摘要：生物分子參與生命體的整個生命活動周期, 對其進行定量分析是深入研究其生物合成、信號通路和生物與非生物脅迫反應(yīng)分子作用機制所關(guān)注的重要問題. 盡管同位素稀釋法以其在絕對定量分析結(jié)果精準方面的優(yōu)勢在生物分子定量分析領(lǐng)域得到廣泛認可, 但受到同位素內(nèi)標化合物的限制無法得到廣泛應(yīng)用. 近 10 年來同位素標記技術(shù)得到迅猛發(fā)展, 尤其在定量蛋白質(zhì)組、代謝組研究領(lǐng)域. 蛋白質(zhì)、多肽和其他生物小分子能夠通過細胞或組織培養(yǎng), 或者利用化學(xué)手段, 通過對特定官能團的化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)同位素標記, 如細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(SILAC), 15N/14N 及相對和絕對定量同位素標記技術(shù)(iTRAQ)等實現(xiàn)同位素標記, 并結(jié)合色譜/質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)目標生物分子的定量分析. 本文對上述同位素標記技術(shù)的優(yōu)缺點進行了系統(tǒng)論述和比較. 基于高效、高通量和低成本同位素標記技術(shù)的生物分子相對定量研究是未來的發(fā)展方向, 也是深入了解各種生命現(xiàn)象分子作用機制的重要手段.
生物分子定量分析是生物學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的重要研究內(nèi)容, 通過對參與調(diào)控生物生長發(fā)育過程的蛋白、多肽及重要的信號分子進行定量分析, 可以深入了解生物系統(tǒng)發(fā)揮作用的分子機制, 同時, 在復(fù)雜生物基質(zhì)條件下準確獲取這些極低含量重要生物分子的定量分析結(jié)果也是分析科學(xué)家所面臨的重大挑戰(zhàn).
目前, 隨著質(zhì)譜(MS)技術(shù)的發(fā)展和普及, 基于MS 技術(shù)的定量分析方法日益成為生物分子量化關(guān)系研究的主流. MS 分析法的基本原理是利用離子化技術(shù), 將物質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子, 按其質(zhì)荷比 m/z 的差異進行分離測定, 從而對研究體系進行定性或者定量分析[1]. 利用 MS 對不同 m/z 離子的區(qū)分和檢測能力, 所建立的基于同位素標記內(nèi)標化合物的同位素稀釋法(isotope dilution)和基于同位素標記技術(shù)的相對定量分析方法能夠?qū)δ繕松锓肿舆M行定量分析. 前者是通過向分析體系中直接施加穩(wěn)定同位素(15N, 13C, 2H, 34S 和 18O 等)標記的目標化合物, 將其作為內(nèi)標, 然后比較內(nèi)源性目標化合物與內(nèi)標化合物的 MS 響應(yīng)來實現(xiàn)目標物質(zhì)的絕對定量; 后者是通過對生物樣品及對照組分別予以輕質(zhì)同位素和重質(zhì)同位素分別進行標記, 然后比較不同標記形式的目標化合物在兩組樣本中的 MS 響應(yīng)差異來實現(xiàn)相對定量.
同位素稀釋法中所使用的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標化合物與待分析的內(nèi)源性生物分子其結(jié)構(gòu)完全相同, 具有幾乎完全相同的物理化學(xué)性質(zhì), 是一種準確可靠的絕對定量分析方法. 但是, 由于穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標化合物合成困難, 其使用受到很大限制, 在實際應(yīng)用中難以普及[2~5]. 近年來, 為了擺脫對同位素標記內(nèi)標化合物的依賴, 一些研究小組嘗試利用體內(nèi)(in vivo)或體外(in vitro)手段同位素標記方法, 對相應(yīng)的生物樣本及其對照組分別進行重質(zhì)和輕質(zhì)同位素標記, 然后利用色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對分別標有重質(zhì)同位素和輕質(zhì)同位素的目標組分進行比較, 確定樣品組和對照組中生物分子的相對含量變化. 這種基于同位素標記技術(shù)的相對定量分析方法, 不僅能夠克服同位素稀釋法對于同位素內(nèi)標化合物的依賴, 還具備標記對象的廣泛性, 能夠系統(tǒng)性地對生物模型中某類具有相同標記反應(yīng)特性的內(nèi)源性生物分子進行相對含量比較, 因此有著更為廣泛的應(yīng)用前景.
目前, 生物分子相對定量分析中所用到的同位素標記手段主要包括穩(wěn)定同位素標記和放射性同位素標記兩大類, 穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labels, SIL)是利用非放射性的穩(wěn)定同位素對代謝途徑或體內(nèi)發(fā)生的生化反應(yīng)進行標記, 并與非放射性的普通同位素標記的組分進行比較分析, 確定相對含量變化; 放射性同位素標記是利用放射性同位素對上述生理過程及中間體進行標記, 利用對放射性同位素衰變后所發(fā)出的輻射強度進行測量來對標記物進行檢測分析. 受到放射性同位素使用安全性的限制, 穩(wěn)定同位素標記技術(shù)在生物分子相對定量分析領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛. 穩(wěn)定同位素標記依據(jù)引入途徑、引入階段和標記試劑的特點可以分為以下 3 類: (1) 根據(jù)引入途徑, 分為 3 種: 代謝標記、酶解引入、化學(xué)標記[6,7]; (2) 根據(jù) SIL 引入的階段, 分為 2 種: 體內(nèi)標記和體外標記. 體內(nèi)標記指代謝標記, 體外標記包括酶解引入、化學(xué)標記等; (3) 根據(jù) SIL 本身分子量是否相同, 可分為 2 類: 質(zhì)量差異標簽(mass difference tags[8])和等質(zhì)量標簽(isobaric tags[9]). 其中, 使用前者的標記方法稱為差異同位素標記(differential isotope labeling, DIL[10]).
