多肽磷酸化標(biāo)記
1、磷酸化應(yīng)用:磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser,Thr,。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用該方法合成磷酸化多肽也有缺點(diǎn),特別是在合成多磷酸化多肽或氨基酸較長(zhǎng)的多肽的時(shí)候,連接效率低,最后產(chǎn)品純度很低,對(duì)于這種磷酸化多肽,我們考慮采用后磷酸化方法,其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后,選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基,對(duì)于Tyr,Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng),而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化,采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,隨后在過氧酸下氧化生成磷;瓿煞磻(yīng)。
2、磷酸化修飾分類
2.1. L型磷酸化修飾
Thr(H2PO3)、 pT 、蘇氨酸磷酸化
Tyr(H2PO3)、pY 、酪氨酸磷酸化
Ser(H2PO3) 、pS、絲氨酸磷酸化
2.2. D型磷酸化修飾
D-Thr(H2PO3)、p(D-T) 、D型蘇氨酸磷酸化
D-Tyr(H2PO3)、p(D-Y) 、D型酪氨酸磷酸化
D-Ser(H2PO3) 、p(D-S)、D型絲氨酸磷酸化
2.3. 雙磷酸化修飾
一個(gè)序列中有兩個(gè)Thr,Tyr,Ser 位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾。
2.4. 多磷酸化修飾
一個(gè)序列中有多個(gè)Thr,Tyr,Ser 位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾
3、磷酸化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)
4 、磷酸化的作用
蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍,也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾,20世紀(jì)50年代以來一直被生物學(xué)家看作是一種動(dòng)態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程。在細(xì)胞中,大概有1/3的的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是通過磷酸化修飾的。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過程密切相關(guān),如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機(jī)理,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的本質(zhì)。近年來隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的不斷發(fā)展,蛋白質(zhì)磷酸化的研究越來越受到廣泛的關(guān)注。
蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側(cè)鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的必不可少的工具,因此研究蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化反應(yīng)并確定成熟簡(jiǎn)便的合成路線就變得非常重要。目前為止,多肽的磷酸化修飾主要有后磷酸化法和單體法兩種合成方法。后磷酸化法是多肽序列在樹脂上合成完后,再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化;單體法則是將適當(dāng)保護(hù)的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中,這種方法較后磷酸化法操作更為簡(jiǎn)便,已經(jīng)成為多肽磷酸化修飾的主要方法。單體法修飾時(shí),磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修飾的較大基團(tuán)產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合,并且之后的氨基酸引入都會(huì)比較困難,尤其在含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾時(shí),合成將變得異常困難,并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜,難以分離,產(chǎn)率極低。因此,當(dāng)肽鏈中多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化時(shí),可以考慮采用后磷酸化法,其合成過程主要就是在多肽合成結(jié)束之后,選擇性的脫去要標(biāo)記氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基,對(duì)于Tyr,Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。側(cè)鏈保護(hù)基在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化時(shí),可以采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,然后在過氧酸條件下氧化生成磷;瓿煞磻(yīng)。