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靶向G蛋白偶聯(lián)受體的肽類藥物
瀏覽量:1082 | 2024/5/6 11:10:24



摘要:G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的細(xì)胞膜表面受體家族,具有7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu),人類基因組編碼約800種不同類型的GPCRs,廣泛參與了代謝性疾病及腫瘤等多種重大疾病的病理過程,使之成為藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì),由兩個(gè)至幾十個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成,是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。迄今為止,研究者已鑒定出7000余種天然肽,分別作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。肽類藥物因具有作用機(jī)制明確、安全性好、生產(chǎn)成本低等多重獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及其在空間結(jié)構(gòu)上近乎無限的可能性而逐漸受到重視。近年來,基于對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)的理解不斷深入,靶向GPCR的肽類藥物發(fā)展迅猛,新藥不斷上市,目前為止,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)上市近50種靶向GPCR的肽類藥物,用于治療代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病,肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術(shù)開發(fā)3個(gè)階段。目前,已上市的靶向GPCR肽類藥物大多是對(duì)人體天然內(nèi)源性多肽類配體的改造與修飾,本文歸納了近年來研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡(jiǎn)要總結(jié)了目前肽類藥物的研發(fā)策略及未來潛在的發(fā)展方向,旨在為更多靶向GPCR肽類藥物的研發(fā)提供參考。


作為人體內(nèi)最大的細(xì)胞膜表面受體家族,G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)參與了包括糖尿病、心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等在內(nèi)的多種重大疾病的病理過程。靶向GPCR藥物的開發(fā)一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn),美國(guó)食品和藥物管理局(FDA) 批準(zhǔn)的全部藥物中有超過1/3都以GPCR為作用靶點(diǎn)[1]。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì),由2個(gè)至幾十個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成,迄今為止,已鑒定出7000余種天然肽,分別作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能[2-3],在人體內(nèi),肽類參與多種重要生理過程:例如胰島素(insulin)促進(jìn)糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成代謝,發(fā)揮降血糖的作用[4-5]。又如催產(chǎn)素(oxytocin)在分娩過程中促進(jìn)子宮平滑肌的收縮,并刺激乳腺射乳反應(yīng)[6]。肽作為一類信號(hào)分子,通過結(jié)合細(xì)胞膜表面受體,例如GPCRs、離子通道(ion channels) 等,啟動(dòng)特定的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。近年來,肽類藥物逐漸引起醫(yī)藥界的重視,其憑借生物活性高、安全性好、生產(chǎn)成本低等特性及其在空間結(jié)構(gòu)上近乎無限的可能性被視為藥物研發(fā)的新增長(zhǎng)點(diǎn)。在本篇綜述中,歸納了研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡(jiǎn)要總結(jié)了目前肽類藥物的研發(fā)策略和未來可能的發(fā)展方向。


1G蛋白偶聯(lián)受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路


人類基因組編碼超過800種GPCR,其配體可以是小分子糖類、脂質(zhì)和多肽,也可以是蛋白質(zhì)等生物大分子,GPCR的共同特點(diǎn)是其立體結(jié)構(gòu)包含7個(gè)跨膜 α 螺旋,因此又被稱為,7次跨膜受體,同時(shí)其胞內(nèi)區(qū)有G蛋白(鳥苷酸結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)[7]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)的相似性,GPCR可被分為5類,分別是:視紫紅質(zhì)樣家族、分泌素受體、代謝型谷氨酸受體、黏附素受體以及Frizzled/Taste2受體[8]。2012年,諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家Robert和 BrianK。以表彰他們?cè)贕PCR功能及結(jié)構(gòu)研究中的突出貢獻(xiàn),他們的工作推動(dòng)了GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)的大發(fā)展,新的GPCR結(jié)構(gòu)不斷被解析公布,使人們對(duì)GPCR的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及其信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜性有了更深入的認(rèn)識(shí)。


經(jīng)典的GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由G蛋白介導(dǎo),G蛋白是由Gα、Gβ、Gγ 三個(gè)亞基組成的異源三聚體。其中,Gα 亞基是具有GTP酶活性的分子開關(guān)蛋白質(zhì),Gβ 和 Gγ 則以二聚體形式緊密結(jié)合,Gα 有4種亞型:Gαs、Gαi/ o、Gαq/ 11和 Gα12/13[9]。每種亞型結(jié)合不同的效應(yīng)器蛋白質(zhì),效應(yīng)器蛋白質(zhì)可以直接或通過第二信使進(jìn)一步激活下游效應(yīng)(見Table1).