同位素標記技術(shù)的主要應(yīng)用對象是生物大分子, 但近年來在生物小分子定量分析領(lǐng)域也取得積極進展. 例如, 通過衍生化手段, 可對目標小分子化合物的氨基或羧基等官能團進行同位素標記, 借助所引入的同位素標簽, 不但能實現(xiàn)上述生物分子的相對定量分析, 更為提升部分目標化合物的檢測靈敏度提供可能. 本文根據(jù)同位素標簽引入途徑的不同, 重點對近年來發(fā)展的穩(wěn)定同位素標記技術(shù)的原理在相對定量分析研究中所取得的進展及最新發(fā)展動態(tài)進行綜述.
1 體內(nèi)標記(in vivo)
體內(nèi)標記又稱代謝標記, 主要是通過細胞或者生物體(主要是指簡單的生物體)正常的生長代謝實現(xiàn)目標生物分子的穩(wěn)定同位素標記, 其操作簡便、高效、相對準確. 該方法的優(yōu)點是: 由于穩(wěn)定同位素的引入是在細胞或生物體生長過程及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換中引入, 對蛋白質(zhì)樣品標記較完全. 樣品組和對照組樣品可以在單獨收集后直接合并進行后續(xù)的樣品處理液質(zhì)分析, 重質(zhì)和輕質(zhì)同位素標記的同一蛋白質(zhì)互為內(nèi)標, 避免了在樣品標記、處理及分析等過程出現(xiàn)的誤差, 因而確保了相對定量結(jié)果的準確性[11]. 它是最早被引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的同位素標記技術(shù). 而其主要缺點是要求該方法的生長條件精細可控, 由于受到飼喂條件限制, 主要適用于較為簡單的單細胞生物體, 如細菌、酵母及細胞培養(yǎng)體系的蛋白質(zhì)相對定量研究, 不適用于復(fù)雜組織、器官的樣品分析. 雖然隨著研究的深入, 代謝標記技術(shù)也逐步在多細胞生物體系中得以應(yīng)用, 如新桿狀線蟲、黑腹種果蠅[12]、大鼠[13]、小鼠[6]和植物[14~17]中, 但實驗難度大幅增加.
通過控制生物培養(yǎng)體系中的 14N/15N 來源, 可實現(xiàn)對生物樣品及其對照組分別進行系統(tǒng)性的 14N 和15N 標記, 用于比較含 N 生物分子的相對含量變化. Oda 等人[18]首先將該方法應(yīng)用到酵母實驗中, 將兩組酵母分別在含有 14N 和 15N 同位素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng), 然后將在這兩種不同培養(yǎng)基中的酵母細胞等量混合、處理, 并對目標肽段進行提取, 通過比較MS 圖中特征性同位素峰對(經(jīng) 14N 和 15N 標記的肽段)的峰強度的比值來確定不同生長條件下蛋白質(zhì)表達的差異. 隨后, Conrads 等人[19]用 15N 代謝標記技術(shù)結(jié)合半胱氨酸親和標簽分別對異常球菌屬和鼠的 B16黑毒瘤細胞中含有半胱氨酸的肽段進行定量研究.
14N/15N 標記技術(shù)最初只能應(yīng)用于對簡單的單細胞生物和體外培養(yǎng)細胞的標記上, 后逐步擴大到多細胞生物體研究上. Ippel 等人[20]和 Krijgsveld 等人[12]先用標記氨基酸飼喂細菌或酵母作為多細胞生物(果蠅和線蟲)的飼料, 間接地將同位素標簽引入到多細胞生物的蛋白質(zhì)中, 最終比較了新桿狀線蟲和黑腹種果蠅的蛋白表達水平的差異. Wu 等人[13]從整體水平上對哺乳動物組織的蛋白質(zhì)進行定量, 該方法可以檢測出對藥物有反應(yīng)時蛋白組部分的改變, 對于利用此動物模型進行疾病研究具有積極意義. 利用穩(wěn)定同位素標記小鼠和大鼠對結(jié)腸腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究過程, 證明了用嚙齒動物模型研究人類相關(guān)疾病的可行性[6].
在植物學(xué)研究領(lǐng)域, 可通過控制含 15N(或 14N)無機鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織(植株), 對實驗體系進行同位素標記, 實現(xiàn)含氮生物分子的相對定量分析, 這種標記策略已被用于擬南芥細胞的細菌響應(yīng)鞭毛蛋白 flg22, 木聚糖酶[21]以及鎘脅迫條件下質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的差異研究中. Lanquar 等人[15]通過 15N/14N 代謝標記的方法對擬南芥細胞進行同位素標記后, 研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過鎘接觸的擬南芥細胞與未經(jīng)過鎘接觸的擬南芥細胞的細胞質(zhì)膜蛋白相比有 5倍的上增性調(diào)節(jié). Hebeler 等人[11]用 15N/14N 標記的方法對擬南芥早期的衰老葉片中的蛋白變化進行定量分析. 他們用 2D-DIGE和 15N代謝標記技術(shù)揭示了擬南芥葉片衰老過程中的 21 個差異表達蛋白質(zhì)點(12種蛋白質(zhì)). Kline 等人[17]也對植物激素 ABA 誘導(dǎo)的擬南芥體內(nèi)蛋白磷酸化進行了研究.
然而, 研究發(fā)現(xiàn)富含同位素的培養(yǎng)基一定程度上會影響細胞的正常生長, 對某些生物體系進行代謝標記存在難度, 難以獲取可靠的相對定量分析結(jié)果; 同時, 代謝標記過程中, 如果發(fā)生不完全標記, 則會造成標記和非標記生物分子質(zhì)量差值不可預(yù)測, 加大 MS 譜圖解析難度并影響定量結(jié)果的準確性[22].
為了克服上述標記策略的不足, Ong 等人[23]在細胞培養(yǎng)過程中將穩(wěn)定同位素標記的氨基酸直接添加至細胞培養(yǎng)體系中, 利用細胞培養(yǎng)體系對氨基酸的代謝吸收, 實現(xiàn)該體系的同位素標記, 后經(jīng)分離、酶解等步驟, 再結(jié)合后續(xù)的 MS 技術(shù)能夠?qū)Φ鞍妆磉_進行相對定量分析, 所建立的方法稱之為細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC) (圖 1). 由于該技術(shù)通過細胞的正常生長代謝將穩(wěn)定同位素標記的氨基酸引入到蛋白質(zhì)中, 這就大大簡化 MS 定量分析前人工處理的復(fù)雜度 . 目 前 , 通 過 SILAC 技 術(shù)可實現(xiàn)細胞培養(yǎng)體系的 2H,13C 以及 15N 等穩(wěn)定同位素的標記.
