摘要： 該文探討了抗氧化肽SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響, 體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞(H9C2), 給予高糖(30 mmol/L)進(jìn)行刺激, 并利用抗氧化肽SS-31進(jìn)行治療后, 采用Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4和Txnip的表達(dá); 利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime PCR)檢測(cè)Bax、Bcl-2、Nox1、Nox4和Txnip mRNA的表達(dá); 采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察H9C2細(xì)胞凋亡情況; 應(yīng)用MitoSOXTM Red染色檢測(cè)H9C2細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示, 與正常對(duì)照組相比, 高糖組H9C2細(xì)胞凋亡明顯增加, Bax、 Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4和Txnip蛋白表達(dá)明顯上調(diào), Bcl-2蛋白表達(dá)減少, 線粒體ROS產(chǎn)生增加; SS-31治療后能夠抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的凋亡, 下調(diào)Bax、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4、Txnip表達(dá), 上調(diào)Bcl-2表達(dá)并減少線粒體ROS的產(chǎn)生。以上研究結(jié)果提示, 抗氧化肽SS-31抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)抑制Txnip/ROS產(chǎn)生, 表明抗氧化肽SS-31可能對(duì)糖尿病心肌病變具有一定的改善作用。
SS-31(D-Arg-2’,6’-dimethyltyrosine-Lys-PheNH2)是一種新型的線粒體靶向抗氧化肽, 其分子結(jié)構(gòu)中含有二甲基酪氨酸殘基, 具有清除線粒體ROS并且抑制亞油酸和低密度脂蛋白氧化的功能[1]。SS-31可以與線粒體內(nèi)膜上心磷脂相結(jié)合, 調(diào)節(jié)心磷脂在維持線粒體嵴和呼吸鏈超氧復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的作用, 從而增加ATP的產(chǎn)生[2]。此外, SS-31還可以調(diào)控心磷脂與細(xì)胞色素C的相互作用, 從而防止線粒體通透性改變引起的線粒體腫脹, 并且抑制細(xì)胞色素C釋放誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。SS-31可以預(yù)防脂質(zhì)氫過(guò)氧化物誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4], 而且還可以減少缺血再灌注引起的動(dòng)物模型中心肌梗死面積[5]。另外, SS-31還可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的腎損傷。SS-31的這些保護(hù)作用均與其可以清除線粒體ROS有關(guān)。ROS是體內(nèi)細(xì)胞氧化還原平衡失調(diào)產(chǎn)生的病理產(chǎn)物, 細(xì)胞中的ROS主要由線粒體產(chǎn)生, 過(guò)多的ROS可以損傷線粒體膜而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì), 通過(guò)激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。硫氧還蛋白(thioredoxin, TRX)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein , TXNIP)是TRX的一種內(nèi)源性抑制蛋白, TXNIP能通過(guò)與TRX活性位點(diǎn)結(jié)合而抑制TRX的抗氧化應(yīng)激活性, 導(dǎo)致線粒體ROS產(chǎn)生增加[7]。目前有研究表明, SS-31可以抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞凋亡和TXNIP蛋白表達(dá)。但是, 關(guān)于SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究還少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SS-31干預(yù)對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡以及TXNIP/ROS產(chǎn)生的影響。
1 材料和方法
H9C2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)。D-葡萄糖、SS-31和MitoSOXTM試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。兔抗Nox1和Nox4購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。兔抗Bax、Txnip、Bcl-2多克隆抗體和ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。Cleaved caspase-3購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司。TUNEL試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluorid, PVDF)購(gòu)自美國(guó)Milipore公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組刺激實(shí)驗(yàn) H9C2細(xì)胞在低糖型DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)中常規(guī)培養(yǎng)。將H9C2細(xì)胞分為5組: 正常糖對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose, NG)、高滲對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose、24.5 mmol/L mannitol, M)、高糖組(30 mmol/L glucose, HG)、高糖組+溶劑對(duì)照組(30 mmol/L glucose+DMSO, HG+DMSO)高糖+SS-31組(30 mmol/L glucose+10 mmo/L SS-31, HG+ SS-31)。于刺激48 h后收集細(xì)胞, 進(jìn)行以下觀察。1.2.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè) 細(xì)胞接種于6孔板中, 并進(jìn)行分組刺激。具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞核呈綠色者為陽(yáng)性細(xì)胞, 每孔至少計(jì)300個(gè)細(xì)胞, 計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。
1.2.4 Western blot檢測(cè) 細(xì)胞用冰冷生理鹽水洗3遍, 加入細(xì)胞裂解液, 冰上裂解40 min, 4 °C、14 000 r/min離心20 min, Lowry法測(cè)定上清液蛋白濃度。取細(xì)胞裂解蛋白50 μg, 經(jīng)十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h, 分別加入Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Nox1、Nox4及Txnip抗體, 4 °C過(guò)夜, 洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體(1׃10 000稀釋), 37 °C孵育1.5 h; 洗膜后加ECL試劑, 用ODYSSEY遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)(LI.COR Gene Company, USA)顯影。用ImageJ 1.48分析系統(tǒng)軟件(NIH, USA)對(duì)Western blot條帶進(jìn)行半定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。
