［摘 要］ 抗菌藥物濫用導致細菌耐藥形勢不斷加劇，細菌耐藥性已成為日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。本文介紹不同抗菌藥物如何發(fā)揮抗菌作用，以及細菌通過改變細胞膜通透性等方式產(chǎn)生耐藥性的機制。為解決細菌耐藥性問題，學者們提出了抗菌藥物聯(lián)合應用的協(xié)同抗菌策略，以期通過多靶點、多途徑的作用方式，降低細菌產(chǎn)生耐藥的概率，同時提高抗菌效力。本文從協(xié)同抗菌機制出發(fā)，對不同抗菌藥物聯(lián)合應用的協(xié)同抗菌作用進行綜述，并重點介紹抗菌肽與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合應用的協(xié)同效果，以及在不同領域應用的研究進展，旨在進一步推動抗菌肽等新型抗菌藥物應用策略創(chuàng)新，抑制細菌耐藥性的發(fā)展。
抗菌藥物是一類能夠抑制細菌、真菌等病原微生物生長繁殖或直接殺滅病原微生物的化學物質(zhì)，如抗生素、抗菌肽等。自1928年英國科學家弗萊明發(fā)現(xiàn)第一個抗生素—青霉素以來，抗生素被廣泛應用于疾病的防治中，挽救了無數(shù)的生命。起初，抗生素是一種被用作治療細菌感染的藥物，然而近年來抗菌藥物的超標使用、無節(jié)制濫用，導致細菌耐藥性問題日益嚴重。技術迭代緩慢致使新藥研發(fā)困難，細菌產(chǎn)生耐藥的速度遠超過新抗菌藥物研發(fā)速度，抗菌藥 物 尤 其 是 抗 生 素 領 域 的 專 利 申 請 數(shù) 量 在2011年后呈現(xiàn)下降的趨勢，世界范圍內(nèi)即將面臨重癥細菌感染無藥可用的境地。因此，合理使用現(xiàn)有抗菌藥物，提升抗菌藥物的利用效率，抑制細菌耐藥性的發(fā)展迫在眉睫。本文就不同抗菌藥物的抗菌機制，以及細菌產(chǎn)生耐藥性的特點，重點介紹極具抗生素替代潛質(zhì)的AMPs與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合抗菌的策略。該策略作為一種新的治療耐藥細菌感染和減少細菌耐藥性產(chǎn)生的有效方法，發(fā)揮協(xié)同增效的抗菌作用，降低單個抗菌藥物的用量，創(chuàng)新AMPs應用策略，為解決傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性問題提供新方向。
１ 抗菌藥物的抗菌機制
抗菌藥物的抗菌機制主要有以下４種：抑制細菌細胞壁的形成，破壞細胞 膜結(jié)構，干擾細菌內(nèi)ＤＮＡ 的復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯，破壞蛋白質(zhì)合成。值得注意的是，抗菌藥物不僅可以通過其中某一種機制發(fā)揮抗菌作用，也可以通過多種機制相結(jié)合的方式發(fā)揮抗菌效力。
在DNA復 制 過 程 中，DNA拓 撲 異 構 酶 催 化DNA鏈的斷裂與結(jié)合，影響DNA鏈的拓撲狀態(tài)。旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構酶ＩＶ作為DNA復制過程中最重要的兩個拓撲異構酶，是抗菌藥物常見靶點。目前DNA聚合酶也是研究較為廣泛的藥物潛在靶點。此外，抗菌藥物可以通過與ＲＮＡ 聚合酶結(jié)合，干擾細菌DNA轉(zhuǎn) 錄 及 ＲＮＡ 延 伸，起到殺菌作用。部分抗菌藥物還能夠通過干擾蛋白質(zhì)合成起始階段、肽鏈的 延伸、氨基酸代謝等發(fā)揮抗 菌功能。某些富含脯氨酸的 ＡＭＰｓ可以被細菌的特殊轉(zhuǎn)運載體經(jīng)主 動 運輸?shù)郊?胞內(nèi)特定靶點，與70S核糖體相互作用進而破壞蛋白質(zhì)合成，達到殺滅細菌的目的。
