心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，為世界帶來巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,2]. 目前，人工血管作為自體血管的替代物，已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[3~5]. 然而，植入過程中容易造成內(nèi)皮損傷及微生物感染，從而導(dǎo)致內(nèi)膜增生、傷口感染和炎癥浸潤等并發(fā)癥的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了人工血管的臨床應(yīng)用[6~8]. 其中，促進(jìn)人工血管管腔表面內(nèi)皮層的快速形成能夠有效降低內(nèi)皮損傷帶來的風(fēng)險(xiǎn)，而植入過程中的微生物感染則可以通過材料表面抗菌來進(jìn)行有效預(yù)防[9~16]. 因此，研究同時(shí)具有促進(jìn)表面內(nèi)皮化和抵抗微生物感染的多功能生物材料，對(duì)促進(jìn)人工血管的發(fā)展及心血管疾病的治療至關(guān)重要(圖1(a)).
宿主防御肽(HDPs)作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有廣譜的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于抵抗溶液或生物材料表面的微生物的感染[17~19]. 然而，HDPs存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、難以大量制備以及價(jià)格昂貴等缺陷，嚴(yán)重限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[18,20]. 為了克服HDPs的固有缺陷，越來越多的HDPs模擬物被合成并投入到抗菌的研究與應(yīng)用中[21~24]. 其中，β-多肽聚合物具有優(yōu)異的抗菌活性和生物相容性，并且穩(wěn)定性高、易于大量合成且價(jià)格低廉，已被廣泛應(yīng)用于溶液及表面抗菌[25~27]. 此外，我們的前期研究表明，β-多肽聚合物NM40CH60具有優(yōu)異的選擇性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)黏附并抑制平滑肌細(xì)胞(SMC)黏附的功能，在促進(jìn)血管移植物內(nèi)皮化的方向具有較好的應(yīng)用前景[28]. 因此，本研究使用具有促內(nèi)皮化功能的β-多肽聚合物NM40CH60進(jìn)行表面修飾，并對(duì)其表面抗菌活性及抗菌機(jī)理進(jìn)行研究.
熱塑型聚氨酯(TPU)材料具有較高的生物相容性及良好的機(jī)械性能，被廣泛用于人工血管移植物的研究與應(yīng)用[29]. 本文合成了不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60，利用表面等離子體照射和溴代的方式將其接枝于TPU表面，研究其抗菌活性、抗菌機(jī)理及細(xì)胞選擇性黏附功能. 研究發(fā)現(xiàn)，β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面對(duì)革蘭氏陽性菌(MRSA)和革蘭氏陰性菌(E. coli)均表現(xiàn)出廣譜的高效抗菌活性. 此外，聚合度為38 (DP=38，DP表示聚合度)的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面具有優(yōu)異的血液相容性及選擇性促進(jìn)EC黏附的功能. 這些結(jié)果表明，β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面能夠有效降低人工血管植入過程中面臨的感染及內(nèi)皮損傷的風(fēng)險(xiǎn)，在心血管疾病的治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.
1 實(shí)驗(yàn)部分
N,N-二甲基乙酰胺、雙(三甲基硅基)氨基鋰、四氫呋喃、石油醚、三氟乙酸、甲基叔丁基醚、甲醇、無水乙醇、甲苯等試劑購于上海泰坦科技股份有限公司，溴仿購于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司，Triton X-100購于美國Sigma-Aldrich公司，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(SMCM)購于美國sciencell公司，細(xì)胞活死染色試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司.
不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60按照之前文獻(xiàn)報(bào)道中的合成步驟進(jìn)行合成[28].
