摘要 以高活性兩親性α-螺旋型陽(yáng)離子抗癌肽A12L/A20L(多肽P)為模板,在其親水面進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)取代,獲得了一系列帶有不同凈電荷的多肽類似物,研究了凈電荷對(duì)螺旋型抗癌肽生物活性的影響. 結(jié)果表明,抗癌肽凈電荷的改變對(duì)其溶血活性影響較小(最大差異為2倍),而對(duì)抗癌活性和選擇性的影響顯著(最大差異為10倍). 抗癌肽P的凈電荷最適范圍為+7到+8,分子間靜電排斥作用的最佳數(shù)目為3~5個(gè),高于或低于此范圍,其抗癌活性和選擇性均明顯降低. 與人的正常細(xì)胞相比,負(fù)電性的癌細(xì)胞膜對(duì)于抗癌肽的凈電荷變化更敏感,表明兩親性螺旋型抗癌肽針對(duì)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞表現(xiàn)出良好的選擇特異性.
目前,癌癥已經(jīng)成為人類健康和生命安全的最大威脅. 由于傳統(tǒng)抗癌藥物的低選擇性、不同程度的副作用及癌細(xì)胞通過(guò)自身變異以及環(huán)境、藥物誘發(fā)其變異導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性,在很大程度上加劇了人類對(duì)新型抗癌藥物需求的緊迫性. 研究結(jié)果表明,很多陽(yáng)離子抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMPs)不僅具有高效的殺菌作用,還具有抗癌及抗病毒活性[1,2]. 具有抗癌活性的陽(yáng)離子肽被稱作抗癌肽(Anticancerpeptides,ACPs). 抗癌肽以高度保守的細(xì)胞膜為作用靶點(diǎn),通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性殺滅癌細(xì)胞,針對(duì)癌細(xì)胞表現(xiàn)出高效、廣譜的活性及特異性,這為新型抗癌藥物的研究提供了新方向.
抗菌肽的種類繁多,具有抗癌活性的抗菌肽大致分為2類[1] :(1)能有效殺滅細(xì)菌和癌細(xì)胞而不殺傷正常細(xì)胞的多肽;(2)對(duì)細(xì)菌、癌細(xì)胞和正常細(xì)胞都有毒性的多肽. 盡管不同抗癌肽具有高度的異源性和較大的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異,但它們?nèi)匀痪哂姓娦�、疏水性和兩親性等共同特征[1,3]. ACPs通過(guò)其正電荷與帶負(fù)電的癌細(xì)胞膜發(fā)生靜電吸附,再利用其兩親性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),通過(guò)疏水面與細(xì)胞膜磷脂的疏水相互作用,引起細(xì)胞膜的裂解或細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用[4,5]. 影響抗癌肽作用的因素很多,包括多肽的氨基酸序列、電荷、兩親性、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、多肽濃度和細(xì)胞膜組成等,這些因素對(duì)抗癌肽的生物活性具有重要影響.
迄今,關(guān)于電荷對(duì)抗癌肽生物活性影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道. 本文以前期工作[6]獲得的高活性抗癌肽A12L/A20L為模板,命名為母肽P,從電荷角度出發(fā),在保持其疏水面不變以維持其高疏水性的同時(shí),通過(guò)在其親水面進(jìn)行絲氨酸或賴氨酸相互替換,使多肽的凈電荷升高或降低,研究了凈電荷變化對(duì)抗癌肽生物活性的影響. 本文結(jié)果對(duì)進(jìn)一步提高抗癌肽的靶向選擇性,設(shè)計(jì)出高效低毒的抗癌肽藥物具有一定的指導(dǎo)意義.
1 實(shí)驗(yàn)部分
HeLa 299 人宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó) ATCC 細(xì)胞庫(kù) ; 血紅細(xì)胞用新鮮血液提取.
LC-20A分析型高效液相色譜儀和LC-6A制備型高效液相色譜儀(日本島津公司);SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)(蘇州安泰凈化設(shè)備有限公司);LDZX-30FB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);MCO-15ACCO2 培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);IMT-2倒置顯微鏡(日本Olympus公司);ZD-85A恒溫振蕩器(江蘇金壇榮華儀器廠);GF-M3000酶標(biāo)儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司);FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);96孔板;Enppendof可調(diào)移液器;細(xì)胞計(jì)數(shù)板等.
1 . 2 . 1 多肽的合成與純化 采用 Fmoc 固相多肽合成法合成多肽序列[7] . 合成的多肽通過(guò)反相高效液 相色譜進(jìn)行分離純化 , 經(jīng)冷凍干燥后的多肽樣品純度可達(dá) 95% 以上. 多肽樣品通過(guò)電噴霧質(zhì)譜和氨基 酸組成分析進(jìn)行定量確證后 , 進(jìn)行生物物理及生物活性測(cè)定[8] .