以Gαs為例:GPCR與配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變,活化的受體與G蛋白三聚體α亞基結(jié)合,導(dǎo)致Gα亞基上的GDP與胞質(zhì)中的GTP交換。Gα亞基與受體和Gβγ亞基解離,結(jié)合并激活腺苷酸環(huán)化酶(AC),進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度增高。cAMP與蛋白質(zhì)激酶 A(PKA)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合,導(dǎo)致催化亞基被釋放并入核。使cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(CREB)磷酸化,磷酸化的CREB與核內(nèi)CREB結(jié)合蛋白質(zhì)(CBP)特異結(jié)合形成復(fù)合物,復(fù)合物與靶基因調(diào)控序列結(jié)合,激活靶基因轉(zhuǎn)錄,分離的Gβγ亞基也可以激活下游效應(yīng)分子。例如磷脂酶 C(PLC),PLC可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (PIP2) 水解成第二信使肌醇三磷酸    IP3)和二酰甘油(DAG)———IP3刺激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),使胞內(nèi)Ca2+濃度升高,DAG激活蛋白質(zhì)激酶C(PKC),進(jìn)而觸發(fā)MAPK信號(hào)通路(見Fig1)。



GPCR另一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制由GPCR激酶(GRKs) 和抑制蛋白 (arrestin) 介導(dǎo)[9],GPCR與GRKs結(jié)合導(dǎo)致受體磷酸化,從而終止GPCR與G蛋白的相互作用,同時(shí),GPCR磷酸化還啟動(dòng)GPCRs與 β-抑制蛋白結(jié)合。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,β-抑制蛋白是作為GPCR信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制存在的。近年來發(fā)現(xiàn),其也能啟動(dòng)非G蛋白依賴的下游信號(hào)通路[10-11]。某些配體與GPCR結(jié)合可導(dǎo)致受體選擇性與不同亞型的G蛋白或β-抑制蛋白相互作用,從而有偏向性地激活某些特定的信號(hào)通路,這些配體被稱為“偏向性配體”[12],具有偏向性的配體與受體結(jié)合可激活β-抑制蛋白通路,β-抑制蛋白可以與許多下游效應(yīng)蛋白質(zhì)相互作用,例如MAPK、PKB等,在GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14],這一發(fā)現(xiàn)為靶向GPCR藥物的研發(fā)提供了新的方向:具有偏向性的配體能特異性地激活G蛋白或者β-抑制蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路,相比傳統(tǒng)配體其表現(xiàn)出更強(qiáng)的靶向性。這對(duì)提高藥效有重要的意義。


2肽類藥物及其研發(fā)策略


多肽作為藥物具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):(1)大量天然肽類可作為配體作用于細(xì)胞膜表面受體,據(jù)此開發(fā)的肽類藥物作用機(jī)制明確、生物活性高、用藥劑量;(2)與小分子藥物相比,肽類藥物不通過肝的代謝,其代謝產(chǎn)物為氨基酸,幾乎無毒性且一般不會(huì)在特定器官組織中累積,因此副作用發(fā)生率低,安全性好;(3)與蛋白質(zhì)等生物大分子相比,肽類藥物易于合成,容易與雜質(zhì)或副產(chǎn)品分離,純度高,且其研發(fā)周期短,生產(chǎn)成本低,易滿足中等規(guī)模治療的需要[15-17]。鑒于這些良好的藥理特性和固有優(yōu)勢(shì),肽類藥物成為近年來新藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。目前,已有50多種靶向GPCR肽類藥物被美國(guó)FDA批準(zhǔn)。其中大多數(shù)用于代謝性疾病或腫瘤的治療【18】。


肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術(shù)開發(fā)3個(gè)階段,最初的關(guān)注點(diǎn)集中于對(duì)人體肽類激素的開發(fā)和利用。目前,上市的藥物大多都是用這個(gè)策略合成的,最為典型的例子是胰島素[16],上世紀(jì)80-90年代,研究者利用重組DNA技術(shù)制造出高純度的生物合成人胰島素,并通過對(duì)肽鏈進(jìn)行修飾合成了胰島素類似物,實(shí)現(xiàn)了速效和長(zhǎng)效,上世紀(jì)末,研究人員將探索范圍擴(kuò)大到存在于微生物、植物、動(dòng)物毒液中的天然肽類[19]。例如,用于2型糖尿病及肥胖癥治療的Exendin-4[19],繼對(duì)天然肽類的大規(guī)模挖掘之后,肽類藥物的研發(fā)走上了利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選和開發(fā)的必由之路。


利用分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)肽類藥物的兩大基礎(chǔ)是高豐度肽庫的建立和合適的篩選策略,1985年,George P Smith通過將肽段融入噬菌體表面蛋白質(zhì),開發(fā)出了噬菌體展示技術(shù)[20],1990年,George P Smith與Jamie K Scott 將隨機(jī)序列肽展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機(jī)肽庫[21]。噬菌體展示技術(shù)通過多輪親和篩選,可在高豐度隨機(jī)肽庫(豐度可達(dá)10的九次方)中篩選出與靶蛋白質(zhì)具有高親和力的肽段,通過DNA測(cè)序確定候選肽的編碼信息,從而將肽段與靶蛋白質(zhì)的親和力屬性與肽段遺傳信息相關(guān)聯(lián),隨后,新的mRNA展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和酵母展示技術(shù)等不斷涌現(xiàn),它們與噬菌體展示技術(shù)一起在過去20年中不斷得到發(fā)展與優(yōu)化,理論上能夠針對(duì)任何靶蛋白質(zhì)進(jìn)行基于親和力的高通量篩選[22],


2014年,美國(guó)Scripps研究所Lerner課題組利用一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的自分泌信號(hào)系統(tǒng),成功篩選出GLP-1R的新型肽類激動(dòng)劑P5作為治療2型糖尿病的潛在藥物[23],這項(xiàng)技術(shù)通過血小板源生長(zhǎng)因子受體跨膜結(jié)構(gòu)域(PDGFR-TM),將候選肽段展示于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面,結(jié)合目標(biāo)跨膜蛋白質(zhì)的功能報(bào)告系統(tǒng),利用流式細(xì)胞術(shù)與高通量測(cè)序篩選靶向跨膜蛋白質(zhì)的肽類激動(dòng)劑[23-25],該系統(tǒng)通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)目標(biāo)跨膜蛋白質(zhì),而非固相化的重組蛋白質(zhì),最大程度上保持了其天然狀態(tài),并且利用報(bào)告系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基于功能的篩選。


3 靶向G蛋白偶聯(lián)受體的肽類藥物及其發(fā)現(xiàn)


人體內(nèi)有多種GPCR的內(nèi)源性多肽類配體,例如降鈣素、催產(chǎn)素、生長(zhǎng)抑素、胰高血糖素樣肽、加壓素、甲狀旁腺素和促性腺激素釋放激素等,對(duì)這些多肽的改造和修飾是多肽藥物開發(fā)的主要方向之一[18]。目前,上市的將近50種靶向GPCR的肽類藥物的主要靶點(diǎn)包括胰高血糖素樣肽受體、甲狀旁腺素受體、生長(zhǎng)抑素受體、促性腺激素釋放激素受體、加壓素/ 催產(chǎn)素受體和鈣敏感受體等。用于治療代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病。已上市的多肽藥物多是通過化學(xué)合成(例如固相多肽合成法),或者基因重組技術(shù)合成的擁有與內(nèi)源性多肽配體相似序列的多肽類似物及其衍生物,