２ 細菌耐藥性的產(chǎn)生
耐藥的發(fā)生是細菌在持續(xù)抗菌藥物作用下，感受自身所處的不良環(huán)境條件而產(chǎn)生的防御機制。細菌通過細胞膜通透性改變，主動外排泵系統(tǒng)過表達，作用靶點結(jié)構改變，抗菌藥物的破壞與修飾，以及攜帶外源性耐藥基因等方式對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，如圖２所示
細胞膜的通透性以及抗菌藥物進入細胞的能力是決定藥物療效的關鍵性因素，一些細菌細胞膜通道或細胞壁孔道的改變，使得抗菌藥物不易進入菌體，進而產(chǎn)生耐藥性。藥物外排泵在細菌中普遍存在，不僅能減少抗菌藥物在細菌細胞內(nèi)的積累，還為細菌提供了足夠的時間適應不同藥物，進入菌體的藥物在外排泵作用下迅速排出，菌體細胞內(nèi)藥物濃度降低，耐藥性隨之產(chǎn)生。藥物靶點結(jié)構的改變則會降低藥物與靶點的親和力，進而導致抗菌藥物活性減弱或失活，是細菌產(chǎn)生耐藥性的另一重要機制。此外，抗菌藥物在發(fā)揮作用的過程中其本身也可能被降解或發(fā)生結(jié)構改變，該過程往往有酶的參與。一方面，蛋白酶的水解作用導致對酶敏感的抗菌藥物的關鍵反應中心被破壞或發(fā)生不易逆轉(zhuǎn)的結(jié)構重排；另一方面，抗菌藥物的共價修飾阻礙藥物與其靶點的相互作用，從而導致耐藥的產(chǎn)生。
如果僅依靠上述耐藥機制，細菌的多重耐藥不易在短時間內(nèi)暴發(fā)。此外，細菌還通過偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導獲得攜帶耐藥基因的 ＤＮＡ 元 件，以 水 平 基 因 轉(zhuǎn) 移 的方式從其他細菌中獲得外源性耐藥基因，整合入自身基因組而產(chǎn)生MDR。
３ 聯(lián)合用藥協(xié)同抗菌
由于細菌耐藥性的持續(xù)發(fā)展，致使很多嚴重的臨床細菌感染使用現(xiàn)有抗菌藥物很難達到理想的治療效果，而新藥研發(fā)緩慢，成本較高，推廣困難，且同樣存在引發(fā)耐藥性的風險。因此，基于不同抗菌藥物對細菌抗菌機制不同而進行聯(lián)合用藥，有望成為對抗細菌耐藥性的新策略。此策略能夠?qū)F(xiàn)有抗菌藥物進行再利用，使抗菌效果最大化，避免新藥研發(fā)的巨額費用。與單一抗菌藥物相比，抗菌藥物聯(lián)用具有多靶點的抗菌作用方式，能夠有效殺滅耐藥菌株，并抑制細菌耐藥性的發(fā)展。
除單一細菌自身能夠?qū)咕幬锂a(chǎn)生耐藥性外，細菌黏附于物體表面，通過分泌多糖等物質(zhì)使彼此聚集在一起并進一步增殖，最終形成致密的具有屏障作用的生物膜，抵抗抗菌藥物的作用，使得細菌的耐藥性大幅度提高。因此，有學者將對細菌生膜具有高度破壞作用的抗菌藥物與其他不具有生物膜破壞作用或破壞作用較小的抗菌藥物聯(lián)用，以期能夠發(fā)揮協(xié)同抗菌活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，ＡＭＰｓ能夠破壞細菌生物膜，當 ＡＭＰｓ與抗菌藥物聯(lián)合使用時，ＡＭＰｓ的抗生物膜特性能夠提高抗菌藥物的抗菌效果。
3.2 傳統(tǒng)抗菌藥物的聯(lián)合應用 傳統(tǒng)方法的單一抗菌藥物治療細菌感染很容易引起耐藥，而抗菌藥物聯(lián)合應用，即同時使用兩種或兩種以上的抗菌藥物，通過作用于多個靶點，從而提高抗菌效果，延緩耐藥性的發(fā)展，是目前對現(xiàn)有傳統(tǒng)抗菌藥物再利用的有效方式。