1 . 2 . 2 多肽疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 在 25 ℃ 下 , 采用反相高效液相色譜分析多肽純品 , 以保留時(shí) 間表示多肽的相對(duì)疏水性. 色譜條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[6] . 在 25 ℃ 下 , 使用石英比色杯測(cè)定多肽的圓二色光 譜以表征其二級(jí)結(jié)構(gòu). 使用平均殘基摩爾橢圓率[ 茲]估計(jì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu) , 采用 a-螺旋特征峰 222 nm 下的[ 茲] 值計(jì)算多肽的相對(duì)螺旋性. 具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6] .
1 . 2 . 3 抗癌活性測(cè)定 采用 MTT 法檢測(cè)抗癌肽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞 HeLa 的體外殺傷作用[6] .
1 . 2 . 4 細(xì)胞毒性( 溶血活性) 測(cè)定 參見(jiàn)文獻(xiàn)[6] 方法測(cè)定抗癌肽對(duì)人血紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性.
2 結(jié)果與討論
在前期工作[6] 中 , 系統(tǒng)研究了疏水性對(duì)螺旋型抗癌肽生物活性的影響 , 通過(guò)掃描電子顯微鏡及共 聚焦顯微鏡對(duì)其抗癌機(jī)理進(jìn)行了初步的研究. 為進(jìn)一步了解抗癌肽的抗癌作用過(guò)程 , 本文以前期工作 中得到的高活性抗癌肽 A12L/A20L 為模板多肽 P , 從電荷角度進(jìn)行改造 , 設(shè)計(jì)了帶有不同電荷的抗癌 肽類似物. 在多肽的設(shè)計(jì)過(guò)程中 , 為保證抗癌肽發(fā)揮抗癌作用所需的較高疏水性 , 保持其疏水面不變 , 選取其親水面進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)取代以實(shí)現(xiàn)多肽凈電荷的升高或降低. 在增加凈電性的多肽組中 , 采用 賴氨酸取代親本的絲氨酸來(lái)完成 , 設(shè)計(jì)出 3 個(gè)單取代多肽( S4K , S11K , S25K) 、2 個(gè)雙取代多肽( S4K/ S11K , S11K/S25K) 和 1 個(gè)三取代多肽( S4K/S11K/S25K) , 多肽的凈電荷從親本的+7 升高到+10 ; 在 降低凈電性的多肽組中 , 采用絲氨酸取代親本的賴氨酸 , 設(shè)計(jì)出單取代多肽( K14S) 、雙取代多肽 ( K10S/K14S) 和三取代多肽( K7S/K10S/K14S) 各 1 個(gè) , 多肽的凈電荷從親本的+7 降低到+4. 實(shí)驗(yàn)中 的具體多肽序列如表 1 所示. 圖 1 為所設(shè)計(jì)的多肽的螺旋網(wǎng)狀圖.
2 . 2 抗癌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)
多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)通常利用圓二色光譜來(lái)表征,實(shí)驗(yàn)中采用KP緩沖液和含50%(體積分?jǐn)?shù))TFE的KP緩沖液分別模擬溫和的親水環(huán)境和細(xì)胞膜的疏水環(huán)境. 圖2為多肽在不同環(huán)境中的圓二色光譜圖. 可見(jiàn),在親水環(huán)境中,大多數(shù)多肽只形成輕微程度的螺旋結(jié)構(gòu)或以無(wú)序結(jié)構(gòu)存在;而在疏水環(huán)境中,所有多肽的螺旋程度均明顯增強(qiáng),表現(xiàn)出典型的α鄄螺旋結(jié)構(gòu)特征吸收峰(195~200nm的正吸收峰,208和222nm很強(qiáng)的負(fù)吸收峰). 以222nm處的摩爾橢圓率數(shù)值為指標(biāo),定義疏水環(huán)境下摩爾橢圓率最大的模板肽P的螺旋度為100%,計(jì)算出其它多肽的相對(duì)螺旋度,所得數(shù)據(jù)列于表2.
