摘要：G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是哺乳動物體內(nèi)最大的細胞膜表面受體家族，具有7次跨膜螺旋結構，人類基因組編碼約800種不同類型的GPCRs，廣泛參與了代謝性疾病及腫瘤等多種重大疾病的病理過程，使之成為藥物研發(fā)的熱門靶點。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì)，由兩個至幾十個氨基酸通過肽鍵連接而成，是涉及生物體內(nèi)多種細胞功能的生物活性物質(zhì)。迄今為止，研究者已鑒定出7000余種天然肽，分別作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。肽類藥物因具有作用機制明確、安全性好、生產(chǎn)成本低等多重獨特優(yōu)勢及其在空間結構上近乎無限的可能性而逐漸受到重視。近年來，基于對GPCR結構的理解不斷深入，靶向GPCR的肽類藥物發(fā)展迅猛，新藥不斷上市，目前為止，美國食品和藥物管理局(FDA)已批準上市近50種靶向GPCR的肽類藥物，用于治療代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病，肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術開發(fā)３個階段。目前，已上市的靶向GPCR肽類藥物大多是對人體天然內(nèi)源性多肽類配體的改造與修飾，本文歸納了近年來研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物，并簡要總結了目前肽類藥物的研發(fā)策略及未來潛在的發(fā)展方向，旨在為更多靶向GPCR肽類藥物的研發(fā)提供參考。
作為人體內(nèi)最大的細胞膜表面受體家族，Ｇ蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)參與了包括糖尿病、心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等在內(nèi)的多種重大疾病的病理過程。靶向GPCR藥物的開發(fā)一直是藥物研發(fā)的熱點，美國食品和藥物管理局(FDA) 批準的全部藥物中有超過１/３都以GPCR為作用靶點[１]。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì)，由２個至幾十個氨基酸通過肽鍵連接而成，迄今為止，已鑒定出7000余種天然肽，分別作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能[２-３]，在人體內(nèi)，肽類參與多種重要生理過程:例如胰島素(insulin)促進糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成代謝，發(fā)揮降血糖的作用[４-５]。又如催產(chǎn)素(oxytocin)在分娩過程中促進子宮平滑肌的收縮，并刺激乳腺射乳反應[６]。肽作為一類信號分子，通過結合細胞膜表面受體，例如GPCRｓ、離子通道(ion channels) 等，啟動特定的細胞信號轉導過程。近年來，肽類藥物逐漸引起醫(yī)藥界的重視，其憑借生物活性高、安全性好、生產(chǎn)成本低等特性及其在空間結構上近乎無限的可能性被視為藥物研發(fā)的新增長點。在本篇綜述中，歸納了研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物，并簡要總結了目前肽類藥物的研發(fā)策略和未來可能的發(fā)展方向。
１Ｇ蛋白偶聯(lián)受體及其信號轉導通路
