD 肽，保持脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
謝黎崖等利用離子交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合的方法制備殼聚糖納米粒 (NPs)，并對 NPs 分別進行了葉酸和 PEG 修飾 [37]。修飾后的 NPs(F-NPs、PEG-NPs 及 F+PEG-NPs) 粒徑不受功能基團修飾的影響，激光共聚焦試驗證明 F+PEG-NPs 能顯著提高細胞對粒子的攝取。F+PEG-NPs 有望成為一種新型的藥物載體，用于抗腫瘤藥對腫瘤細胞的主動靶向。黃微等將肝靶向分子甘草次酸偶聯(lián)至 PEG- 聚乳酸 -羥乙基酸共聚物 (PLGA) 上，采用溶劑揮發(fā)法制備肝靶向納米粒。結(jié)果表示，該納米粒無明顯細胞毒性，且甘草次酸的引入能顯著增加肝癌細胞對納米粒的攝取幾率 [38]。
4 多糖類與配體結(jié)合類共修飾
陳厚翔成功合成了雙配體修飾的殼聚糖 (CTS)材料——乳糖酸化甘草次酸殼聚糖 (GCGA)[43]，并通過體外細胞攝取試驗研究了 BEL-7402 人肝癌細胞對異硫氰酸熒光素 (FITC) 標記的 GCGA、甘草次酸殼聚糖 (GA-CTS) 和 CTS 納米粒的攝取情況。結(jié)果顯示，細胞對雙配體的 GCGA 納米粒的攝取量高于單配體的 GA-CTS 納米粒，并明顯高于無配體修飾的 CTS 納米粒。當(dāng)一種受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用因病理生理條件的影響受阻時，還可以發(fā)揮另一種受體介導(dǎo)的主動靶向作用，從而提高肝癌靶向的可靠性。
人未甲基化寡聚脫氧核苷酸 ( oligodeoxynucleotide，CpG-ODN) 具有激活機體免疫系統(tǒng)的作用，能直接誘導(dǎo)漿細胞樣樹突狀細胞的活化和成熟，單獨應(yīng)用 CpG-ODN 具有抗腫瘤作用 [44]。賴春慧將軟脂酸與甘露糖胺通過脫水縮合反應(yīng)生成甘露糖酯，進而與脂質(zhì)體反應(yīng)制備甘露糖酯修飾的脂質(zhì)體 (mannose-conjugated liposomes，M-Lipo) ；采用后插法將 CpG-ODN 連接至 M-Lipo，得到 M/CpGODN-Lipo，進一步包裹肝癌 H22 細胞裂解物得到脂質(zhì)體 M/CpG-ODN-H22-Lipo[45]。該脂質(zhì)體粒徑為130 nm，呈球形，包封率為 52.9％，可有效抑制肝癌小鼠腫瘤生長并延長其生存時間。
5 其他共同修飾類
PLGA 是聚乳酸、羥基乙酸按不同配比制成的高分子聚合材料，具有良好的生物相容性和緩釋特性，在體內(nèi)的降解產(chǎn)物多以二氧化碳和水的形式排出，對人體無毒、無刺激性，已被廣泛用于抗腫瘤藥物載體的研究中 [46]。王琳等系統(tǒng)綜述了 PLGA作為紫杉醇藥物緩釋載體的研究進展，通過與傳統(tǒng)化療制劑的對比表明，PLGA 利用靜脈注射、間質(zhì)給藥等方式能發(fā)揮更好的抗腫瘤效果 [47]。
此外，PLGA 還能提高肽類和蛋白質(zhì)類藥物的口服生物利用度。Zhu 等采用細胞穿膜肽類 (R8、TAT 和 Pen) 和分泌肽 (secretion peptide，Sec) 分別修飾 PLGA 胰島素納米粒 [48]。與普通納米粒相比，細胞穿膜肽類修飾的 PLGA 納米粒 (Pen-NPs)和二者共同修飾的 PLGA 納米粒 (Sec-Pen-NPs) 顯著提高了胰島素在回腸的吸收率 (1.86 和 3.18 倍 )。CPP-PLGA 納米粒還能幫助胰島素跨越 BBB，這是一種潛在的神經(jīng)退行性疾病的治療載體 [49]。