抗菌藥物的協(xié)同抗菌活性可通過棋盤法測定聯(lián)合用藥時抗菌藥物的最低抑菌濃度計算部分抑菌濃度指 數(shù)來評價，當FIC index≤0.5時，判定為協(xié)同作用；當0.5＜FIC index＜４時，判定為無相互作用；當FIC index≥４時，判定為拮抗作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，將妥布霉素與特殊官能團連接，設計獲得的兩親性妥布霉素衍生物可以顯著提高利福平或二甲胺四環(huán)素對多重耐藥銅綠假單胞菌的抗菌活性，表現(xiàn)出極強的協(xié)同抗菌作用，其FIC index達到0.039。兩者的協(xié)同機制研 究發(fā) 現(xiàn)，兩 親性妥布霉素衍生物能夠影響細胞膜上呼吸鏈的電子傳遞進而降低 ＡＴＰ 的生成，抑制細胞膜上抗菌藥物外排泵的功能，進而發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。細菌細胞膜上抗菌藥物外排泵的過表達是很多細菌產(chǎn)生耐藥性的主要機制之一，目前研究的抗菌藥物外排泵抑制劑如１－（１－萘甲基）哌嗪等能夠恢復某些革蘭陰性菌對抗菌藥物的敏感性，但對于通過細胞壁屏障作用產(chǎn)生內(nèi)源耐藥性的細菌有效性大大降低。因此，增強細胞膜通透性同時降低抗菌藥物外排泵功能是解決此問題的理想策略。本課題組將妥布霉素作為載體，與１－（１－萘甲基）哌嗪等不同外排泵抑制劑相連，獲得了一系列化合物，該化合物與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合應用，顯著提高了氟喹諾酮類抗菌藥物環(huán)丙沙星、莫西沙星對耐藥性銅綠假單胞菌的抗菌活性.
金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性球形細菌，能夠引起局部感染甚至危及生命，萬古霉素和環(huán)丙沙星等常被用于治療金黃色葡萄球菌感染。為避免單獨使用這些抗菌藥物在治療過程中可能引發(fā)的耐藥性問題，Kamble等提出聯(lián)合使用不同抗菌藥物，將達托霉素和萬古霉素這類針對細胞結(jié)構的抗生素與另一種作用于 ＤＮＡ 復制或蛋白質(zhì)合成過程的抗菌藥物如環(huán)丙沙星或妥布霉素兩兩組合；所有組合均顯示出協(xié)同效應，并以劑量依賴的方式抑制和破壞生物膜。由此可見，這些傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合使用比單獨使用兩者中任何一種藥物更為有效，并有望緩解細菌耐藥問題。
3.3 AMPs與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合應用 MDR菌的出現(xiàn)以及隨后使用傳統(tǒng)抗菌藥物治療的失敗，助推了新型抗菌藥物的研發(fā)。AMPs作為生物體天然免疫系統(tǒng)的組成部分，鑒于其廣譜的抗菌活性、無殘留、無污染等特點，被認為具有開發(fā)為新型抗菌藥物替代抗生素的潛質(zhì)。更重要的是，普遍認為AMPs通過破壞細菌的細胞膜結(jié)構完整性發(fā)揮抗菌作用，此種抑菌方式不易引發(fā)耐藥性，同時也為聯(lián)合用藥研究提供了理論基礎。目前，關于AMPs與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合使用的研究已有諸多報道，且普遍認為二者的協(xié)同抗菌機制是AMPs對細菌細胞膜的破壞作用，致使細胞內(nèi)抗菌藥物濃度升高。