Ibarrola 等人[24]通過賴氨酸標記的方法比較兩株不同前列腺癌細胞系表達的微粒體差異蛋白, 鑒定了 1000 個蛋白質(zhì), 也發(fā)現(xiàn)了多種與前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移表型相關(guān)的新蛋白, 這是首次利用 SILAC 技術(shù)對兩種細胞系進行的比較研究, 為前列腺癌的早期診斷奠定了實驗基礎(chǔ). Gruhler 等人[25]還將 SILAC 技術(shù)應(yīng)用到植物蛋白組學(xué)的研究中, 通過標記擬南芥細胞, 分析由于水楊酸的刺激而引起的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的表達變化, 實驗證明可以利用此技術(shù)對植物細胞的復(fù)雜生物過程進行研究.
由于 SALIC 依靠在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸(如賴氨酸或精氨酸等)實現(xiàn)穩(wěn)定同位素標記和相對定量分析, 因此更適用于基于培養(yǎng)的細胞體系以及簡單的單細胞生物體系, 對于代謝周期長、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的動物及人體組織樣本, SALIC技術(shù)的實際應(yīng)用受到很大限制; 同時, 考慮到植物細胞本身可以合成這些必需氨基酸, 植物細胞體系進行 SALIC 標記時, 會發(fā)生標記不完全的現(xiàn)象, 因此SALIC 技術(shù)方法不適合于植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究. 而15N/14N 標記能夠彌補 SALIC 方法的不足. 值得注意的是, Zhang 等人[26]研究發(fā)現(xiàn), 如果采用基于 2H/H 同位素體系的 SILAC 技術(shù)進行同位素標記時, 氘標記目標組分存在同位素效應(yīng), 在色譜分離過程中其保留時間會發(fā)生輕微改變, 從而影響最終分析結(jié)果的準確性. 此外, 還有利用 13C[27]和 34S[28]等同位素進行體內(nèi)標記的研究報道.
2 體外標記(in vitro)
與利用生物體生長代謝實現(xiàn)同位素標記的體內(nèi)標記技術(shù)不同的是, 體外標記技術(shù)采用化學(xué)手段在樣品取材后的處理過程中實施目標生物分子的同位素標記, 主要包括酶解標記和化學(xué)標記 2 大類. 酶解標記是在蛋白質(zhì)酶解過程中加入含有穩(wěn)定同位素的試劑, 將含有重同位素基團或者分子引入到蛋白質(zhì)或者肽段中, 主要適用于蛋白質(zhì)等大分子. 化學(xué)標記需要根據(jù)目標生物分的特定官能團結(jié)構(gòu)特點, 通過人工設(shè)計合成能夠與之發(fā)生專屬性化學(xué)反應(yīng)的穩(wěn)定同位素標記的衍生化試劑, 實現(xiàn)同位素標記, 該策略能夠?qū)崿F(xiàn)對蛋白質(zhì)、肽段或其他小分子的標記, 較酶解標記使用領(lǐng)域更為廣泛.
相對如上的體內(nèi)標記來說, 體外標記有如下優(yōu)點: (1) 所使用的穩(wěn)定同位素標記試劑易于合成且相對便宜; (2) 可供選擇的標記位點多, 可通過分子設(shè)計, 合成特異性標記羧基、氨基和巰基等多種基團的同位素標記試劑; (3) 部分目標分子經(jīng)體外標記后, 所引入的分子片段(分子標簽)能夠改善目標化合物的色譜保留行為, 降低基質(zhì)效應(yīng)干擾, 并能提升離子化效率, 提高 MS 響應(yīng); (4) 體外標記技術(shù)適用范圍廣, 可廣泛適用于所有蛋白質(zhì)樣品(包括人體的組織、器官、體液等)和小分子化合物.
盡管體外標記技術(shù)優(yōu)勢明顯, 但與體內(nèi)標記技術(shù)相比, 同位素標記步驟發(fā)生在樣品處理階段, 無法徹底消除或避免樣品前處理步驟(如組織研磨、提取、及混勻前)所引入的實驗誤差, 從而影響結(jié)果的準確度. 同時, 在生物大分子標記過程中, 會發(fā)生標記不完全的現(xiàn)象, 僅有含特定官能團的肽段可以被標記, 導(dǎo)致肽譜覆蓋率下降[29]. 需要注意的是, 有些標記反應(yīng)是可逆的, 會對相對定量分析的結(jié)果帶來負面影響[30], 標記反應(yīng)也會引入副產(chǎn)物及未完全反應(yīng)的標記物, 噪音增加, 增加了譜圖解析的難度. 上述特點是在實施體外同位素標記實驗過程中需要特別加以注意的.
2.1 酶解標記
(ⅰ) 18O/16O-H2O. 蛋白質(zhì)樣品發(fā)生胰蛋白酶酶解反應(yīng)時, 反應(yīng)體系中 H2O 的 O 會與酶解肽段 C 末端羧基中的 2 個氧原子發(fā)生交換反應(yīng), 當對照組和實驗組的蛋白樣品分別在 18O-H2O 和 16O-H2O 中進行酶解反應(yīng)時, 經(jīng)過酶解標記, 所得到的對應(yīng)肽段在分子量上會相差 4 Da, 通過比較一級 MS 譜圖中肽段的峰強度或峰面積, 實現(xiàn)肽段的相對定量. 18O 標記法定量具有較高的準確性、且標記效率高; 可以標記多種不同類型的樣品, 對樣品類型沒有局限性, 如組織、尿樣、血清等; 該方法中所采用的 18O/16O 標記策略不會改變肽段的物理性質(zhì), 不會產(chǎn)生重同位素標記肽段的色譜峰漂移.
