細胞穿膜肽在藥物遞送系統(tǒng)中的研究進展
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作者：范 博 金明姬 黃 偉 王啟明 高鐘鎬，文章編號: 0513-4870 (2016) 02-0264-08,期刊：藥學(xué)學(xué)報，參考文獻可閱讀原文
摘要:
細胞膜是蛋白質(zhì)、核酸及藥物分子進入細胞的主要生物學(xué)屏障。近年來的研究發(fā)現(xiàn)細胞穿膜肽 (cellpenetrating peptides, CPPs) 能夠有效地將小分子藥物、蛋白質(zhì)、肽類、核酸片段以及納米載體 (如脂質(zhì)體、聚合物膠束、無機納米粒等) 轉(zhuǎn)運穿過細胞膜。本文就細胞穿膜肽的分類及其在介導(dǎo)小分子藥物、蛋白質(zhì)及多肽、核酸和納米載體特別是“智能”納米載體等的轉(zhuǎn)運入胞作用進行了討論。
細胞膜是蛋白質(zhì)、核酸及藥物分子進入細胞的生物學(xué)屏障。如何將藥物安全有效地遞送至靶部位, 突破細胞膜屏障、促進藥物進入細胞是藥物遞送系統(tǒng)尚需解決的主要問題。1988 年 Green 等[1]首次報道了HIV-1 的轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白 Tat 具有穿透多種細胞膜的作用。隨后, 一系列通過耗能或非耗能形式跨過多種細胞膜的小分子多肽 (其長度一般不超過 30 個氨基酸) 被發(fā)現(xiàn), 并被命名為穿膜肽 (cell penetrating peptides, CPPs)[2]。這些穿膜肽能夠內(nèi)化進入哺乳動物、植物和細菌的細胞內(nèi), 有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)具有生物活性的分子、藥物和藥物載體穿過細胞膜[3−5]。
1 細胞穿膜肽的分類
CPPs 是一大類由 10～30 個氨基酸組成的短肽,也稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (protein translocation domain, PTD) 或“特洛伊木馬”肽 (Trojan horse peptides) 或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 (transduction peptide) 等。到目前為止, 已發(fā)現(xiàn)了多種 CPPs, 主要包括轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白 (Tat)[1]、VP22[6]、transportan[7]、模型兩親性肽 (MAP)[8]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)肽[9]和富含精氨酸序列肽[10]。
大多數(shù)已知的 CPPs 不具備明顯的組織特異性 或細胞類型特異性, 而是依賴于生理 pH 環(huán)境下氨基酸 (主要是富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸殘基) 的正電荷序列和細胞表面帶負電荷的糖蛋白之間的靜電相互作用而發(fā)揮作用。在生理 pH 條件下精氨酸的胍頭基可以和細胞表面膜上帶負電的磷酸基和硫酸基產(chǎn)生氫鍵結(jié)合, 進而產(chǎn)生細胞內(nèi)化作用。賴氨酸與精氨酸含有相同的凈正電荷, 但不含有胍頭基, 當其單獨作用時穿過質(zhì)膜的效果會差些。Lindgren 和Langel[3]發(fā)現(xiàn)肽序列中氨基酸的數(shù)量和次序 (主要是精氨酸) 決定著 CPPs 的轉(zhuǎn)導(dǎo)性。因此, 根據(jù)它們在序列、疏水性和極性等方面的特征, CPPs 大致可以分為 3 類。
1.1 陽離子型肽
此類肽富含精氨酸, 具有高度凈正電荷且?guī)缀醪缓嵝园被釟埢? 主要包括 R9[11]、Tat[12]、hLF[13]和 (RXR)4[14]等。研究表明陽離子 CPPs 需要包含至少 8 個正電荷才能有效地被細胞攝取[15]。陽離子 CPPs在進入細胞時一般不會引起細胞應(yīng)答反應(yīng), 卻會影響細胞膜的完整性和活性。
其中兩種陽離子型肽值得一提, 第一種是核定位信號序列肽 (nuclear localization sequences, NLSs), NLSs 是一種較為特殊的陽離子型細胞穿膜短肽[7], 富含賴氨酸 (K)、精氨酸 (R) 或脯氨酸 (P) 殘基, 可以穿過核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運進入細胞核。NLSs 一般又可以分為兩種: ① 單分型 NLSs (monopartite NLSs): 最初發(fā)現(xiàn)于猿猴病毒 40 (SV40) 大 T 抗原中, 它是 一段 4～8 個氨基酸組成的富含堿性氨基酸的短肽(PKKKRKV), 其核心序列可表示為 K(K/R)X(K/R); ② 雙分型 NLSs (bipartite NLSs): 這類核定位信號以核質(zhì)蛋白的核定位序列 (KRPAATKKAGQAKKKK) 為典型, 它是由兩簇堿性氨基酸殘基組成, 兩簇堿性序列之間被 10～12 個非保守氨基酸殘基間隔, 其序列通式可以表示為 R/K(X)10-12RRKK。