1.2.5 MitoSOXTM Red染色 細(xì)胞接種于6孔板中, 并進(jìn)行分組刺激。具體實(shí)驗(yàn)步驟按使用說(shuō)明書進(jìn)行。用Leica™ TCS SP8共聚焦顯微鏡采集圖像, 用ImageJ 1.48分析系統(tǒng)軟件(NIH, USA)對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析。以治療組與正常糖對(duì)照組平均光密度值比值作為最終結(jié)果。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x_±s表示, 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 組間比較采用單因素方差分析, P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
3 討論
糖尿病心肌病變是指糖尿病患者伴發(fā)的心肌疾病, 它不能用高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化或其他心臟病變來(lái)解釋。糖尿病心肌病變是在患者代謝紊亂及微血管病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的心肌廣泛灶性壞死, 進(jìn)而引發(fā)一系列心功能異常臨床表現(xiàn)。有研究表明, 一種細(xì)胞程序性死亡方式“凋亡”參與了心肌細(xì)胞壞死過(guò)程, 它是心功能損傷的重要環(huán)節(jié), 與心臟疾病的發(fā)生及心功能恢復(fù)密切相關(guān)[8]。因此, 尋求糖尿病心肌病變中抑制心肌細(xì)胞凋亡的方法將在一定程度上延緩心臟疾病的發(fā)展。
SS-31是一種可滲透性抗氧化劑, 線粒體中SS-31積聚增加可以保護(hù)心磷脂和其他線粒體蛋白免受氧化損壞, 這些保護(hù)作用可能與SS-31抑制線粒體ROS產(chǎn)生有關(guān), 另外SS-31可以逆轉(zhuǎn)各種損傷引起的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)重塑[2]。SS-31不僅可以維持線粒體結(jié)構(gòu)完整, 而且在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂質(zhì)沉積、自噬、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[9]。目前關(guān)于SS-31治療心肌病變的研究也有報(bào)道。SS-31治療心肌缺血再灌注大鼠, 可以有效減少梗死面積, 降低心律不齊的嚴(yán)重程度。但是SS-31治療糖尿病心肌病的作用仍不清楚。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, HG能夠誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡, 上調(diào)心肌細(xì)胞中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá), 同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá), SS-31治療后可以逆轉(zhuǎn)高糖引起的這些變化。這提示, SS-31可能通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡而改善糖尿病心肌病變。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致, SS-31可以通過(guò)保護(hù)線粒體功能, 預(yù)防肥胖小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10]; 減少胰島細(xì)胞凋亡從而改善胰島移植后功能[11]; 減少缺血再灌注引起的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[4]; 抑制糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡[7]。這些結(jié)果均說(shuō)明, SS-31在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能, 但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
ROS水平增加會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性, 能夠?qū)е录?xì)胞凋亡和壞死[12]。ROS在線粒體氧化呼吸鏈上產(chǎn)生, 需要NADH進(jìn)行電子傳遞, 并被NADPH酶消除。除線粒體外, 心肌細(xì)胞中ROS還可以來(lái)源于NADPH氧化酶、一氧化氮合酶、單胺氧化酶A和黃嘌呤氧化酶等作用產(chǎn)物[13]。目前研究表明, Nox1和Nox4是心肌細(xì)胞中主要表達(dá)NADPH氧化酶, 在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用, 也是目前常用的估算心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)[14]。SS-31可以清除細(xì)胞線粒體中產(chǎn)生的ROS, 從而改善氧化應(yīng)激引起的各種細(xì)胞損傷。我們的結(jié)果顯示, 抗氧化肽SS-31能夠少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Nox1和Nox4表達(dá), 并減少線粒體ROS產(chǎn)生。表明抗氧化肽SS-31可以調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。線粒體ROS產(chǎn)生增加可以增加線粒體膜Ca2+通道的開(kāi)放性, 使得細(xì)胞膜通透性增加, 細(xì)胞色素C釋放而引起細(xì)胞凋亡[15]。據(jù)此, 我們推斷, SS-31保護(hù)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡可能通過(guò)減少線粒體ROS實(shí)現(xiàn)。但兩者之間是否存在明確關(guān)系, 仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
Txnip是一種硫氧還蛋白相互作用蛋白, Txnip從TRX解離后響應(yīng)氧化應(yīng)激而影響多種細(xì)胞生物學(xué)行為, 如凋亡、轉(zhuǎn)分化[16]和自噬[17]。有研究表明, 在Txnip小干擾RNA轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中, 細(xì)胞活力得到改善, ROS產(chǎn)生減少, 并伴隨著過(guò)氧化氫酶和MnSOD的表達(dá)增加。此外, Txnip小干擾RNA轉(zhuǎn)染可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18], 在敗血癥誘發(fā)的心肌功能障礙中發(fā)揮重要作用。另有研究表明, 高糖刺激可以減少細(xì)胞中TRX和Txnip之間的相互作用, 但增加了NLRP3和Txnip之間的相互作用, 這些改變可被抗氧化劑MitoQ治療逆轉(zhuǎn)[19]�；谶@些觀察結(jié)果, 我們猜測(cè), 暴露于高糖環(huán)境下的H9C2細(xì)胞中也可能發(fā)生類似事件。為支持這一假設(shè), 我們進(jìn)行了下一步實(shí)驗(yàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 高糖刺激增加ROS產(chǎn)生的同時(shí)Txnip表達(dá)也明顯增加, 而且抗氧化劑SS-31治療后減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Txnip表達(dá)。目前研究表明, Txnip在高糖誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡中都發(fā)揮重要作用, 如胰島β細(xì)胞、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等[20]。這些研究提示, Txnip在調(diào)節(jié)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡中可能也具有重要作用, 但具體作用仍需進(jìn)一步研究。
綜上所述, 抗氧化肽SS-31抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí), 抗氧化肽SS-31抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞Txnip/ROS產(chǎn)生。我們的研究結(jié)果提示, 抗氧化肽SS-31對(duì)糖尿病心肌病變具有一定的保護(hù)作用, 對(duì)臨床糖尿病心肌病變的治療具有一定的意義。
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