Yao 等人[30]首先將 18O 標記法應(yīng)用到定量蛋白質(zhì)組學(xué)上, 通過對不同血清型的腺病毒進行研究, 證明了該方法的可行性. Smith 課題組[31]用 18O 標記法研究人的乳腺上皮細胞, 有 603 個蛋白被鑒定及定量. Rao 等人[32]發(fā)現(xiàn), 在他們所使用的 Lys-N 酶解 18O 的標記方法, 確定只結(jié)合了 2 個 18O 原子, 提高了標記效率, 能夠同時鑒定 584 種蛋白質(zhì)并對其中的 562 種蛋白質(zhì)進行相對定量分析. 利用反轉(zhuǎn)標記(inverse labeling), Wang 等人[33]通過對兩組樣品進行 18O/16OH2O和16O/18O-H2O體系分別進行酶解標記, 然后分別混合進行 MS 鑒定. 兩組正反雙向標記實驗進一步驗證了 18O/16O-H2O 酶解標記策略的可行性, 并使此方法對體系復(fù)雜程度的耐受性大大增加. 但當標記后樣品進行混合后容易發(fā)生標記物 18O-16O的交叉互換, 影響相對定量結(jié)果的準確性. 為此, 必須對混合樣品快速鑒定分析, 盡量消除交叉互換對結(jié)果的影響.
(ⅱ) 整體內(nèi)標技術(shù). Chakraborty 和 Regnier[34]針對蛋白質(zhì)樣品酶解肽段的初級胺, 使用 2H3/H3- NAS 試劑對酶解肽段進行衍生化, 實現(xiàn)同位素標記, 并命名為整體內(nèi)標技術(shù)(global internal standard technology, GIST). 與 18O/16O-H2O 酶解標記技術(shù)相比, GIST 中的酶解步驟與同位素標記步驟分開進行, 但在本文中仍歸類于酶解標記類別, 作者利用此方法對大腸桿菌中的過表達的-半乳糖苷酶進行了鑒定和定量分析. 但是, 此方法在自動批量化分析體系中存在一定的困難, 這主要是 2H3/H3-NAS 可以標記必需氨基酸和肽段的 N 末端, 對于存在多個乙�；稽c的肽段, 會造成質(zhì)量差的不固定(3~13 Da), 對定量分析結(jié)果產(chǎn)生影響. 另外, 用 13C/12C-NAS 代替2H/1H-NAS, 可消除重氫在液相分離中存在的同位素效應(yīng). 此技術(shù)也在蛋白質(zhì)修飾研究中有很多報道[35].
2.2 化學(xué)標記
同位素標簽衍生化技術(shù) (stable isotope coded derivatization, ICD)[36]可以將不同同位素標記形式的質(zhì)量差異標簽引入目標組分進行相對定量分析, 其基本原理是: 將一種同位素標簽與一份樣品衍生化反應(yīng), 另外一個質(zhì)量差異的標簽需要與另外一種樣品衍生化, 然后將同時被輕質(zhì)同位素和重質(zhì)同位素標記的樣品按比例混合后用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)分析, 最后根據(jù)被不同同位素標記的分析物產(chǎn)生離子對的峰面積比值對樣品中的待測組分進行相對定量分析. 利用同位素標簽衍生化技術(shù), 可以對含有相同功能基團的系列組分實現(xiàn)同位素標記, 是解決多組分代謝相對定量分析的有效方法. 尤其適用于對復(fù)雜基質(zhì)樣品里的目標成分進行準確地定量分析, 需要說明的是, 如果一組樣品是已知濃度的標準品, 那么就可以用這種方法對樣品中的待測組分進行絕對定量, 其工作流程見圖 2.
選擇合理的 ICD 試劑需要符合以下要求: ICD 試劑要易于合成, 并且能夠以較低成本實現(xiàn) ICD 試劑中的同位素替換; 對目標官能團可實現(xiàn)特異性衍生化標記, 并且反應(yīng)效率一致; 同時, 衍生化反應(yīng)條件溫和, 不破壞體系中內(nèi)源性目標化合物的存在形式; 衍生化產(chǎn)物能有效地離子化以實現(xiàn) MS 檢測; 被“輕” “重”同位素試劑標簽標記的分析物色譜行為一致, 能夠有效地降低保留時間飄移帶來的基質(zhì)效應(yīng)影響.
目前, 穩(wěn)定同位素標記技術(shù)不僅在蛋白和多肽定量分析研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用, 還逐步應(yīng)用于重要的小分子化合物領(lǐng)域, 如胺類、羧酸類等. 下面將分別對蛋白質(zhì)、多肽和小分子化合物的同位素化學(xué)標記技術(shù)的發(fā)展進行評述.
(ⅰ) ICAT技術(shù). 1999年, Gygi等人[29]利用其發(fā)明的同位素親和標簽(isotope-coded affinity tag, ICAT)技術(shù)對酵母蛋白質(zhì)組進行了系統(tǒng)研究分析, 比較了在不同碳源生長條件下的酵母細胞中蛋白質(zhì)表達水平上的相對表達量差異, 并對其進行確證. 該技術(shù)中所采用的 ICAT 試劑主要由 3 部分組成: 第一部分是由生物素構(gòu)成的親和標簽, 用于分離經(jīng) ICAT 標記后的肽段; 第二部分是用來引入穩(wěn)定同位素的連接子; 第三部分是用來特異結(jié)合肽段中半胱氨酸殘基的巰基的活性反應(yīng)基團. 試劑分為兩種形式: 一種是被重質(zhì)同位素(連接子含有 8 個氘, d8)標記, 另一種是被輕質(zhì)同位素(連接子含有 8 個氫, d0)標記, 而由 8 個氘原子和 8 個氫原子分別標記的 ICAT 質(zhì)量正好相差 8 Da (圖 3). 同位素標簽被引入標記對象后, 利用 MS 對兩種標記形式的肽段進行響應(yīng)強度比較, 確定其相對含量變化. ICAT 技術(shù)發(fā)明后, 陸續(xù)有多項研究采用了此項技術(shù). Jenkins 等人[37]用該技術(shù)對微粒體代謝酶細胞色素 P450 進行了相對及絕對定量研究 . Griffrin 等人[38]用 ICAT 技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-QTOF-MS)對酵母細胞的蛋白組變化進行定量分析, 闡明了此項技術(shù)在相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)用中的有效性.