下文將重點(diǎn)介紹幾類研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物(見Table2)。




3.1 靶向胰高血糖素樣肽1受體的肽類藥物


胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)主要在胰腺中表達(dá),其激動(dòng)劑類藥物是近年來降糖藥物研發(fā)的熱點(diǎn),GLP-1R的天然多肽類配體胰高血糖素樣肽1( GLP-1) 是37個(gè)氨基酸的肽,攝入葡萄糖后,腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞合成并分泌GLP-1,作用于GLP-1R引起細(xì)胞內(nèi)cAMP增加,促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌,抑制胰高血糖素的釋放[26],除了其特有的葡萄糖依賴的胰腺作用外,GLP-1還發(fā)揮著降低食欲和促進(jìn)飽腹感的中樞作用,突出了其作為糖尿病或肥胖癥療法的潛力[27-28],天然GLP-1半衰期短,會(huì)被體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV) 迅速降解并被腎清除,不適合直接作為藥物應(yīng)用,目前,已有7種多肽類GLP-1R激動(dòng)劑上市,用于治療2型糖尿病。


3.1.1 Exendin-4及其衍生物    1992年,Eng等從Gila毒蜥的毒液中分離出 一 種天然肽 Exendin-4[29]。具有與GLP-1相似的藥理學(xué)特性,例如,可增加胰島素分泌、降低血糖水平等,與GLP-1不同的是,Exendin-4因其N-端第2位的丙氨酸替換為甘氨酸,不被DPP-IV降解,因此具有更長(zhǎng)的半衰期和較強(qiáng)的生物活性[30-31],Exenatide(艾塞那肽)即人工合成的 Exendin-4,包含39個(gè)氨基酸,在2005年獲得FDA批準(zhǔn),是第1個(gè)用于治療2型糖尿病的GPCR靶向藥[32],Exenatide可以與GLP-1R結(jié)合改變其構(gòu)象,激活A(yù)C,使細(xì)胞中cAMP增加,從而促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌和增加胰島素敏感性,達(dá)到降低血糖的目的[31]。目前,Exenatide(有每日2次 Exenatide BID) 和每周1次(Exenatide QW)兩種劑型,Exenatide BID除可有效降低患者的血糖外,還能發(fā)揮降低體重的作用,特別適合作為合并向心性肥胖的2型糖尿病患者的治療藥物[33]。但由于Exenatide BID需要頻繁皮下注射,可能導(dǎo)致患者依從性差[18],Exenatide QW是首個(gè)實(shí)現(xiàn)一周1次給藥的GLP-1R激動(dòng)劑,其通過微球技術(shù),使Exenatide在體內(nèi)緩慢釋放,發(fā)揮長(zhǎng)效降糖作用,繼Exenatide QW后,人們也采用了多種其他策略來提高GLP-1R激動(dòng)劑的血漿穩(wěn)定性,以延長(zhǎng)其半衰期。這些策略可大致分為兩種:一種是對(duì)Exenatide的序列進(jìn)行修飾,延長(zhǎng)其血漿半衰期,例如利西拉肽,省略了肽Ex-enatide序列中第38位的脯氨酸并在其 C-端添加了6個(gè)賴氨酸殘基和1個(gè)酰胺基,這些修飾延長(zhǎng)了其血漿半衰期[34]


3.1.2  胰高血糖素樣肽1衍生物   另一種策略則側(cè)重于修飾天然的GLP-1例如利拉魯肽、阿必魯肽、度拉魯肽和索馬魯肽,利拉魯肽于2010年獲得FDA批準(zhǔn),其將天然GLP-1上的第34位賴氨酸替換為精氨酸,并在第26位賴氨酸上增加了1個(gè)連接谷氨酸的C16棕櫚脂肪酸側(cè)鏈,從而增加了其與血漿白蛋白的結(jié)合,降低了DPP-IV的酶切作用和腎的清除速率[35],除以與Exenatide類似的機(jī)制發(fā)揮降糖作用外,利拉魯肽與GLP-1R結(jié)合后還能延緩胃排空,在治療肥胖癥方面效果顯著[36]。阿必魯肽和度拉魯肽均是以融合蛋白質(zhì)形式生產(chǎn)出來的。阿必魯肽是通過基因重組技術(shù)利用酵母產(chǎn)生的,與人血清白蛋白融合,其將天然GLP-1上第2位的丙氨酸替換為甘氨酸以抵抗DPP-IV降解,度拉魯肽是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的,共價(jià)連接到人IgG4-Fc重鏈上,這些修飾分別降低了這2種藥物腎的清除率,增加了其藥理活性的持續(xù)時(shí)間[37]。