多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明,螺旋型抗癌肽在疏水環(huán)境中被誘導(dǎo)產(chǎn)生了典型的a-螺旋結(jié)構(gòu).當(dāng)多肽的凈電荷由+7增加到+10時(shí),多肽分子內(nèi)的靜電排斥作用數(shù)目由3個(gè)升高到8個(gè),多肽的相對(duì)螺旋度總體降低,凈電荷為+10時(shí)達(dá)到最低.相反,多肽的凈電荷由+7降低到+4,多肽分子內(nèi)的靜電排斥作用數(shù)目由3個(gè)降至0 個(gè),多肽的螺旋度整體維持在高水平,與高凈電荷組相比,表現(xiàn)出更完整的螺旋.這可能是由于分子內(nèi)部正電性氨基酸之間的靜電排斥作用影響了多肽折疊和a-螺旋的穩(wěn)定性
2 . 3 抗癌肽的相對(duì)疏水性和分子自我相互作用能力
多肽與反相高效液相色譜(RP-HPLC)非極性固定相(脂肪族烷基鏈結(jié)合在硅基質(zhì)支持物上)之間的疏水相互作用對(duì)多肽的構(gòu)象變化具有很高的靈敏性， 因此,利用多肽在反相高效液相色譜上的保留行為可以測(cè)定多肽的相對(duì)疏水性.
RP-HPLC溫度監(jiān)控技術(shù)是利用多肽在反相色譜中的保留行為研究多肽分子自我相互作用能力的新方法.在較低溫度下,兩親性a-螺旋多肽的疏水面在水溶液中通過(guò)疏水作用相互結(jié)合,形成二聚體形式.此時(shí)的水溶液中只有很少的單體存在,二聚體-單體的平衡向二聚體形成的方向偏移.隨著溫度的升高,單體-二聚體的平衡狀態(tài)逐漸被打破,二聚體開(kāi)始不斷解聚成為單體.能夠與色譜固定相的疏水基質(zhì)相結(jié)合的多肽分子總是以單體的形式存在.當(dāng)溫度升高到某一數(shù)值時(shí),二聚體多肽完全轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形式,保留時(shí)間達(dá)到最大值.超過(guò)此臨界溫度后,溫度繼續(xù)升高會(huì)引起多肽變性,在某種程度上引起兩親性a-螺旋去折疊,保留時(shí)間下降.另外,隨著溫度的升高,流動(dòng)相的黏度降低,固定相與流動(dòng)相間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移速率增加,這些變化會(huì)影響多肽在色譜上的保留行為. 為了排除溫度升高對(duì)這些性質(zhì)的影響,設(shè)計(jì)了一條在親水環(huán)境和疏水環(huán)境下均為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的多肽C(序列為Ac-ELEKG-GLEGEKGGKELEK-amide), 通過(guò)扣除肽C的保留行為得到兩親性a-螺旋型多肽本身構(gòu)象變化與程序升溫的關(guān)聯(lián),測(cè)定多肽分子自我相互作用的能力(見(jiàn)圖3和圖4).參數(shù)PA表示多肽分子自我相互作用的能力,PA值越高表示多肽自我相互作用的能力越強(qiáng).由表2和圖4可見(jiàn),當(dāng)抗癌肽的凈電荷由+4升高到+10,疏水性從50.4降至45.0,PA值由7.95min降到4.80min,即隨著多肽凈電荷的增加,多肽的疏水性維持在較高水平,但多肽自我相互作用明顯降低. PA值的這種變化與多肽整體的疏水性的降低有一定的相關(guān)性. 此結(jié)果與Jiang等[11]得到的多肽整體疏水性降低的同時(shí)增加親水面的正電荷,可使多肽自我相互作用降低的結(jié)果一致. 如果多肽在水溶液中自我相互作用能力太強(qiáng),會(huì)形成穩(wěn)定折疊的二聚體,使疏水面被包埋,多肽與靶細(xì)胞膜的作用就會(huì)大大降低,不利于多肽進(jìn)入細(xì)胞膜中破壞細(xì)胞膜. 因此,合理調(diào)節(jié)多肽的自我相互作用,對(duì)提高多肽的殺傷力具有重要意義.
2 . 4 抗癌肽的生物活性
影響ACPs臨床應(yīng)用的最大障礙是其細(xì)胞毒性. 利用 Minimal hemolytic concentration( MHC) 表示多 肽對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞毒性 , 即不發(fā)生溶血現(xiàn)象時(shí)所能允許的最大多肽濃度. MHC數(shù)值越大 , 表示多肽 的毒性越小. 抗癌肽的抗癌活性采用MTT方法測(cè)定 , 以殺滅50%的活細(xì)胞的多肽濃度即 IC50 值表示 , IC50值越小 , 表示多肽的抗癌活性越高. 為了更直觀地反映抗癌肽針對(duì)癌細(xì)胞的選擇性 , 研究者普遍采 用治療系數(shù)(Therapeutic index) , 即MHC與IC50的比值來(lái)表示 , 治療系數(shù)數(shù)值越大 , 表示ACPs對(duì)癌細(xì) 胞的選擇性越高. 因此 , 可以通過(guò)降低其細(xì)胞毒性( MHC 值升高) 或提高其抗癌活性( IC50值降低)來(lái)增強(qiáng)抗癌肽的選擇特異性 , 獲得高效低毒的抗癌肽. 表 3 列出了不同電荷的抗癌多肽生物活性的數(shù)據(jù).