作為質(zhì)量差異標簽的代表, ICAT 試劑出現(xiàn)解決了困擾已久生物分子定量分析的難題, 只需對含半胱氨酸殘基的肽段進行分析即可獲取目標生物分子的相對含量信息, 降低了分析的復(fù)雜性, 標記后的肽段能夠耐受多種生化和物理的分離方法, 可以分析來自不同細胞、組織、體液等絕大部分蛋白質(zhì), 具有良好的兼容性, 一經(jīng)報道即引起廣泛關(guān)注并得到廣泛應(yīng)用. 但是需要注意到是, ICAT 技術(shù)也存在一些缺點: 無法分析不含半胱氨酸的蛋白質(zhì); 生物素-同位素結(jié)合標簽質(zhì)量過大, 進行 MS 分析時, 保留在肽段上的標簽會使得分析過程復(fù)雜化, 會影響肽段檢測; 過量標記或者內(nèi)源生物素都會由于彼此的競爭而影響親和的效率等
(ⅱ) TMT 技術(shù). 為了解決 ICAT 技術(shù)的缺點, Thompson 等人[39]合成了 TMT(tandem mass tags)標簽, 首次合成的 TMT2 和 TMT6 是最早的商業(yè)化的等質(zhì)量標簽(isobaric tags), 由于 TMT 試劑主要采用 13C 進行標記, 合成步驟多、價格昂貴, 而且產(chǎn)率較低, 實驗成本較 ICAT 高. 在此基礎(chǔ)上, Dayon 等人[40]又合成了第二代 TMT 標簽, 雖然產(chǎn)率有所提高, 但是合成步驟仍然有 7 步之多, 價格仍然昂貴, 使其使用受到限制, 目前商業(yè)化的 TMT 分子結(jié)構(gòu)如圖 4 所示. TMT由質(zhì)量報告區(qū)(mass reporter region, M)、可裂解連接區(qū) (cleavable linker region, F)、質(zhì)量平衡區(qū) (massnormalization region, N)和蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(protein reactive group, R)4部分構(gòu)成, 其 R部分能夠特異性地結(jié)合肽段的-NH2 基團, 在對多組蛋白質(zhì)樣品進行相對定量分析時, TMT 試劑特有的 M-F-N-R 的結(jié)構(gòu)特征能夠使得不同同位素標記形式的目標分子具有完全相同色譜行為和一級 MS 特征, 通過二級質(zhì)譜(MS/MS)掃描, 不同標記形式的目標肽段在 F 區(qū)域發(fā)生解離, 形成不同的報告離子, 通過比較報告離子的強度, 即可確定不同來源樣本中目標蛋白的相對含量變化.
iTRAQ 技術(shù)優(yōu)勢明顯, 所涉及的報告離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(m/z 114~117)的峰, 這些分布在低質(zhì)荷比區(qū)域的報告離子易于與分布于高質(zhì)荷比區(qū)域的普通肽段離子進行區(qū)分, 其相對定量分析結(jié)果更為直接和清晰. iTRAQ 標記作為等質(zhì)量標簽同位素標記技術(shù)的代表, 自其開發(fā)以來, 以自身獨特的優(yōu)勢在蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究中得到廣泛應(yīng)用 , 通過對iTRAQ 試劑加以改進, 已可同時對多達 8 種樣品進行相對定量分析, 應(yīng)用范圍得到進一步擴大. 但是, iTRAQ 試劑較為昂貴, 會大幅增加研究成本; 同時, 由于 iTRAQ 試劑幾乎能與樣本中所有蛋白結(jié)合, 所以容易受到樣本中一些蛋白質(zhì)雜質(zhì)的影響, 故需要對樣本進行預(yù)處理, 盡量減少污染帶來的影響, 這無疑會增加實驗的操作難度.
(ⅳ) TMAB 技術(shù). 考慮到 ICAT 試劑無法對不含半胱氨酸的蛋白或肽段進行定量, 而 iTRAQ 試劑的標記位點是 N 末端以及賴氨酸的-NH2 部分, 上述兩種技術(shù)都不能實現(xiàn)對所有肽段或蛋白的定量分析, 據(jù)此 Che 和 Fricker[44]設(shè)計了可針對所有含氨基的蛋白或肽段進行同位素標記和定量分析的標簽試劑 4-三甲基丁酰胺(4-trimethylammoniumbutyryl, TMAB), 結(jié)構(gòu)如圖 6 所示. 用 D 和 H 標記的試劑對肽段或蛋白可以進行定量分析. 利用 TMAB 能夠彌補 ICAT 和iTRAQ 技術(shù)的不足.
(ⅴ) DiLeu 技術(shù). Xiang 等人[45]在 iTRAQ 和TMT 標簽的基礎(chǔ)之上合成了 N,N-二甲基亮氨酸(N,N- dimethyl leucine, DiLeu)-4 叢標簽, 也是等質(zhì)量標簽的一種. 這種標簽主要結(jié)合肽段的賴氨酸側(cè)鏈N 末端以及-氨基酸基團, 包括平衡子和報告子, 結(jié)構(gòu)如圖 7 所示, 此技術(shù)基本保持了 iTRAQ 試劑的基本性質(zhì), 而優(yōu)點是合成步驟簡便、標記效率高, 并且與之前的等質(zhì)量標簽比較碎裂效率明顯增強, 費用也不高, 與現(xiàn)在的商業(yè)化標簽試劑 TMT 和 iTRAQ 相比有其獨特的優(yōu)勢. 這對以后的一些多標簽在蛋白和肽段方面的定量研究提供了新的思路.