與上述幾種GLP-1R激動(dòng)劑相比,索馬魯肽最主要的突破是實(shí)現(xiàn)了GLP-1R激動(dòng)劑的長(zhǎng)效制劑和口服制劑,2017年,索馬魯肽注射劑被FDA批準(zhǔn)上市,可延長(zhǎng)到每周注射1次,其長(zhǎng)效機(jī)制是基于對(duì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾,在索馬魯肽中,天然GLP-1的第8、34位氨基酸分別被2-氨基異丁酸和精氨酸取代,使其能有效避免被DPP-IV降解,并且,其中天然GLP-1的第26位賴氨酸被硬脂酸;,能夠使其與人血清白蛋白結(jié)合,從而延長(zhǎng)血漿半衰期并避免被腎快速清除,這些修飾都延長(zhǎng)了多肽在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間,使其半衰期可以達(dá)到 7d之久[38]。索馬魯肽口服制劑剛于2019年被FDA批準(zhǔn)上市,其利用了Eligen公司研發(fā)的基于促吸收劑的大分子遞送技術(shù):大分子藥物被多個(gè)促吸收劑SNAC[8-(2-羥基苯甲酰胺基) 辛酸鈉]分子包裹形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu),可保護(hù)多肽藥物不被胃中的酶類降解[38]


3.2 靶向胰高血糖素樣肽2受體的肽類藥物


胰高血糖素樣肽2受體(GLP-2R)主要分布于胃腸道組織中,通過cAMP依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道的調(diào)控,增強(qiáng)腸道營(yíng)養(yǎng)吸收。GLP-2R的天然肽類配體胰高血糖素樣肽2(GLP-2)是由33個(gè)氨基酸組成的腸源性多肽,由腸道內(nèi)分泌 L細(xì)胞分泌,可被DPP-IV快速降解,半衰期非常短,僅為7min[39-40]。替度魯肽是一種由DNA重組技術(shù)合成的GLP-2類似物,2012年被FDA批準(zhǔn)為治療依賴腸外營(yíng)養(yǎng)支持的成人短腸綜合征的孤兒藥[41],短腸綜合征(SBS)是一種罕見的具有潛在生命危險(xiǎn)的吸收不良疾病,其原因是先天性缺陷、疾病導(dǎo)致的吸收障礙或廣泛手術(shù)切除導(dǎo)致大部分腸道功能喪失[40-41]。當(dāng)SBS患者腸道吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)和水的能力不能滿足機(jī)體需要時(shí),需要腸外營(yíng)養(yǎng)支持,在替度魯肽中,天然GLP-2的第2位丙氨酸被替換為甘氨酸以抵抗DPP-IV降解、延長(zhǎng)血漿半衰期,其可通過作用于GLP-2R來發(fā)揮生物學(xué)作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道的調(diào)控,減少胃排空和分泌,并促進(jìn)小腸粘膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和修復(fù),從而增加小腸吸收、減少腹瀉[40-42]。


3.3 靶向甲狀旁腺素1受體的肽類藥物


甲狀旁腺素1受體( PTH1R)主要表達(dá)于腎和骨骼,存在2種不同的高親和性構(gòu)象:G蛋白非依賴構(gòu)象(R0)和G蛋白依賴構(gòu)象(RG)。與R0構(gòu)象親和力更高的配體主要激活 β-抑制蛋白信號(hào)通路而引發(fā)受體內(nèi)吞,觸發(fā)長(zhǎng)時(shí)程信號(hào)反應(yīng),與RG構(gòu)象親和力更高的配體主要激活G蛋白介導(dǎo)的cAMP依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,觸發(fā)瞬時(shí)信號(hào)反應(yīng)[43]。甲狀旁腺激素(PTH) 和甲狀旁腺激素相關(guān)肽( PTHrP) 是骨代謝過程中重要的調(diào)節(jié)因子,甲狀旁腺激素相關(guān)肽的N-末端含有甲狀旁腺激素同源序列。二者均可作用于PTH1R通過cAMP依賴性的PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)骨代謝[44]。不同的是甲狀旁腺激素主要調(diào)節(jié)鈣的穩(wěn)態(tài)和骨吸收,而甲狀旁腺激素相關(guān)肽是促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵肽。