人類基因組編碼超過800種GPCR，其配體可以是小分子糖類、脂質(zhì)和多肽，也可以是蛋白質(zhì)等生物大分子，GPCR的共同特點是其立體結構包含7個跨膜 α 螺旋，因此又被稱為,7次跨膜受體，同時其胞內(nèi)區(qū)有G蛋白(鳥苷酸結合蛋白)結合位點[７]。根據(jù)其結構的相似性，GPCR可被分為５類，分別是:視紫紅質(zhì)樣家族、分泌素受體、代謝型谷氨酸受體、黏附素受體以及Frizzled/Taste2受體[８]。2012年，諾貝爾化學獎授予了美國科學家Robert和 BrianK。以表彰他們在GPCR功能及結構研究中的突出貢獻，他們的工作推動了GPCR結構生物學的大發(fā)展，新的GPCR結構不斷被解析公布，使人們對GPCR的結構復雜性及其信號傳導的復雜性有了更深入的認識。
GPCR另一種信號轉導機制由GPCR激酶(GRKs) 和抑制蛋白 (arrestin) 介導[９]，GPCR與GRKs結合導致受體磷酸化，從而終止GPCR與Ｇ蛋白的相互作用，同時，GPCR磷酸化還啟動GPCRｓ與 β-抑制蛋白結合。傳統(tǒng)觀點認為，β-抑制蛋白是作為GPCR信號通路的負反饋調(diào)節(jié)機制存在的。近年來發(fā)現(xiàn)，其也能啟動非Ｇ蛋白依賴的下游信號通路[10-11]。某些配體與GPCR結合可導致受體選擇性與不同亞型的Ｇ蛋白或β-抑制蛋白相互作用，從而有偏向性地激活某些特定的信號通路，這些配體被稱為“偏向性配體”[12]，具有偏向性的配體與受體結合可激活β-抑制蛋白通路，β-抑制蛋白可以與許多下游效應蛋白質(zhì)相互作用，例如MAPK、PKB等，在GPCR信號轉導過程中發(fā)揮關鍵作用[13-14]，這一發(fā)現(xiàn)為靶向GPCR藥物的研發(fā)提供了新的方向:具有偏向性的配體能特異性地激活Ｇ蛋白或者β-抑制蛋白介導的信號通路，相比傳統(tǒng)配體其表現(xiàn)出更強的靶向性。這對提高藥效有重要的意義。
２肽類藥物及其研發(fā)策略
多肽作為藥物具有許多獨特的優(yōu)勢:（1）大量天然肽類可作為配體作用于細胞膜表面受體，據(jù)此開發(fā)的肽類藥物作用機制明確、生物活性高、用藥劑量小；(２)與小分子藥物相比，肽類藥物不通過肝的代謝，其代謝產(chǎn)物為氨基酸，幾乎無毒性且一般不會在特定器官組織中累積，因此副作用發(fā)生率低，安全性好；(３)與蛋白質(zhì)等生物大分子相比，肽類藥物易于合成，容易與雜質(zhì)或副產(chǎn)品分離，純度高，且其研發(fā)周期短，生產(chǎn)成本低，易滿足中等規(guī)模治療的需要[15-17]。鑒于這些良好的藥理特性和固有優(yōu)勢，肽類藥物成為近年來新藥物研發(fā)的熱點。目前，已有50多種靶向GPCR肽類藥物被美國FDA批準。其中大多數(shù)用于代謝性疾病或腫瘤的治療【18】。
肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術開發(fā)３個階段，最初的關注點集中于對人體肽類激素的開發(fā)和利用。目前，上市的藥物大多都是用這個策略合成的，最為典型的例子是胰島素[16]，上世紀80-90年代，研究者利用重組DNA技術制造出高純度的生物合成人胰島素，并通過對肽鏈進行修飾合成了胰島素類似物，實現(xiàn)了速效和長效，上世紀末，研究人員將探索范圍擴大到存在于微生物、植物、動物毒液中的天然肽類[19]。例如，用于2型糖尿病及肥胖癥治療的Exendin-4[19]，繼對天然肽類的大規(guī)模挖掘之后，肽類藥物的研發(fā)走上了利用分子生物學技術進行篩選和開發(fā)的必由之路。
