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    多肽熒光標(biāo)記由于沒(méi)有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如氨基己酸，或者是通過(guò)非酸性環(huán)境將目的多肽從樹(shù)脂上切下來(lái)時(shí)，這種情況可避免在切割的過(guò)程中被TFA切割掉。

1、什么是熒光標(biāo)記？

    熒光標(biāo)記所依賴(lài)的化合物稱(chēng)為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無(wú)放射物污染，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。

2、熒光標(biāo)記的作用

熒光標(biāo)記物質(zhì)在蛋白的功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的熒光修飾，同樣是多肽合成領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

3、熒光標(biāo)記的位點(diǎn)

熒光標(biāo)記物質(zhì)可以直接和多肽的N端直接相連（如異硫氰酸熒光素的連接， 通常在多肽的N端和異硫氰酸熒光素直接插一個(gè)氨基乙酸或者β-丙氨酸。），或者在C端和賴(lài)氨酸（或半胱氨酸）的側(cè)鏈連接、或者在其它可以連接的位子連接。

4、熒光標(biāo)記的舉例

4.1 熒光標(biāo)記FITC修飾

異硫氰酸熒光素（FITC）具有比較高的活性，通常來(lái)說(shuō)，在固相合成過(guò)程中引入該種熒光基團(tuán)相對(duì)于其他熒光素要更容易，并且反應(yīng)過(guò)程中不需要加入活化試劑。

熒光標(biāo)記FITC修飾的多肽通常主要有兩種形式：

（a）在整條肽鏈N端接入FITC，并且在FITC之前接入一分子的Acp（6-氨基己酸），也稱(chēng)烷基間隔器。反應(yīng)中FITC與肽鏈上裸露的-NH2反應(yīng)，Acp的接入提供了六個(gè)碳的直鏈空間，大大降低了反應(yīng)的空間位阻，提高了反應(yīng)效率，降低了反應(yīng)難度。其次，F(xiàn)ITC還與多肽結(jié)構(gòu)中的-SH，側(cè)鏈-NH2反應(yīng)，Acp的加入也降低了這種副反應(yīng)發(fā)生的可能。此外，多肽在酸性環(huán)境條件下切割時(shí)，在N端接入FITC的多肽需要經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，這種過(guò)程通常都會(huì)伴隨最后一個(gè)氨基酸的切除，而烷基間隔器Acp的接入就避免了這一情況的發(fā)生。

（b）在整條肽中的某個(gè)Lys側(cè)鏈接入FITC，Lys側(cè)鏈為末端為-NH2的四碳直鏈烷基，直接起到了降低空間位阻的作用。這種修飾方式能夠靈活的在整條肽中任何位置進(jìn)行FITC修飾，而不僅僅局限于末端。

4.2熒光標(biāo)記AMC修飾

7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑，例如，酶的痕量測(cè)定，酶的鑒定，激光染料的制備等多種用途，此外，C端用香豆素修飾的泛素分子也是研究蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程的重要探針。
與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進(jìn)行：
AMC與肽鏈C端第一個(gè)氨基酸反應(yīng);
固相合成整條肽鏈（從第二個(gè)氨基酸開(kāi)始），并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護(hù)基和最后一個(gè)氨基保護(hù)基；
液相縮合AA-AMC與全保護(hù)的肽鏈；
切除保護(hù)基，完成肽鏈的修飾。

4.3 熒光標(biāo)記5-FAM修飾

通常用于激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)的運(yùn)用。

4.4 熒光標(biāo)記Rhodamine B（羅丹明 B）修飾

羅丹明B是眾多羅丹明染料中的一種，用于熒光測(cè)定。

4.5 熒光標(biāo)記5-TAMRA 修飾

5-TAMRA是用于標(biāo)記肽和蛋白質(zhì)的最流行的橙色熒光團(tuán)之一

1、綜述：

Cy (Cyanine)系列,也叫菁染料，即花青素系列熒光染料是具有多聚次甲基橋鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的一類(lèi)合成熒光染料。Cy染料的次甲基橋鏈（1-7個(gè)次甲基）兩端常常連著兩個(gè)氮原子，其中一個(gè)氮原子帶正電，從而Cy染料形成具有離域正電荷效應(yīng)的介離子化合物。因?yàn)檫@個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Cy染料的消光系數(shù)（extinction coefficient）非常高。橋鏈長(zhǎng)度和兩端的發(fā)色團(tuán)直接控制著染料的吸收峰和發(fā)射峰值，從而讓Cy系列染料可以覆蓋從紫外到遠(yuǎn)紅外的幾乎所有常用熒光譜帶。橋鏈長(zhǎng)度和兩端的發(fā)色團(tuán)直接控制著染料的吸收峰和發(fā)射峰值，從而讓Cy系列染料可以覆蓋從紫外到遠(yuǎn)紅外的幾乎所有常用熒光譜帶。菁染料Cy系列常分為脂溶性Cy染料、水溶性Cy染料。