3.3.1 甲狀旁腺激素類似物  特立帕肽是含有34個(gè)氨基酸的甲狀旁腺激素類似物,也是第1個(gè)被FDA批準(zhǔn)上市的調(diào)節(jié)骨代謝的肽類藥物,其主要作用于甲狀旁腺素1受體的R0構(gòu)象,促進(jìn) β-抑制蛋白的結(jié)合而導(dǎo)致內(nèi)吞過程,可持續(xù)調(diào)節(jié)cAMP含量,從而持續(xù)性激活下游信號(hào)通路,介導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),加快骨吸收[18,43-45]。


3.3.2  甲狀旁腺激素相關(guān)肽類似物  阿巴洛肽是第1個(gè)被開發(fā)的甲狀旁腺激素相關(guān)肽類似物,具有34個(gè)氨基酸。于2017年被FDA批準(zhǔn)用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的治療。其主要作用于甲狀旁腺素1受體的RG構(gòu)象,引發(fā)瞬時(shí)的cAMP含量的增高,介導(dǎo)短暫的信號(hào)反應(yīng),促進(jìn)骨形成的能力超過骨吸收[18,43]。這 2 種藥物靶向同一受體甲狀旁腺素1受體,但由于其構(gòu)象偏好性存在差異,它們激活同一靶點(diǎn)的下游信號(hào)通路不同,導(dǎo)致阿巴洛肽對(duì)于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的療效優(yōu)于 特立帕肽[44]。這也啟示在研發(fā)靶向GPCR的肽類藥物時(shí)應(yīng)考慮其構(gòu)象偏好性。


3.4 靶向生長(zhǎng)抑素受體的肽類藥物


生長(zhǎng)抑素受體(SSTR) 家族包括SSTR1-5,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、垂體和許多外周器官[46],生長(zhǎng)抑素受體的天然配體生長(zhǎng)抑素(SST) 與受體結(jié)合可誘導(dǎo)cAMP依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制各種促腫瘤生長(zhǎng)的激素和生長(zhǎng)因子的釋放,從而抑制癌細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,生長(zhǎng)抑素對(duì)受體具有很高的親和力,但在血漿中的半衰期非常短,僅為1-3min[47]。一種人工合成的天然生長(zhǎng)抑素的八肽衍生物——環(huán)狀生長(zhǎng)抑素受體激動(dòng)劑奧曲肽可用于治療神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和肢端肥大癥[46]。通過引入D-氨基酸,奧曲肽血漿半衰期可達(dá)72-113min,并可選擇性地與生長(zhǎng)抑素受體2和生長(zhǎng)抑素受體5結(jié)合[46],奧曲肽與生長(zhǎng)抑素受體結(jié)合后,通過PLC介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,產(chǎn)生第二信使IP3并可激活L型Ca2+通道,抑制生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生,Pasireo-tide(帕瑞肽)是另一種生長(zhǎng)抑素受體激動(dòng)劑,是美國(guó)和歐盟批準(zhǔn)的治療庫欣綜合征的孤兒藥[48].Pa-sireotide對(duì)生長(zhǎng)抑素受體5的親和力較高。能抑制促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌,使庫欣綜合征患者的皮質(zhì)醇分泌減少[49]。


3.5 靶向促性腺激素釋放激素受體的肽類藥物


促性腺激素釋放激素受體( GnRHR) 主要在垂體和生殖系統(tǒng)相關(guān)的組織器官中表達(dá),其天然肽類配體促性腺激素釋放激素 (GnRH)是下丘腦分泌產(chǎn)生的一種十肽神經(jīng)激素,在生殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[50]