利用分子生物學技術開發(fā)肽類藥物的兩大基礎是高豐度肽庫的建立和合適的篩選策略，1985年，George P Smith通過將肽段融入噬菌體表面蛋白質(zhì)，開發(fā)出了噬菌體展示技術[20]，1990年，George P Smith與Jamie K Scott 將隨機序列肽展示在噬菌體表面，建立了噬菌體展示隨機肽庫[21]。噬菌體展示技術通過多輪親和篩選，可在高豐度隨機肽庫(豐度可達10的九次方)中篩選出與靶蛋白質(zhì)具有高親和力的肽段，通過DNA測序確定候選肽的編碼信息，從而將肽段與靶蛋白質(zhì)的親和力屬性與肽段遺傳信息相關聯(lián)，隨后，新的mRNA展示技術、核糖體展示技術和酵母展示技術等不斷涌現(xiàn)，它們與噬菌體展示技術一起在過去20年中不斷得到發(fā)展與優(yōu)化，理論上能夠針對任何靶蛋白質(zhì)進行基于親和力的高通量篩選[22]，
2014年，美國Scripps研究所Lerner課題組利用一種哺乳動物細胞系中的自分泌信號系統(tǒng)，成功篩選出GLP-1R的新型肽類激動劑P5作為治療２型糖尿病的潛在藥物[23]，這項技術通過血小板源生長因子受體跨膜結構域(PDGFR-TM)，將候選肽段展示于哺乳動物細胞表面，結合目標跨膜蛋白質(zhì)的功能報告系統(tǒng)，利用流式細胞術與高通量測序篩選靶向跨膜蛋白質(zhì)的肽類激動劑[23-25]，該系統(tǒng)通過在哺乳動物細胞中過表達目標跨膜蛋白質(zhì)，而非固相化的重組蛋白質(zhì)，最大程度上保持了其天然狀態(tài)，并且利用報告系統(tǒng)實現(xiàn)了基于功能的篩選。
３ 靶向Ｇ蛋白偶聯(lián)受體的肽類藥物及其發(fā)現(xiàn)
人體內(nèi)有多種GPCR的內(nèi)源性多肽類配體，例如降鈣素、催產(chǎn)素、生長抑素、胰高血糖素樣肽、加壓素、甲狀旁腺素和促性腺激素釋放激素等，對這些多肽的改造和修飾是多肽藥物開發(fā)的主要方向之一[18]。目前，上市的將近50種靶向GPCR的肽類藥物的主要靶點包括胰高血糖素樣肽受體、甲狀旁腺素受體、生長抑素受體、促性腺激素釋放激素受體、加壓素/ 催產(chǎn)素受體和鈣敏感受體等。用于治療代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病。已上市的多肽藥物多是通過化學合成(例如固相多肽合成法)，或者基因重組技術合成的擁有與內(nèi)源性多肽配體相似序列的多肽類似物及其衍生物，
下文將重點介紹幾類研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物(見Table2)。
3.1 靶向胰高血糖素樣肽1受體的肽類藥物
胰高血糖素樣肽-１受體(GLP-1R)主要在胰腺中表達，其激動劑類藥物是近年來降糖藥物研發(fā)的熱點，GLP-1R的天然多肽類配體胰高血糖素樣肽１( GLP-1) 是37個氨基酸的肽，攝入葡萄糖后，腸道內(nèi)分泌Ｌ細胞合成并分泌GLP-1，作用于GLP-1R引起細胞內(nèi)cAMP增加，促進葡萄糖誘導的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放[26]，除了其特有的葡萄糖依賴的胰腺作用外，GLP-1還發(fā)揮著降低食欲和促進飽腹感的中樞作用，突出了其作為糖尿病或肥胖癥療法的潛力[27-28]，天然GLP-1半衰期短，會被體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV) 迅速降解并被腎清除，不適合直接作為藥物應用，目前，已有7種多肽類GLP-1R激動劑上市，用于治療2型糖尿病。