表3中結(jié)果表明,正常細(xì)胞和癌細(xì)胞受抗癌肽凈電荷變化的影響不同,稍顯負(fù)電性的癌細(xì)胞膜對(duì)ACPs的凈電荷更加敏感. 隨著多肽凈電荷的數(shù)目由+4升高到+10,分子內(nèi)靜電排斥作用數(shù)目從0升高到8個(gè),多肽的溶血活性未發(fā)生顯著變化(倍比稀釋2倍范圍內(nèi));但對(duì)于HeLa細(xì)胞的抗癌活性,其IC50值變化幅度較大(13.2~1.4umol/L),與親本相比,最大變化幅度為10倍. 當(dāng)抗癌肽的凈電荷為+7和+8時(shí),分子內(nèi)靜電相互作用數(shù)為3-5個(gè),獲得的抗癌多肽表現(xiàn)出很好的抗癌活性(IC50 <2umol/L),同時(shí)無(wú)明顯的溶血現(xiàn)象,增加1個(gè)正電荷得到的S4K,S11K和S25K都表現(xiàn)出與親本相當(dāng)?shù)目拱┗钚院瓦x擇性,說(shuō)明多肽P存在一個(gè)最適范圍保證抗癌肽的高效抗癌活性和選擇性. 進(jìn)一步降低或升高多肽的凈電荷,即多肽的凈電荷小于+7或者大于+8,抗癌活性逐漸減弱(見(jiàn)圖5和圖6). 這可能是由于多肽的凈電荷過(guò)低,削弱了多肽與癌細(xì)胞負(fù)電性的細(xì)胞膜之間的靜電識(shí)別相互作用;而凈電荷過(guò)多,又增加了分子內(nèi)部和分子之間的靜電排斥作用,影響了多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響多肽與癌細(xì)胞的相互作用. 由圖5和圖6可見(jiàn),該多肽的凈電荷存在一個(gè)最適范圍,高于或低于此范圍都將導(dǎo)致活性降低和選擇性下降,而多肽的溶血活性則未發(fā)生明顯變化. 這可能與保持多肽P疏水面的完整性,只針對(duì)其親水面進(jìn)行取代有關(guān),這與之前報(bào)道的多肽疏水面的改變對(duì)其溶血活性影響更加顯著的結(jié)論一致[12].
多肽對(duì)癌細(xì)胞的選擇性不僅取決于癌細(xì)胞膜表面所帶的負(fù)電性,還依賴于多肽自身的結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì),以及癌細(xì)胞膜的組成和性質(zhì),如膜流動(dòng)性和跨膜電位等[18,19]. 研究結(jié)果證實(shí),多肽的序列長(zhǎng)度和分子質(zhì)量對(duì)多肽的選擇性無(wú)直接影響[20,21],而且ACPs直接侵入癌細(xì)胞的細(xì)胞膜,與細(xì)胞膜的相互作用不存在特異性的配體受體結(jié)合過(guò)程[15]. 與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞對(duì)于多肽所帶的凈電荷更敏感,說(shuō)明癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的細(xì)胞膜所帶電荷的差異是影響抗癌肽抗癌特異性的重要條件. 螺旋型抗癌多肽對(duì)細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合是發(fā)揮其生物功能的重要環(huán)節(jié),其結(jié)合能力的強(qiáng)弱決定其活性高低,通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞負(fù)電性脂膜的識(shí)別,賦予了抗癌肽對(duì)癌細(xì)胞的選擇性,合理的凈電荷調(diào)節(jié)能夠有效地提高抗癌肽的抗癌活性和選擇性.
綜上所述,螺旋型抗癌肽的凈電荷對(duì)其生物活性具有明顯的影響,多肽的凈電荷和分子內(nèi)的靜電排斥作用數(shù)目存在一個(gè)最適范圍. 多肽的凈電荷過(guò)低,削弱了多肽與癌細(xì)胞負(fù)電性的細(xì)胞膜之間的靜電識(shí)別相互作用,活性和選擇性均顯著降低;而凈電荷過(guò)多,又會(huì)增加分子內(nèi)部和分子之間的靜電排斥作用,影響多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響多肽與癌細(xì)胞的相互作用和抗癌活性. 通過(guò)合理設(shè)計(jì),適當(dāng)調(diào)節(jié)螺旋型抗癌肽的凈電荷,能夠有效地提高抗癌肽的抗癌活性和選擇性,為進(jìn)一步提高抗癌肽的選擇特異性和設(shè)計(jì)高效低毒的有應(yīng)用前景的抗癌肽藥物分子提供了新的思路.
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