青色素這一類(lèi)熒光染料相對(duì)較少。它從青色素衍生而來(lái)，也是其名稱(chēng)的由來(lái)：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過(guò)其反應(yīng)基團(tuán)與核酸，多肽和蛋白相連。其中，Cy3 and Cy5 是高消光系數(shù)的染料。特別適用于細(xì)胞內(nèi)敏感的多肽定位實(shí)驗(yàn)，也是常用的多肽標(biāo)記染料之一。關(guān)于青色素這類(lèi)熒光，Cy5還因?yàn)閷?duì)其周邊電子環(huán)境特別敏感，該特征可用于酶測(cè)定。附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射產(chǎn)生陽(yáng)性或陰性變化。此外，Cy3和Cy5還可用于FRET試驗(yàn)。

由于細(xì)胞和組織的自發(fā)熒光在近紅外波段最小，因此在檢測(cè)復(fù)雜生物系統(tǒng)時(shí)，近紅外染料能提供更高的特異性和靈敏度。同時(shí)，由于光波在近紅外區(qū)段的組織透過(guò)性更好。菁染料的摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的，Cy7 NHS ester, Cy5.5 amine 和Cy3 azide 的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強(qiáng)度最高、最穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料。特別適合于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像代替放射性元素。

2、脂溶性Cy染料

脂溶性Cy染料包括Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7和Cy7.5，其中Cy3，Cy5和Cy7的發(fā)色團(tuán)是indolenine，而Cy3.5，Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole僅僅比indolenine多了個(gè)苯環(huán)，這多余的一個(gè)苯環(huán)讓整個(gè)染料吸收峰和發(fā)射峰紅移，從而讓Cy染料系列覆蓋廣泛的熒光譜圖。Cy染料的結(jié)構(gòu)幾乎是對(duì)稱(chēng)的，為了讓染料可標(biāo)記，這其中的一個(gè)發(fā)色團(tuán)上引伸出一個(gè)6碳鏈羧基來(lái)活化標(biāo)記。
雖帶一個(gè)正電荷，脂溶性Cy染料的水溶性也比較低。在標(biāo)記生物分子時(shí)（一般在緩沖溶液中），常常需要加入有機(jī)溶液（一般5-20%的DMF或者DMSO）助溶。常規(guī)是將染料先溶于有機(jī)溶劑中，然后按比例加入到生物分子的水溶液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后離心除去沉淀的染料。當(dāng)然脂溶性Cy染料也可以直接在有機(jī)溶劑中直接與有機(jī)小分子反應(yīng)，標(biāo)記小分子或者高分子材料。脂溶性Cy染料也易溶于氯仿，甲醇，THF，乙腈等常規(guī)有機(jī)溶劑。


3、水溶性Cy染料：

水溶性Cy染料是在脂溶性Cy染料的發(fā)色團(tuán)上加入磺酸基團(tuán)從而大大增加了染料的水溶性，同時(shí)還稍微提高了染料的光學(xué)穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，因此水溶性染料更耐受光照，發(fā)出的熒光也稍強(qiáng)一些。
由于磺酸鹽的原因，這類(lèi)染料的水溶性非常高，在標(biāo)記反應(yīng)中不需要加入任何有機(jī)溶劑助溶，另外標(biāo)記上去的染料分子由于水溶性好不會(huì)聚集，也不會(huì)影響被標(biāo)記大分子的穩(wěn)定。這點(diǎn)非常重要，特別是當(dāng)每個(gè)目標(biāo)生物大分子上需要標(biāo)記多個(gè)染料分子，或者目標(biāo)生物大分子溶解度低，穩(wěn)定性差時(shí)。

4、Cy3 (Cyanine 3) 