3.1.2 胰高血糖素樣肽1衍生物 另一種策略則側重于修飾天然的GLP-1例如利拉魯肽、阿必魯肽、度拉魯肽和索馬魯肽,利拉魯肽于2010年獲得FDA批準，其將天然GLP-1上的第34位賴氨酸替換為精氨酸，并在第26位賴氨酸上增加了1個連接谷氨酸的C16棕櫚脂肪酸側鏈，從而增加了其與血漿白蛋白的結合，降低了DPP-IV的酶切作用和腎的清除速率[35]，除以與Exenatide類似的機制發(fā)揮降糖作用外，利拉魯肽與GLP-1R結合后還能延緩胃排空，在治療肥胖癥方面效果顯著[36]。阿必魯肽和度拉魯肽均是以融合蛋白質(zhì)形式生產(chǎn)出來的。阿必魯肽是通過基因重組技術利用酵母產(chǎn)生的，與人血清白蛋白融合，其將天然GLP-1上第2位的丙氨酸替換為甘氨酸以抵抗DPP-IV降解，度拉魯肽是利用哺乳動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的，共價連接到人IgG4-Fc重鏈上，這些修飾分別降低了這2種藥物腎的清除率，增加了其藥理活性的持續(xù)時間[37]。
與上述幾種GLP-1R激動劑相比，索馬魯肽最主要的突破是實現(xiàn)了GLP-1R激動劑的長效制劑和口服制劑，2017年，索馬魯肽注射劑被FDA批準上市，可延長到每周注射１次，其長效機制是基于對結構的化學修飾，在索馬魯肽中，天然GLP-1的第8、34位氨基酸分別被2-氨基異丁酸和精氨酸取代，使其能有效避免被DPP-IV降解，并且，其中天然GLP-1的第26位賴氨酸被硬脂酸酰化，能夠使其與人血清白蛋白結合,從而延長血漿半衰期并避免被腎快速清除，這些修飾都延長了多肽在體內(nèi)循環(huán)的時間，使其半衰期可以達到 7d之久[38]。索馬魯肽口服制劑剛于2019年被FDA批準上市，其利用了Eligen公司研發(fā)的基于促吸收劑的大分子遞送技術:大分子藥物被多個促吸收劑SNAC[8-(２-羥基苯甲酰胺基) 辛酸鈉]分子包裹形成脂質(zhì)體結構，可保護多肽藥物不被胃中的酶類降解[38]
3.2 靶向胰高血糖素樣肽2受體的肽類藥物
胰高血糖素樣肽2受體(GLP-2R)主要分布于胃腸道組織中，通過cAMP依賴性信號轉導途徑實現(xiàn)對胃腸道的調(diào)控，增強腸道營養(yǎng)吸收。GLP-2R的天然肽類配體胰高血糖素樣肽２(GLP-2)是由33個氨基酸組成的腸源性多肽，由腸道內(nèi)分泌 L細胞分泌,可被DPP-IV快速降解，半衰期非常短，僅為7min[39-40]。替度魯肽是一種由DNA重組技術合成的GLP-2類似物，2012年被FDA批準為治療依賴腸外營養(yǎng)支持的成人短腸綜合征的孤兒藥[41]，短腸綜合征（SBS）是一種罕見的具有潛在生命危險的吸收不良疾病，其原因是先天性缺陷、疾病導致的吸收障礙或廣泛手術切除導致大部分腸道功能喪失[40-41]。當SBS患者腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)和水的能力不能滿足機體需要時，需要腸外營養(yǎng)支持，在替度魯肽中，天然GLP-2的第2位丙氨酸被替換為甘氨酸以抵抗DPP-IV降解、延長血漿半衰期，其可通過作用于GLP-2R來發(fā)揮生物學作用，實現(xiàn)對胃腸道的調(diào)控，減少胃排空和分泌，并促進小腸粘膜上皮細胞的生長、增殖和修復，從而增加小腸吸收、減少腹瀉[40-42]。
3.3 靶向甲狀旁腺素1受體的肽類藥物
甲狀旁腺素1受體( PTH1R)主要表達于腎和骨骼，存在2種不同的高親和性構象:Ｇ蛋白非依賴構象(R0)和Ｇ蛋白依賴構象(RG)。與R0構象親和力更高的配體主要激活 β-抑制蛋白信號通路而引發(fā)受體內(nèi)吞，觸發(fā)長時程信號反應，與RG構象親和力更高的配體主要激活G蛋白介導的cAMP依賴性信號轉導通路，觸發(fā)瞬時信號反應[43]。甲狀旁腺激素(PTH) 和甲狀旁腺激素相關肽( PTHrP) 是骨代謝過程中重要的調(diào)節(jié)因子，甲狀旁腺激素相關肽的Ｎ-末端含有甲狀旁腺激素同源序列。二者均可作用于PTH1R通過cAMP依賴性的PKA信號轉導通路調(diào)節(jié)骨代謝[44]。不同的是甲狀旁腺激素主要調(diào)節(jié)鈣的穩(wěn)態(tài)和骨吸收，而甲狀旁腺激素相關肽是促進骨形成的關鍵肽。