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，具有細菌細胞膜破壞活性的AMPs與多種抗菌藥物聯(lián)用能夠提高抗菌活性，且對臨床分離的耐藥菌株也具有較好的抗菌活性。如富含脯氨酸的脂肽 Ｃ１２-ＰＲＰ在與二甲胺四環(huán)素或利福平聯(lián)合應用時，可顯著提高二者對 ＭＤＲ和廣譜耐藥銅綠假單胞菌的抗菌活性，脂肽Ｃ１２-ＰＲＰ具有進一步開發(fā)為抗菌藥物佐劑的潛質(zhì)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，AMPs與同樣作用于細菌細胞膜的抗菌藥物聯(lián)合應用時也可以產(chǎn)生協(xié)同抗菌效果。Fi等研究發(fā)現(xiàn)，AMPsNisin與抗生素多黏菌素 Ｅ 聯(lián)合應用時，AMPsNisin大幅降低多黏菌素 Ｅ 抑制細菌生物膜所需的藥物濃度，提高抗生素的抗菌效率和細菌對抗生素的敏感性。Ja等研究表明，AMPsNisin和多黏菌素 Ｅ聯(lián)合應用對廣譜耐藥型鮑曼不動桿菌和多黏菌素 Ｅ 耐藥性銅綠假單胞菌均表現(xiàn)出協(xié)同抗菌活性。
部分AMPs存在一定細胞毒性且易被蛋白酶水解，也是制約其在臨床中應用的又一重要原因。目前，為了最大限度地提高AMPs對不同細胞的選擇性，一些研究試圖通過序列修飾、肽鏈雜合和氨基酸替代等方法對AMPs進行修飾或改造。AamAP1-Lysine是以蝎毒中發(fā)現(xiàn)的AMPsAamAP1作為基礎設計獲得的一種合成肽衍生物，其與左氧氟沙星、氯霉素、利福平、紅霉素聯(lián)合應用時，對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同抗菌作用，且在一些組合中AamAP1-Lysine的最小抑菌濃度甚至從３μｍｏｌ／Ｌ降低至０．０１μｍｏｌ／L。Almaaytah等［５１］對 AamAP1-Lysine與利福平聯(lián)用的抗生物膜活性研究中，測得FICindex低至０．０５８，表現(xiàn)出強協(xié)同作用。Ｄｕａｎ 等研 究 也 發(fā) 現(xiàn)，來 源 于 斑 馬 魚 的AMPs衍生肽 Ｐｔ５-１ｃ與抗生素聯(lián)用后促進抗生素進入細菌細胞，從而對 ＭＤＲ 菌產(chǎn)生協(xié)同抗菌效應以及抗生物膜效應。
3.4 AMPs與其他化合物的協(xié)同抗菌作用 除傳統(tǒng)抗菌藥物外，某些 AMPs與其他化合物也可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用。如蜂源 AMPsMelittin是一種研究比較透徹的水溶性好、系統(tǒng)毒性高的AMPs。Melittin能夠破壞細菌細胞膜，具有強抗菌活性［５３］。孫楠等［５４］研究發(fā)現(xiàn)，Melittin與檸檬酸聯(lián)合應用時對大腸埃希菌、腸炎沙門菌及金黃色葡萄球菌均顯示出協(xié)同抗菌效應，當與乙酸聯(lián)合應用時對腸炎沙門菌表現(xiàn)為協(xié)同抗菌作用。微生物源AMPs是由微生物分泌的用來保護自身并殺滅或抑制其他微生物的小分子多肽，通常具有廣譜抗菌活性，如利用側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的AMPsBrevilaterin。寧亞維等研究證實，AMPs與檸檬酸兩者協(xié)同抑制大腸埃希菌的生長，破壞細菌細胞膜的完整性，導致細胞變形、ＤＮＡ 降解及細胞內(nèi)容物泄漏。檸檬酸能夠有效抑制有機酸的降解，延緩食物腐敗，同時AMPs與檸檬酸聯(lián)合應用降低了單個抗菌藥物的使用量，有望在食品保鮮中推廣應用。
４ AMPs與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合應用進展