(ⅵ) DiART 技術(shù). DiART(deuterium isobaric amine reactive tag, 氘代等質(zhì)量氨基反應(yīng)標簽)技術(shù)是Zhang 等人[46]針對 iTRAQ 標簽在復(fù)雜生物樣品中的蛋白相對定量分析過程中會產(chǎn)生偏差的缺陷而設(shè)計的等質(zhì)量標簽同位素標記技術(shù); 同時, DiART 試劑(圖 8)的 2H 標記僅需 5 步就可以合成, 且標記效率可高達 97%, 產(chǎn)率也可達到 40%, 解決了 TMT 和iTRAQ 等試劑合成過程中采用 13C 和 15N 標記所帶來的成本過高問題. 具備 6-plex特征的 DiART試劑, 能夠同時對 6 種蛋白質(zhì)樣品展開分析, 極大地擴大了DiART 技術(shù)的應(yīng)用范圍. 這種新研發(fā)的 DiART 試劑主要針對胺基, 既可用于大分子蛋白, 也可用于小分子胺類, 由于 DiART 試劑具備系列化的同位素標簽形式, 也可用于多組樣品的比較研究.
(ⅶ) 胺類、氨基酸、酚類化合物的同位素標記. 胺類和酚類是代謝組學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的重要生物小分子代謝組分. 近年來, 此類生物小分子化合物的分析方法也在不斷演變, 應(yīng)用較為廣泛的技術(shù)手段是采用柱前衍生化結(jié)合反相色譜分離的方法, 來實現(xiàn)此類化合物的定量分析. 其中, 已有多種用于氨基酸和胺類小分子化合物的衍生化試劑, 如丹磺酰氯、苯基異硫氰酸鹽等, 通過衍生化, 可以改善目標化合物的色譜分離行為, 并可以增強這些化合物的檢測靈敏度. 若將衍生化試劑進行同位素標記, 即可通過衍生化反應(yīng)實現(xiàn)對胺類、氨基酸和酚類化合物的同位素標記, 對上述化合物實施相對定量分析研究.
Yang 等人[49]合成的(C1-C4)NA-NHS 試劑(N-烷基煙堿酸-N-羥基琥珀煙酰胺酯)能夠高效地對含有–NH2–基團的目標生物分子進行同位素標記. 衍生化反應(yīng)過程中, (C1-C4)NA-NHS 試劑中–C–O–鍵發(fā)生斷裂, 與氨基發(fā)生反應(yīng), 最終形成–C–N–鍵并實現(xiàn)目標化合物的同位素標記, 實現(xiàn)定量分析. 由于該試劑也可對含有–OH(酚羥基)的化合物進行衍生化, 該研究小組[50]在后期又用“輕” “重”同位素標記試劑 C1-NANHS和 C1-NA-NHS-d3對人體肺泡上皮細胞的代謝物進行了同位素標記研究, 并最終確定人體肺泡上皮細胞 A549 的-生育酚的代謝情況.
Shimbo 等人[51]研發(fā)的柱前衍生化試劑 TAHS (p-N,N,N-trimethylammonioanilyl-N′-hydroxysuccinimi dyl carbamate iodide, p-N,N,N-三甲基氨基-N′-羥基丁二胺亞酰甲酸酯碘化物)也能夠用于氨基酸分析, 分別被輕質(zhì)同位素和重質(zhì)同位素標記的 TAHS 試劑用于樣品組和對照組樣品的同位素標記, 所引進的親水基團, 如苯基、萘基或吡啶等基團, 會增強氨基酸在反相色譜上的保留, 改善分析結(jié)果的可靠性. Johnson[52]提出 MPAS(4-methylpiperazineacetic acid, 四甲基哌嗪乙酸)、MPBS(4-methylpiperazinebutyryl succinimide, 四甲基哌嗪丁酰琥珀亞酰胺)試劑, 除能夠?qū)崿F(xiàn)目標化合物的同位素標記外, 還可提高目標化合物的質(zhì)譜響應(yīng), 改進的 DMABS (dimethylaminobutyryl succinimide, 二甲氨基丁酰琥珀亞酰胺)試劑在目標生物小分子質(zhì)譜響應(yīng)改善方面, 優(yōu)勢更為顯著. Abello 等人[53]開發(fā)的衍生化標簽試劑 PEG-OPFP (pentafluorophenyl-activated esters of poly (ethylene glycol), 聚乙二醇-五氟苯酚活化酯)可應(yīng)用于肽段以及含有初級胺官能團的生物分子的同位素標記, 系統(tǒng)比較了暴露在香煙誘導(dǎo)氧化條件下人體肺部上皮細胞的谷胱甘肽和細胞內(nèi)氨基酸的定量分析研究, 實驗中采用的 PEG-OPFP 試劑包括兩部分: PEG 鏈和OPFP 部分, 13C/12C 同位素是借助于導(dǎo)入 PEG 鏈來實現(xiàn)標簽試劑的多元化和系列化, PEG-OPFP 不僅適用于小分子的定量分析, 也適于肽段的研究. Guo 和Li[10] 合成的同位素標記的丹磺酰氯標簽試劑(13C/12C-DNS-Cl)能夠?qū)崿F(xiàn)對一級胺、二級胺以及含有酚羥基的生物分子的衍生化和同位素標記, 并且13C/12C-DNS-Cl 的合成簡單, 衍生化反應(yīng)條件溫和, 在 60℃的溫浴條件下振搖 60 min 即可高效地對上述生物分子進行衍生化, 具有廣闊的應(yīng)用前景. 作者通過對人體尿樣中的代謝物進行標記研究分析, 共檢測到 672 種代謝物. O’Maille 等人[54]利用氨基化試劑13C4/12C4-MDMAES 對人體血清的代謝提取物進行了同位素標記和相對定量分析, 為探討全身炎癥反應(yīng)綜合征和敗血癥的臨床研究提供了極具借鑒意義的實驗結(jié)果. 此外, 對于難以直接進行定量分析的膽固醇和脫氫膽固醇類化合物, Johnson 等人[55]利用MDMAES 試劑對患有 SLOS 疾病的人體血漿進行了同位素標記和定量分析, 為 SLOS 疾病的臨床診斷提供了有價值的線索. 這些近年來報道的同位素標記試劑對于改善氨基酸類化合物的檢測靈敏度, 實現(xiàn)復(fù)雜樣品基質(zhì)中此類化合物的定量分析方面均起到積極推動作用, 其結(jié)構(gòu)可參考圖 9 所示.