3.3.1 甲狀旁腺激素類似物 特立帕肽是含有34個氨基酸的甲狀旁腺激素類似物,也是第1個被FDA批準上市的調(diào)節(jié)骨代謝的肽類藥物，其主要作用于甲狀旁腺素1受體的R0構象，促進 β-抑制蛋白的結合而導致內(nèi)吞過程，可持續(xù)調(diào)節(jié)cAMP含量，從而持續(xù)性激活下游信號通路，介導長時程信號轉導，加快骨吸收[18，43-45]。
3.3.2 甲狀旁腺激素相關肽類似物 阿巴洛肽是第1個被開發(fā)的甲狀旁腺激素相關肽類似物,具有34個氨基酸。于2017年被FDA批準用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的治療。其主要作用于甲狀旁腺素1受體的RG構象，引發(fā)瞬時的cAMP含量的增高，介導短暫的信號反應，促進骨形成的能力超過骨吸收[18,43]。這 ２ 種藥物靶向同一受體甲狀旁腺素1受體，但由于其構象偏好性存在差異，它們激活同一靶點的下游信號通路不同，導致阿巴洛肽對于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的療效優(yōu)于 特立帕肽[44]。這也啟示在研發(fā)靶向GPCR的肽類藥物時應考慮其構象偏好性。
3.4 靶向生長抑素受體的肽類藥物
生長抑素受體(SSTR) 家族包括SSTR1-5，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、垂體和許多外周器官[46]，生長抑素受體的天然配體生長抑素(SST) 與受體結合可誘導cAMP依賴性信號轉導途徑，抑制各種促腫瘤生長的激素和生長因子的釋放，從而抑制癌細胞增殖或誘導癌細胞凋亡，生長抑素對受體具有很高的親和力，但在血漿中的半衰期非常短，僅為1-3min[47]。一種人工合成的天然生長抑素的八肽衍生物——環(huán)狀生長抑素受體激動劑奧曲肽可用于治療神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和肢端肥大癥[46]。通過引入D-氨基酸，奧曲肽血漿半衰期可達72-113min,并可選擇性地與生長抑素受體2和生長抑素受體５結合[46]，奧曲肽與生長抑素受體結合后，通過PLC介導的信號轉導通路，產(chǎn)生第二信使IP3并可激活L型Ca2+通道，抑制生長激素的產(chǎn)生，Pasireo-tide(帕瑞肽)是另一種生長抑素受體激動劑，是美國和歐盟批準的治療庫欣綜合征的孤兒藥[48].Pa-sireotide對生長抑素受體５的親和力較高。能抑制促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌，使庫欣綜合征患者的皮質(zhì)醇分泌減少[49]。
3.5 靶向促性腺激素釋放激素受體的肽類藥物
促性腺激素釋放激素受體( GnRHR) 主要在垂體和生殖系統(tǒng)相關的組織器官中表達，其天然肽類配體促性腺激素釋放激素 (GnRH)是下丘腦分泌產(chǎn)生的一種十肽神經(jīng)激素，在生殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[50]