４.1 食品防腐 AMPs用作防腐劑，具有熱穩(wěn)定性好、安全無毒、抗菌性強等優(yōu)點，因此在食品的防腐和保鮮中具有廣闊的應用前景。 AMPsNisin在人體內(nèi)不會長期積累，毒性小，作為食品防腐劑具有很高的安全性，且在某些地區(qū)已經(jīng)被批準在食品貯藏中使用。Mirhoseini等研究發(fā)現(xiàn)，Nisin與氧化鎂納米顆粒具有協(xié)同抗菌效應，應用于牛奶的殺菌滅活中，能夠降低牛奶中大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的菌群數(shù)量。Nisin與香芹酚的聯(lián)用同樣能抑制牛奶中細菌繁殖，有望成為奶制品的保鮮策略。此外，Ｌｉ等［６１］將β-環(huán)糊精與Nisin聯(lián)合應用，有效提高了Nisin在胰蛋白酶中的穩(wěn)定性，延緩Nisin的降解，顯著抑制低熟豬肉中細菌的生長繁殖，使豬肉保持原有營養(yǎng)價值和獨特的風味。
4.2 醫(yī)藥衛(wèi)生 目前，由MDR菌引起的醫(yī)院獲得性感染嚴重危害公共衛(wèi)生安全，迫切需要研發(fā)新的抗菌策略攻克細菌耐藥性。AMPs具有多種生物學功能，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。在AMPs臨床應用策略創(chuàng)新研究中，Salouti等發(fā)現(xiàn)，當AMPsMBP-1與銀納米粒子聯(lián)合使用時，顯著降低金黃色葡萄球菌的定植率，提高傷口愈合率�？咕幬锫�(lián)合應用在體內(nèi)的協(xié)同抗菌活性也得到證實。張馨元等研究發(fā)現(xiàn)，AMPs LL-37和酰胺酶聯(lián)合使用抑制感染糞腸球菌小鼠體內(nèi)臟器中細菌的增殖，減輕臟器病理損傷。探索其協(xié)同機制發(fā)現(xiàn)，酰胺酶先破壞細菌細胞壁，有利于AMPs LL-37接觸到細菌細胞膜，LL-37不僅能破壞細胞膜結(jié)構引菌體細胞內(nèi)容物外泄，還能夠與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸相結(jié)合，影響細胞的生命活動，兩機制相輔相成有效提高對糞腸球菌的殺傷效率。與此同時，該方法降低酰胺酶的使用量，抑制細菌耐藥性的產(chǎn)生。最近研究發(fā)現(xiàn)。LL-37與萬古霉素、阿奇霉素、多黏菌素等抗生素聯(lián)合使用有望成為治療銅綠假單胞菌感染的新策略。此外，AMPs LP-23、DP-23和SPO與慶大霉素聯(lián)用對臨床分離的耐慶大霉素的大腸埃希菌表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，進一步證實了AMPs與抗菌藥物聯(lián)用在治療耐藥菌株引起的細菌感染方面具有很大潛力。
4.3 動物養(yǎng)殖 在動物養(yǎng)殖中，AMPs可用于改善動物健康狀況，促進動物生長，提高生長性能。王莉等研究證實，天蠶素和β-甘露聚糖酶對鵪鶉的生長有協(xié)同促進作用，一種合理的解釋是β-甘露聚糖酶可降解甘露聚糖成為甘露寡糖，而甘露寡糖和AMPs均可刺激機體免疫系統(tǒng)細胞，減少腸道有害菌，提高日增重，降低料肉比。在肉雞日糧中聯(lián)合添加天蠶素和合生素改善了肉雞小腸黏膜結(jié)構，促進小腸黏膜免疫細胞增殖。另一個被廣泛研究的豬源AMPs PR-39與阿莫西林、土霉素、硫酸鏈霉素聯(lián)合應用，針對畜禽常見病原菌表現(xiàn)出明顯協(xié)同抗菌作用。
５ 小結(jié)與展望