Lamos 等人[56]合成的重同位素標記的膽胺(2H3- cholamine)反應(yīng)適用于含有羧酸的代謝組分的同位素標記, 包括小分子和肽段等, 衍生化反應(yīng)簡單易行, 能夠同時對補充物飼養(yǎng)雞的雞蛋中 12 種脂肪酸進行相對定量分析. Yang 等人[57]開發(fā)的 BMP 和 CMP 衍生化試劑均具有季銨結(jié)構(gòu), 目標生物分子的羧基經(jīng)過衍生化后, 其 MS 檢測靈敏度有顯著提升. 除能夠?qū)崿F(xiàn)相對定量分析外, 還可對目標化合物進行絕對定量分析, Adamec 等人[58]分別利用此方法對人血清中的脂肪酸和靈芝屬種菌類中的靈芝酸等化合物進行了絕對定量分析. Guo 和 Li[59]利用 12C/13C-DmPABr 試劑結(jié)合LC/MS 的方法對人體尿樣中的羧酸類化合物進行分析, 確證了其中 43 種羧酸類化合物. Huang 等人[48]利用合成的同位素質(zhì)量標簽 2H5/H5- BPB 在溫和的反應(yīng)條件下對鹽脅迫處理的水稻植物樣品以及早衰突變體中茉莉酸生物合成途徑的變化進行了同位素標記和相對定量分析, 標記效率能夠達到 80%~98%. 根據(jù)此研究思路, 他們還利用 2H7/ H7-BQB 對人體尿液中的硫醇和被氧化的硫醇進行了定量分析, 這種方法不僅增強了目標物檢測靈敏度, 而且對于未來人類疾病(包括癌癥、炎癥、心血管等疾病)的診斷研究提供了更便利的條件, 進一步驗證了此技術(shù)的應(yīng)用廣泛性[60]. Tsukamoto 等人[61]合成了一種測定具有苯并呋喃結(jié)構(gòu)的羧酸類化合物的衍生化試劑 DBD-PZ-NH2, 對兩種鼠血清中的脂肪酸的相對含量進行測定.
Xu 等人[62]提出了一種專門針對含有羧基的肽段進行分析的衍生化試劑 PP, 該試劑不僅產(chǎn)率高而且還可以增強磷酸肽的離子化效率, 與其他方法相比, 該方法所用樣品量少、耗時短, 但其應(yīng)用范圍還只局限在生物大分子分析上. Leng 等人[63]在此基礎(chǔ)上對其加以改進, 設(shè)計合成 DMPP, 將其適用對象擴展為所有含有羧基的化合物, 其衍生化反應(yīng)條件非常溫和, 僅需在室溫條件下渦旋 15 s 即可完成, 實驗易于操作、重復(fù)性好、沒有副反應(yīng), 非常適合熱不穩(wěn)定的生物分子, 利用該技術(shù), 作者成功地對尿液中的脂肪酸進行了分析, 并對兩個合成的肽段進行了確證.
上述衍生化反應(yīng)的共同特點是簡便、迅速、產(chǎn)率高且沒有副反應(yīng). 主要適用對象集中在含有羧基的代謝組分上, 應(yīng)用模型涉及植物生理、疾病等領(lǐng)域, 對植物生理和疾病機理探討, 早期疾病診斷等研究方向具有很強的指導(dǎo)意義(相關(guān)結(jié)構(gòu)見圖 10).
(ⅸ) 醛、酮以及多糖化合物的同位素標記. Mirzaei 和 Regnier[64]合成了同位素標記的 Girard’s P試劑, 用來對含羰基的化合物進行同位素標記和定量分析. 該衍生化試劑主要由能夠特異性地與羰基進行反應(yīng)的含肼的部分和用于改善目標化合物的色譜行為和質(zhì)譜行為的季銨 2 部分組成, 通過與目標物羰基進行反應(yīng), 形成希夫堿, 實現(xiàn)目標化合物的同位素標記. Manini 等人[65]合成了針對醛和酮的輕重同位素標記的 DNPH 試劑, 借此對呼出氣冷凝樣品中的丙二醛及 4-羥基壬稀醛的肼的衍生物進行檢測. Girard’s P 和 DNPH 試劑主要用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中未修飾肽段的鑒別和一些生物組分的絕對定量研究上, 相信未來對于一些沒有標準品無法進行定量分析的樣品, 利用 Girard’s P 和 DNPH 進行相對定量分析也是可行的.
Walker 等人[66]用穩(wěn)定同位素標記的疏水性酰肼試劑(12C/13C-P2GPN)對復(fù)雜基質(zhì)樣品如混合血漿中的 N 連接的多糖進行相對定量測定. 該試劑可以將疏水性的特質(zhì)引入到多糖上, 以此增加離子化效率MS 檢測; 通過輕重同位素標記后在 MS 上的可區(qū)別的檢測來實現(xiàn)目標分析物的相對定量分析(相關(guān)結(jié)構(gòu)見圖 11).
3 同位素標記技術(shù)的分類及特點
根據(jù)同位素標記試劑自身結(jié)構(gòu)特征, 可將同位素標記技術(shù)劃分為 2 大類, 質(zhì)量差異標簽和等質(zhì)量標簽, 根據(jù)其定量分析過程中展現(xiàn)的技術(shù)特點, 對其分子量、一級及二級質(zhì)譜特征信息進行比較, 其匯總結(jié)果如表 1 所示.
依據(jù)同位素標記試劑的適用對象, 上述同位素標記技術(shù)可細分為大分子、小分子和糖類化合物標記技術(shù), 每種標記技術(shù)均針對目標生物分子的特定官能團或者其特征結(jié)構(gòu)進行區(qū)分, 利用體內(nèi)或體外標記方法, 實現(xiàn)對目標生物分子的同位素標記, 其具體分類可參見表 2.