李宗祥等采用乳化法制備了 Tf 和 RGD 肽共修飾 PLGA 納米粒 (Tf/RGD-NPs)，其粒徑為(113.4±12.5)nm，ζ 電位為 (4.53±2.15)mV [50]。體外細胞攝取試驗表明，黑素瘤 B16 細胞對 Tf/RGDNPs 的攝取效率分別為對 Tf-NPs 和 RGD-NPs 的 2.7和 2.9 倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。結(jié)果顯示，該納米粒具有良好的黑素瘤癌靶向性。
PAMAM 樹狀大分子是一類新型的三維結(jié)構(gòu)高分子材料，具有粒徑大小可控、單分散性、無免疫原性、生物可降解性等特點，其作為藥物載體具有粒徑小、高通透和滯留效應(yīng)強、穩(wěn)定性好、載藥量高等優(yōu)點，通過靶向分子修飾能主動靶向于特定的組織、細胞或某些特定的靶點，達到增效減毒的效果 [51]。
李晶晶等基于 PAMAM 樹狀大分子，通過化學(xué)合成制得葉酸、冰片 (borneol，BO) 共修飾新型納米載體 (F-BO-PAMAM)，并包載抗腫瘤藥 DOX 以達到增加藥物對 BBB 的透過性和提高對腦膠質(zhì)瘤靶向性的目的 [52]。在體外釋放試驗中，分別考察了 F-BO-PAMAM/DOX 在模擬生理環(huán)境 (PBS，pH 7.4) 和腫瘤環(huán)境 (PBS，pH 5.5) 中的釋藥行為。相較于原料藥，F(xiàn)-BO-PAMAM/DOX 釋藥緩慢，在腫瘤環(huán)境下 50 h 內(nèi)累積釋放率達 62.1％。體外跨BBB 轉(zhuǎn)運 180 min 后，DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX 和 F-BO-PAMAM/DOX 的轉(zhuǎn)運率分別為 4.71％、4.82％、14.17％和 13.35％。F-BO-PAMAM/DOX 發(fā)揮了對腦膠質(zhì)瘤的逐級靶向作用。
胡文以第 4 代 PAMAM 為聚合物骨架材料，通過二硫鍵將 PEG 連接在 PAMAM 的表面，合成了不同 PEG 化程度的 PAMAM-SS-PEG 聚合物(PSSP)，然后以 DOX 為模型藥物制備了 PAMAMSS-PEG/DOX(PASS/DOX) 復(fù)合物 [53]。載藥前后其粒徑和 ζ 電位均未發(fā)生明顯變化。體內(nèi)釋放結(jié)果表明，PSSP/DOX復(fù)合物具有明顯的還原和pH敏感性，并且 DOX 的釋放程度隨著 PEG 化程度的增加而增加。作者成功構(gòu)建了集長循環(huán)、主動靶向、還原和pH 敏感釋藥等功能于一體的聚合物釋藥系統(tǒng)。
6 小結(jié)與展望
在修飾納米載體中，對提高靶向性起至關(guān)重要作用的就是修飾材料的選擇。目前，對于選擇修飾材料時仍有以下問題需要考慮 ：① 2 種修飾材料之間及修飾材料與載體之間的偶聯(lián)方法、空間位阻等；② 修飾納米載體的處方組成、藥物的選擇及對粒徑的影響 ；③ 修飾納米載體的載藥量和包封率 ；④修飾納米載體的體內(nèi)和體外靶向性的確定 ；⑤ 修飾納米載體的細胞毒性。與單一材料修飾的納米載體和普通納米載體相比，多種材料修飾的納米載體制備過程更為復(fù)雜。
多種材料結(jié)合共修飾的納米載體已經(jīng)取得了較大的進展，國內(nèi)外學(xué)者從修飾材料的合成、體內(nèi)體外靶向性的檢測到藥物在體內(nèi)釋放時間的測定等方面都取得了較大的進步。多種材料修飾的納米載體可以利用多種靶向功能，增強藥物的入胞和跨越屏障的能力、延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間、使藥物更多地濃集于靶區(qū)，增強靶向性。隨著對修飾材料研究的不斷深入，納米載體的臨床應(yīng)用性也將會更加廣泛。
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