3.5.1 促性腺激素釋放激素受體激動(dòng)劑Leuprolide   促性腺激素釋放激素類似物L(fēng)euprolide(亮丙瑞林)是促性腺激素釋放激素受體激動(dòng)劑,1985年被FDA批準(zhǔn)上市,用于治療激素反應(yīng)性癌癥,例如前列腺癌和乳腺癌,也可用于治療其它雌激素依賴性疾病,例如子宮內(nèi)膜異位癥和子宮肌瘤[51]。Leuprolide主要通過Gαq/11與GPCR相關(guān)聯(lián),激活PLC,釋放IP3和DAG。誘導(dǎo)PKC激活,促使垂體前葉釋放黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH),最終通過下丘腦-垂體-性腺軸的正常生理作用,誘導(dǎo)血清雌二醇和睪酮水平的一過性升高[52]。而下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)依賴于下丘腦促性腺激素釋放激素的脈沖分泌,導(dǎo)致Leuprolide連續(xù)幾周治療后促性腺激素釋放激素受體敏感性下降[53], 這種促性腺激素釋放激素受體活性的長(zhǎng)期下調(diào)是Leuprolide治療的主要機(jī)制,最終導(dǎo)致黃體生成素和卵泡刺激素分泌減少,性腺功能減退,從而使雌二醇和睪酮水平顯著降低,這一點(diǎn)與其他GPCR的激動(dòng)劑不同。


3.5.2 促性腺激素釋放激素受體拮抗劑Degarelix    在激素敏感型前列腺癌的治療中,Leuprolide所導(dǎo)致的睪酮水平的初始升高反而會(huì)使前列腺癌的癥狀加重,這促使研究者進(jìn)一步開發(fā)了促性腺激素釋放激素受體拮抗劑,2008年,F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種促性腺激素釋放激素受體拮抗劑Degarelix(地加瑞克),用于治療晚期前列腺癌[54],Degarelix與促性腺激素釋放激素受體可逆性結(jié)合,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量,通過抑制cAMP依賴的GPCR信號(hào)通路減少促性腺激素的釋放,進(jìn)而減少睪酮的釋放以阻止前列腺癌的生長(zhǎng)和惡化,通過在肽鏈的第5/6位引入P-脲基苯丙氨酸在實(shí)現(xiàn)藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)的同時(shí)也避免了因組胺釋放引起的超敏反應(yīng)[55],有研究表明,在治療晚期前列腺癌方面,Degarelix優(yōu)于Leuprolide【56】。


3.6 靶向加壓素/催產(chǎn)素受體的肽類藥物


加壓素受體(VRs) 包括V1AR、V1BR和V2R。V1AR主要在肝、血管平滑肌和血小板中表達(dá),促進(jìn)血管收縮和血小板聚集。V1BR主要在垂體中表達(dá),可促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放。V2R主要在腎集合管中表達(dá)。具有抗利尿作用[57-59]。催產(chǎn)素受體(OTRs) 主要分布于子宮和乳腺[60]。加壓素和催產(chǎn)素均為九肽,主要通過結(jié)合其受體來發(fā)揮作用。V1AR、V1BR與催產(chǎn)素受體作用機(jī)制相似,主要通過偶聯(lián)的Gαq/11刺激PLC的活性,釋放IP3和DAG,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放[60,61]。而V2R主要與Gαs偶聯(lián),激活A(yù)C產(chǎn)生cAMP,誘導(dǎo)PKA激活[62]?ㄘ惪s宮素是人工修飾的催產(chǎn)素類似物,天然催產(chǎn)素酚羥基上的氫被甲基取代,半胱氨酸殘基上的氨基和硫分別被氫和亞甲基取代,這些修飾延長(zhǎng)了卡貝縮宮素的作用時(shí)間[63],卡貝縮宮素可與子宮平滑肌催產(chǎn)素受體結(jié)合,誘導(dǎo)子宮節(jié)律性收縮,增加子宮收縮頻率和強(qiáng)度,適用于控制分娩后出血[63],去氨加壓素是人工合成的九肽化合物,2017年被FDA批準(zhǔn)用于治療中樞性尿崩癥,其對(duì)V2R作用最強(qiáng),可通過提高腎集合管上皮細(xì)胞cAMP水平促使腎血管舒張發(fā)揮抗利尿作用,因此與天然加壓素相比,去氨加壓素抗利尿作用顯著增強(qiáng),而對(duì)平滑肌的作用卻減弱,從而避免了高血壓引起的不良作用[64]。