基于 MS 進行穩(wěn)定同位素標記的生物分子相對定量方法原理及要考慮的因素, 對質(zhì)量差異標簽而言, 由于標簽本身分子量不同, 目標生物分子被輕質(zhì)同位素和重質(zhì)同位素標記后, 會在 MS 中表現(xiàn)為具有特定的質(zhì)荷比差、可區(qū)分的 MS 峰, 可利用高分辨MS 直接進行相對豐度比較或者后續(xù)的定性分析, 推斷目標化合物的分子結(jié)構(gòu); 同時, 亦可利用 MS/MS監(jiān)控目標化合物子離子或多反應(yīng)離子監(jiān)控(MRM)的峰強度或面積比進行相對定量, 用以確定目標化合物的相對含量變化. 對等質(zhì)量標簽而言, 標記后的產(chǎn)物具有相同的質(zhì)荷比, 因此在 MS 譜圖中無法區(qū)分其同位素標記產(chǎn)物, 必須通過 MS/MS 分析, 比較所得到的不同質(zhì)荷比的特征同位素碎片峰強度, 以此進行相對定量分析.
上述同位素標記技術(shù)中所用到的標簽試劑, 最早出現(xiàn)的是質(zhì)量差異標簽, 如 ICAT 和 SILAC 試劑. 由于每個同位素標記的肽段或代謝物在 MS 中出現(xiàn)一對或一組峰, 增加了譜圖的復(fù)雜性和分析的難度, 當標簽試劑質(zhì)量偏大時, 被標記的生物分子的分子量增加較大, 對質(zhì)譜儀的質(zhì)量檢測范圍提出更高要求. 而 TMT 和 iTRAQ 等質(zhì)量同位素標簽, 不僅可以克服上述缺點, 還能夠提升目標化合物 MS 圖的母離子信號強度, 改善低豐度肽段或代謝物的檢出, 后續(xù)MS/MS 分析則由于報告離子的低質(zhì)荷比, 降低了基質(zhì)干擾, 由于用于定量的碎片離子的質(zhì)荷比位于低質(zhì)量端, 可選擇的質(zhì)譜儀范圍有所擴大, 但實驗成本有所增加[46,69],
不論選用何種標簽, 都要謹慎對待同位素效應(yīng)的存在, 尤其是 2H/H 體系, 不合適的氘標記會帶來明顯的色譜行為差異, 從而導(dǎo)致不同標記形式的目標分子面臨完全不同的基質(zhì)效應(yīng), 影響相對定量分結(jié)果的準確性, 此外, 2H/1H 體系穩(wěn)定性較差, 某些標記條件下會發(fā)生 2H/H 交換反應(yīng), 導(dǎo)致同位素標記失敗[26,45,47]. 用 13C, 15N 等同位素標記可解決如上問題, 但是標簽試劑的合成難度大、成本高[70]; 作為替代, 可以采取降低 2H 標記數(shù)量, 并將 2H 標記位點選擇在親水基團附近, 可有效避免或消除其同位素效應(yīng)帶來的不利影響, 如 DiART. 因此, 在實際實驗設(shè)計中, 需要根據(jù)研究體系的特點, 選擇合適的同位素標記試劑, 實現(xiàn)對目標生物分子的同位素標記和定量分析, 標簽試劑的設(shè)計、選擇及同位素效應(yīng)的考察對確保結(jié)果準確至關(guān)重要.
4 前景展望
本文探討的同位素標記技術(shù)都有各自的適用范圍及特點, 彼此之間具有一定的互補性. 利用同位素飼喂方式實施的代謝標記操作簡便、高效、準確性高, 但目前階段更適于特定培養(yǎng)條件下的細胞或者簡單的生物體的同位素標記. 與體內(nèi)標記技術(shù)相比, 體外標記成本較低, 適用范圍廣泛, 幾乎適用于所有蛋白質(zhì)、多肽和常見的生物小分子化合物, 對復(fù)雜的組織及體液樣品能夠直接利用衍生化反應(yīng)進行同位素標記和定量分析. 體外同位素標記試劑的結(jié)構(gòu)多樣, 可針對不同的生物分子有選擇地進行同位素標記, 部分攜帶易于離子化基團的同位素標記試劑在對目標生物分子進行同位素標記的同時, 還能夠顯著提升目標分子的質(zhì)譜響應(yīng), 特別適用于含量低、質(zhì)譜響應(yīng)差的生物分子檢測分析. 但是, 體外標記技術(shù)依賴于樣品處理階段才引入同位素, 實現(xiàn)目標生物分子的同位素標記, 無法避免和消除前樣品處理過程中帶來的實驗誤差, 影響定量分析結(jié)果的準確性.
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 生物學(xué)家和化學(xué)家對生命科學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入, 重要生物分子的定量分析日益重要, 通過生物分子相對定量信息的獲取, 能夠深入理解這些生物分子在生命過程中扮演的角色及分子作用機制. 盡管穩(wěn)定同位素稀釋法以其穩(wěn)定可靠的定量分析優(yōu)勢在某些生物分子定量分析研究領(lǐng)域仍然具有不可替代的位置, 然而對于種類繁雜、結(jié)構(gòu)多樣的生物分子, 均受到同位素內(nèi)標化合物可獲取性的限制, 這些同位素標記內(nèi)標化合物合成困難、成本高昂, 極大地影響了同位素稀釋法的廣泛應(yīng)用. 近幾年來, 生物分子的穩(wěn)定同位素標記技術(shù)正是針對同位素稀釋法的不足, 利用體內(nèi)或體外標記策略, 實現(xiàn)對目標分子的同位素標記和相對定量分析. 尤其是在蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展, 印證了此項技術(shù)的發(fā)展?jié)摿? 為結(jié)構(gòu)多樣、樣本來源復(fù)雜的生物分子相對定量分析提供了好的思路. 但是, 現(xiàn)有技術(shù)對生物樣本的全蛋白分析和重要信號分子, 尤其是對于缺少可修飾官能團的重要信號分子的同位素標記和相對定量分析, 仍存在諸多不足. 因此, 同位素標記技術(shù)在未來發(fā)展應(yīng)該側(cè)重于改進現(xiàn)有標記技術(shù)和試劑的不足, 沿著生物分子同位素標記相對定量分析的自動化、高通量化的發(fā)展思路進行, 經(jīng)過發(fā)展和改進, 同位素標記技術(shù)必將為闡明生物體內(nèi)重要生物分子的合成代謝途徑、重要信號分子的作用機制研究提供更全面、可靠的信息, 并得到更為廣泛的應(yīng)用.
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