將TPU基材(1 cm × 1 cm)浸泡于無水乙醇中超聲清洗1 h. 隨后浸泡于2 vol%的吐溫-20溶液中，超聲清洗15 min. 吹干后置于等離子體照射機(jī)內(nèi)，控制腔體內(nèi)氧氣流速為0.3~0.4 MPa，照射功率為70 W，照射時(shí)長為8 min進(jìn)行單面照射，獲得表面帶活性氧基團(tuán)修飾的TPU表面. 隨后將其浸沒于溴化試劑溶液(溴仿/甲苯 = 1/10，V/V)中反應(yīng)6~7 h，甲醇和乙醇交替沖洗，氮?dú)獯蹈桑婵崭稍?4 h，獲得溴代TPU表面(TPU-Br). 最后在TPU-Br表面均勻滴加β-多肽聚合物溶液(80 μL，1 mg/mL). 反應(yīng)12 h后，將表面使用超純水和無水乙醇交替沖洗并氮?dú)獯蹈�，加硫代甘�?80 μL，10 mg/mL)溶液反應(yīng)3~4 h，清洗并吹干后，獲得β-多肽聚合物修飾的TPU表面.
測試β-多肽聚合物修飾的TPU表面對(duì)革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus USA 300 (MRSA)和革蘭氏陰性菌Escherichia coli (E. coli JM109)的抗菌性能，使用菌濃為5×105 CFU/mL. 將β-多肽聚合物修飾的TPU片放置于24孔板中，并使用未修飾的TPU表面作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組. 將每個(gè)表面均勻滴加80 µL的菌液，置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h. 隨后每孔加入1.4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，將孔板超聲2 min并混勻震蕩5 min，確保細(xì)菌從表面脫離. 最后，為了獲得每組樣品的菌落數(shù)，從孔板中取30 µL的細(xì)菌懸浮液使用接種環(huán)進(jìn)行涂布，并將培養(yǎng)皿置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜. 培養(yǎng)后對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中β-多肽聚合物修飾的TPU和TPU表面菌落數(shù)記為Csample，直接加入菌液的空白對(duì)照組記為Ccontrol，表面抗細(xì)菌率通過下式計(jì)算獲得：
TPU-NM40CH60和TPU表面的親疏水性使用水接觸角儀器(JC2000D2，上海中辰數(shù)碼)進(jìn)行表征. 使用Thermo Scientific K-Alpha光譜儀檢測TPU-NM40CH60和TPU表面的光電子能譜(XPS). 該光譜儀配備有AI Kα (1486.6 eV) X射線源，工作電壓為12 kV，真空度為8×10-10 Pa. TPU-NM40CH60的聚合物層厚度使用橢圓偏振儀進(jìn)行表征，聚合物鏈的接枝密度通過σ = (hρNA)/Mn公式計(jì)算獲得，其中h為聚合物鏈的厚度，ρ為聚合物的密度(假設(shè)為1 g/cm3)，NA是阿伏伽德羅常數(shù)(6.023×1023)，Mn是聚合物的數(shù)均分子量(Mn = 4460 g/mol).
將TPU-NM40CH60和TPU表面置于24孔板中并加入1.5 mL PBS浸沒. 在固定時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、6、9、12、15、18和24 h)取出90 µL孔內(nèi)液體作為表面浸出液，再補(bǔ)充等量PBS于孔板內(nèi). 表面浸出液使用熒光胺溶液進(jìn)行測定(10 μL，3 mg/mL 溶于二甲基亞砜中). 與熒光胺溶液共混后避光孵育15 min，使用酶標(biāo)儀在Ex 400 nm和Em 470 nm波長下讀數(shù). 其中，使用1 mg/mL的聚合物溶液作為陽性對(duì)照.
使用場發(fā)射掃描顯微鏡(SEM)觀察TPU-NM40CH60表面的殺菌形貌. 在TPU-NM40CH60和TPU表面上滴加80 µL工作濃度為107 CFU/mL的細(xì)菌懸浮液，在37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h. 隨后，使用4%戊二醛溶液進(jìn)行固定，并4 ℃過夜. 固定后的表面用PBS輕柔沖洗3次，使用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進(jìn)行表面逐步脫水，每次10 min. 最后將樣品放在干燥器中干燥處理，噴金后使用SEM進(jìn)行形貌表征.