3.7  靶向鈣敏感受體的肽類藥物


鈣敏感受體(CaSR)廣泛分布于甲狀旁腺、胃腸道、腎、骨組織等參與調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的組織器官中, 血鈣水平升高激活鈣敏感受體,從而抑制了甲狀旁腺激素的分泌。相反,血鈣水平的降低會(huì)使鈣敏感受體的活性受到抑制,促進(jìn)甲狀旁腺激素的分泌[65].繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥( SHPT) 是慢性腎疾病(CKD)常見的一種慢性進(jìn)行性并發(fā)癥[65],SHPT的特征是甲狀旁腺增生引起的甲狀旁腺激素水平升高,以及鈣和磷等礦物質(zhì)代謝異常[65],這些礦物質(zhì)失衡會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥,例如骨骼疾病、軟組織鈣化、血管鈣化和心血管并發(fā)癥等[66], 維拉卡肽是鈣敏感受體的一種新型長(zhǎng)效肽激動(dòng)劑,2017年被FDA批準(zhǔn)用于治療成年血液透析患者繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)[67]。 維拉卡肽直接結(jié)合并激活甲狀旁腺上的鈣敏感受體,通過PLC將PIP2裂解成第二信使IP3和DAG,從而抑制甲狀旁腺中的甲狀旁腺激素分泌。


4 問題與展望


肽類藥物以其生物活性高、低毒性、安全性好等特點(diǎn)成為了近年藥物研發(fā)的熱點(diǎn),尤其是結(jié)構(gòu)上近乎無限的可能性使之更適合于靶向GPCR。然而,噬菌體展示等技術(shù)在很大程度上依賴于活性重組蛋白質(zhì)的制備與固相化,目前尚不能針對(duì)GPCR、離子通道、 酪氨酸激酶受體(RTK)等跨膜蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選[16,23],另外,基于親和力的篩選過程并不能區(qū)別跨膜蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑和拮抗劑,即不能進(jìn)行功能篩選[23]。


Lerner課題組開發(fā)的自分泌信號(hào)系統(tǒng)首次實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的肽類展示及功能篩選,然而相較噬菌體展示技術(shù),此系統(tǒng)還不能實(shí)現(xiàn)高豐度肽庫的篩選,原因在于該體系中肽庫豐度是來自含NNK簡(jiǎn)并密碼子的PCR產(chǎn)物,其經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)化提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、慢病毒庫包裝、感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞等一系列操作后,最終展示于細(xì)胞表面的隨機(jī)肽庫豐度存在大幅下降(肽庫豐度在以上步驟中不斷丟失),而肽庫豐度高低是篩選有效候選肽的關(guān)鍵因素,因此,在Lerner確立了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系肽類展示篩選技術(shù)之后,能否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)建立復(fù)雜肽庫是當(dāng)前肽類藥物開發(fā)的一大挑戰(zhàn)。


我們課題組開發(fā)了一種基于線性雙鏈DNA的“與門(AND Gate)”邏輯基因線路設(shè)計(jì)新策略,通過PCR反應(yīng)將完整的基因表達(dá)模塊(啟動(dòng)子-基因編碼區(qū)-poly(A)尾信號(hào))拆分為2個(gè)線性雙鏈DNA分子引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)非同源末端連接(NHEJ),或同源重組(HR)機(jī)制連接在一起重新形成完整基因表達(dá)模塊,實(shí)現(xiàn)“與門”運(yùn)算及基因表達(dá)[68](見Fig.2)。由此,我們建立了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系內(nèi)引入高豐度肽庫的方法,隨著基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的高豐度肽庫構(gòu)建策略的開發(fā)及自分泌篩選體系的建立,靶向GPCR的肽類藥物篩選體系將不斷完善并趨于成熟,這將為更多肽類藥物的開發(fā)建立堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


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