3.5.2 促性腺激素釋放激素受體拮抗劑Degarelix 在激素敏感型前列腺癌的治療中，Leuprolide所導致的睪酮水平的初始升高反而會使前列腺癌的癥狀加重，這促使研究者進一步開發(fā)了促性腺激素釋放激素受體拮抗劑，2008年，F(xiàn)DA批準了一種促性腺激素釋放激素受體拮抗劑Degarelix(地加瑞克)，用于治療晚期前列腺癌[54]，Degarelix與促性腺激素釋放激素受體可逆性結合，下調(diào)細胞內(nèi)cAMP含量，通過抑制cAMP依賴的GPCR信號通路減少促性腺激素的釋放，進而減少睪酮的釋放以阻止前列腺癌的生長和惡化，通過在肽鏈的第5/6位引入Ｐ-脲基苯丙氨酸在實現(xiàn)藥物作用時間延長的同時也避免了因組胺釋放引起的超敏反應[55]，有研究表明，在治療晚期前列腺癌方面，Degarelix優(yōu)于Leuprolide【56】。
3.6 靶向加壓素/催產(chǎn)素受體的肽類藥物
加壓素受體(VRs) 包括V1AR、V1BR和V2R。V1AR主要在肝、血管平滑肌和血小板中表達，促進血管收縮和血小板聚集。V1BR主要在垂體中表達，可促進促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放。V2R主要在腎集合管中表達。具有抗利尿作用[57-59]。催產(chǎn)素受體(OTRs) 主要分布于子宮和乳腺[60]。加壓素和催產(chǎn)素均為九肽，主要通過結合其受體來發(fā)揮作用。V1AR、V1BR與催產(chǎn)素受體作用機制相似，主要通過偶聯(lián)的Ｇαｑ/11刺激PLC的活性，釋放IP3和DAG，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放[60,61]。而V2R主要與Ｇαs偶聯(lián)，激活AC產(chǎn)生cAMP，誘導PKA激活[62]�？ㄘ惪s宮素是人工修飾的催產(chǎn)素類似物，天然催產(chǎn)素酚羥基上的氫被甲基取代，半胱氨酸殘基上的氨基和硫分別被氫和亞甲基取代，這些修飾延長了卡貝縮宮素的作用時間[63]，卡貝縮宮素可與子宮平滑肌催產(chǎn)素受體結合，誘導子宮節(jié)律性收縮，增加子宮收縮頻率和強度，適用于控制分娩后出血[63]，去氨加壓素是人工合成的九肽化合物，2017年被FDA批準用于治療中樞性尿崩癥，其對V2R作用最強，可通過提高腎集合管上皮細胞cAMP水平促使腎血管舒張發(fā)揮抗利尿作用，因此與天然加壓素相比，去氨加壓素抗利尿作用顯著增強，而對平滑肌的作用卻減弱，從而避免了高血壓引起的不良作用[64]。
3.7 靶向鈣敏感受體的肽類藥物
４ 問題與展望
肽類藥物以其生物活性高、低毒性、安全性好等特點成為了近年藥物研發(fā)的熱點，尤其是結構上近乎無限的可能性使之更適合于靶向GPCR。然而，噬菌體展示等技術在很大程度上依賴于活性重組蛋白質(zhì)的制備與固相化，目前尚不能針對GPCR、離子通道、 酪氨酸激酶受體(RTK)等跨膜蛋白質(zhì)進行篩選[16,23]，另外，基于親和力的篩選過程并不能區(qū)別跨膜蛋白質(zhì)的激動劑和拮抗劑，即不能進行功能篩選[23]。
我們課題組開發(fā)了一種基于線性雙鏈DNA的“與門(AND Gate)”邏輯基因線路設計新策略，通過PCR反應將完整的基因表達模塊(啟動子-基因編碼區(qū)-poly(Ａ)尾信號)拆分為2個線性雙鏈DNA分子引入哺乳動物細胞，其在細胞內(nèi)經(jīng)非同源末端連接(NHEJ),或同源重組(HR)機制連接在一起重新形成完整基因表達模塊，實現(xiàn)“與門”運算及基因表達[68](見Fig.2)。由此，我們建立了一種在哺乳動物細胞系內(nèi)引入高豐度肽庫的方法，隨著基于哺乳動物細胞系的高豐度肽庫構建策略的開發(fā)及自分泌篩選體系的建立，靶向GPCR的肽類藥物篩選體系將不斷完善并趨于成熟，這將為更多肽類藥物的開發(fā)建立堅實的基礎。