將E. coli和MRSA稀釋到5×105 CFU/mL的工作濃度后，取80 µL加入TPU-NM40CH60和TPU表面，并置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 培養(yǎng)0.5、1、1.5、2和2.5 h后，吸取表面菌液并加入裝有2420 µL超純水的15 mL的離心管中，并將TPU-NM40CH60和TPU表面同樣置于15 mL離心管中，超聲3 min后混勻2 min. 隨后將TPU-NM40CH60和TPU表面取出，使用導(dǎo)電儀測量溶液的電導(dǎo)率.
溶血實(shí)驗(yàn)后，使用SEM觀察表面hRBCs的形貌. 將表面用PBS洗3次，使用2.5%的戊二醛溶液固定，置于4 ℃過夜. 隨后，用PBS洗去固定液，并用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進(jìn)行表面逐步脫水，每次10 min. 最后將樣品放在干燥器中干燥處理后噴金，使用SEM進(jìn)行hRBCs形貌表征.
使用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和原代人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HUASMC)進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn). 其中，HUVEC使用ECM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清，1%內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充物和1%青霉素/鏈霉素溶液)進(jìn)行培養(yǎng)，HUASMC使用SMCM培養(yǎng)基(含2%胎牛血清，1%平滑肌細(xì)胞生長補(bǔ)充物和1%青霉素/鏈霉素溶液)進(jìn)行培養(yǎng). 細(xì)胞在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%的匯合后，收集細(xì)胞，以每毫升培養(yǎng)基1.2×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種在表面，每個(gè)表面100 μL. 培養(yǎng)2 h后，將表面浸沒于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h. 使用細(xì)胞活死染色試劑盒(AM/PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照.
細(xì)胞在表面黏附的定量實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞在表面培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)液中加入10%的MTT溶液，在37 ℃避光孵育4 h. 隨后，移除表面的培養(yǎng)基，加入100 μL的二甲基亞砜，輕微晃動(dòng)以溶解細(xì)胞與MTT形成的甲臜晶體. 將溶液后的液體等量轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，使用酶標(biāo)儀讀取570 nm下的OD值.
2 結(jié)果與討論
使用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 和大腸桿菌(E. coli)對(duì)不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面進(jìn)行抗菌活性篩選. 圖2(b)可以看出不同聚合度的β-多肽聚合物修飾的TPU表面均表現(xiàn)出對(duì)MRSA優(yōu)異的抗菌活性，殺菌率分別為98.76%、99.82%和99.29%. 圖2(c)為不同聚合度的β-多肽聚合物修飾的TPU表面對(duì)E. coli的抗菌活性，殺菌率分別為93.32%、99.07%和99.21%. 此外，MRSA和E. coli在LB-ager板上的菌落照片如圖2(d)所示，聚合物修飾的TPU表面上的菌落均遠(yuǎn)少于TPU表面及對(duì)照. 這些結(jié)果證明不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面均具有較強(qiáng)的抗菌活性. 從中，我們優(yōu)選出DP=38的NM40CH60聚合物進(jìn)行后續(xù)研究.
為了進(jìn)一步研究聚合物是否穩(wěn)定接枝于TPU表面，我們將TPU、TPU-NM40CH60浸沒于PBS中在不同時(shí)間點(diǎn)使用熒光胺監(jiān)測溶液中的聚合物濃度變化，結(jié)果如圖3(e)所示. 與對(duì)照相比，TPU- NM40CH60表面的熒光強(qiáng)度無明顯變化，表明該表面具有優(yōu)異的接枝穩(wěn)定性.
3 結(jié)論
本文將促內(nèi)皮化功能的β-多肽聚合物NM40CH60接枝于TPU表面，并研究其抗菌活性及抗菌機(jī)理. 結(jié)果表明，TPU-NM40CH60表面對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌展現(xiàn)出廣譜的接觸殺菌活性. 此外，該表面保持了優(yōu)異的EC選擇性黏附功能，能夠有效降低人工血管植入過程中的感染及內(nèi)皮損傷的風(fēng)險(xiǎn)，在心血管疾病治療領(lǐng)域具有廣闊的研究及應(yīng)用前景.
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