是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖�。Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右，它的熒光肉眼觀察很明亮，并且對(duì)pH不敏感，在共聚焦顯微鏡中可以用532nm（肩峰）或者556nm（頂峰）的激光束激發(fā)，在普通熒光顯微鏡中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的濾片觀察，所以在大部分熒光儀器上都可以使用。

5、Cy7 (Sulfo-Cyanine7) 

Cy7是一種熒光標(biāo)記試劑 (Ex=750 nm，Em=773 nm)。Cy7 (Cyanine 7) 是一種近紅外花青素?zé)晒馊玖�，磺化Cy7(Sulfo-Cy7)是它的水溶型，常常統(tǒng)稱(chēng)為Cy7。由于它的熒光波長(zhǎng)(em：~770 nm)恰好處于肌體近紅外窗口 I 的區(qū)域(肌體的血液，體液和在此區(qū)域背景熒光弱，并且長(zhǎng)波長(zhǎng)光子的穿透性較強(qiáng))，所以Cy7常常應(yīng)用于小動(dòng)物活體體內(nèi)成像中。Cy7熒光肉眼不可見(jiàn)，所以在顯微鏡頭下觀察時(shí)需要借助CCD相機(jī)在成像軟件中顯示。另外近紅外濾片較少見(jiàn)，很多熒光顯微鏡(包括共聚焦顯微鏡)并不配備，但是流式細(xì)胞儀(flow cytometry)常常配備有Cy7濾片組，IVIS等小動(dòng)物成像系統(tǒng)、Odyssey近紅外熒光掃描儀等設(shè)備也配備有。Cy7是常用熒光染料，Cy7可以用來(lái)標(biāo)記核酸，蛋白，抗體，多肽，納米粒等，它是常見(jiàn)的小動(dòng)物顯影劑之一。

Cy7熒光基(fluorophore)是長(zhǎng)鏈多次甲基結(jié)構(gòu)。目前也有一些結(jié)構(gòu)優(yōu)化的Cy7染料，比如利用環(huán)己烯固化多次甲基橋鏈(polymethine)，據(jù)稱(chēng)可熒光量子產(chǎn)率20%，但是這一結(jié)論目前還存在爭(zhēng)論(Dyes and Pigments, 2013, 99, 275-283)，可能并沒(méi)有熒光增果。無(wú)論是哪種結(jié)構(gòu)，Cy7及它的衍生物Cy7.5的量子產(chǎn)率都較低，一般都<0.1左右。量子產(chǎn)率偏低是近紅外染料(包括近紅外熒光蛋白)的通病，并且染料波長(zhǎng)越長(zhǎng)，量子產(chǎn)率越低，比如很多近紅外窗口II染料的量子產(chǎn)率都低于0.01。

普通Cy7的水溶性較低，所以在水相的標(biāo)記反應(yīng)體系內(nèi)需要使用有機(jī)共溶劑，常用有機(jī)溶劑包括DMF，DMSO和乙腈等。如需標(biāo)記的分子對(duì)有機(jī)溶劑敏感，可選擇磺化Cy7。兩者的光譜性質(zhì)幾乎一致，因此大部分應(yīng)用可相互替換�；腔疌y7水溶性好，可在水相標(biāo)記反應(yīng)體系中直接使用，不需要有機(jī)溶劑助溶，適合標(biāo)記對(duì)有機(jī)溶劑敏感的生物分子。另外由于強(qiáng)水溶性加染料分子本身帶電荷，磺化Cy7標(biāo)記到生物分子表面后不會(huì)引發(fā)疏水性聚集，熒光標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

6、特點(diǎn)

CY花菁染料的優(yōu)點(diǎn)：

1：菁染料的摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的
2：細(xì)胞和組織的自發(fā)熒光在近紅外波段最小
3：更高的特異性和靈敏度
4：光波在近紅外區(qū)段的組織透過(guò)性更好
5：染料細(xì)胞毒性小 可用于標(biāo)記抗體 蛋白 細(xì)胞。因此CY花菁染料是非常適合做小鼠活體成像的熒光染料

CY花菁染料的缺點(diǎn)：

1：菁染料的熒光量子效率相比其他染料較低，一般是0.1-0.2
2：多川結(jié)構(gòu)的菁染料容易發(fā)生聚集

人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。

合肥肽庫(kù)生物科技能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。

紅色加粗的熒光基團(tuán)，為常用基團(tuán)

Alexa Fluor系列

Bodipy系列

常用的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)組合