由于大多數(shù)NLSs 的電荷數(shù)量恰好小于 8, 所以 NLSs 不是有效的CPPs, 但常被用來與疏水性肽序列共價連接以獲得可以被有效攝取的兩親性 CPPs。還有一種是抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs), 抗菌肽是生物體防御外界病原體侵襲時產(chǎn)生的由基因編碼、核糖體合成 的一類小分子活性多肽, 是生物體內(nèi)先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分�？咕脑谶M入細胞的過程中會損傷細菌的細胞膜, 具有殺菌劑的性質(zhì)。在體外, 幾分鐘內(nèi)就可殺傷革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、寄生蟲、病毒及腫瘤細胞。常見的抗菌肽有 LL-37、S413-PV 和Buforin 2 等。
1.2 兩親性肽類
由親水結(jié)構(gòu)域和疏水結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其所帶正電荷主要依賴于賴氨酸殘基, 而兩親性的特征是由其一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)決定的。一級結(jié)構(gòu)的兩親性 CPPs 一般分為兩種: 一 種是疏水結(jié)構(gòu)域與 NLSs 共價連接, 包括 MPG[16]、penetratin[17]和 CADY[18]等。以 MPG 為例, MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV) 的 親 水 區(qū)是 SV40 NLS PKKRKV, 而疏水區(qū)則是源自 HIV 糖 蛋白 41 的融合序列, 兩個區(qū)域通過 WSQP 連接鍵連接; 另一種則是全部由天然蛋白質(zhì)分離獲得, 如血管內(nèi)皮−鈣黏蛋白 (pVEC)[19]、ARF (1−22)[20]和 BPrPr (1−28)[21]。二級結(jié)構(gòu)的兩親性 CPPs 具有 α-螺旋的空間構(gòu) 象, 其親水性氨基酸殘基 (親水端可以為陽離子、陰離子或極性基團) 和疏水性氨基酸殘基分別位于螺旋結(jié)構(gòu)的不同表面。富含脯氨酸序列或多聚脯氨酸序列的肽是此類肽的代表, 它們都含脯氨酸−吡咯烷基團[22], 在水中能形成螺旋狀結(jié)構(gòu), 如包含 50% 脯氨酸殘基、來源于玉米儲藏蛋白的芳香箭頭肽 (sweet arrow peptide, SAP), 其序列為 VRLPPP。
1.3 疏水性肽
此類 CPPs 僅含非極性殘基, 目前僅發(fā)現(xiàn)少量的疏水性 CPPs, 比如從整合素 β3 中發(fā)現(xiàn)的信號序列VTVLALGALAGVGVG 以及卡波濟成纖維細胞生長因子 (AAVALLPAVLLALLAP)[15]。一方面, 不同類型的 CPPs 具有不同的穿膜行為; 另一方面, 與 CPPs 相連的藥物或載體的大小及理化性質(zhì)、肽的長度和濃度以及細胞類型等因素都顯著影響其穿膜效應(yīng)。
2 細胞穿膜肽與藥物或載體的連接方式
CPPs 能夠輸送種類繁多的物質(zhì)進入細胞, 被轉(zhuǎn)運物質(zhì)的理化性質(zhì)也不盡相同。因此, 需要不同的連接方法將 CPPs 與被轉(zhuǎn)運物質(zhì)連接。其中, 連接方式對 CPPs 在攝取水平和方式上有重要影響。
2.1 共價連接
共價連接是最常見的方法。通過穩(wěn)定或可裂解的化學(xué)鍵 (如巰基−馬來酰亞胺、酰胺鍵、二硫鍵和硫酯鍵) 將 CPPs 與被運送物質(zhì)結(jié)合。在許多情況下, 盡可能地選擇可裂解的化學(xué)鍵來保證被運送物質(zhì)的釋放而發(fā)揮其生物功能。例如, 二硫鍵是一種可逆性化學(xué)鍵, 在胞漿大量還原劑谷胱甘肽或還原酶的存在下, 二硫鍵可以發(fā)生斷裂將被載藥物釋放。然而, 從化學(xué)觀點來看, CPPs 共價連接技術(shù)在方法學(xué)上對被連接物有嚴格的限制, 并且可能改變被連接物的生物活性, 尤其是帶電荷的寡核苷酸或 siRNA。
2.2 非共價連接
基于該方法與載體結(jié)合的大多數(shù)是兩親性 CPPs, 如 MPG 肽、Pep-1 肽與核酸、蛋白等, 還有陽離子型的 Tat 和寡聚精氨酸。非共價結(jié)合相對比較簡單, 包括靜電作用和疏水作用。運用非共價結(jié)合方法可以實現(xiàn)核酸和蛋白質(zhì)等生物活性大分子的胞內(nèi)遞送并保留其生物活性。由于 CPPs 與核酸類藥物進行化學(xué)連接存在困難, 因此 CPPs 介導(dǎo)的基因遞送系統(tǒng)通常采用基于靜電作用的非共價連接方式。但需要注意的 是, 與大分子量的陽離子聚合物相比, CPPs 的分子質(zhì)量較小, 其結(jié)合并壓縮核酸類藥物的能力相對較弱, 所形成絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)通常不夠緊密而不利于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此, 將 CPPs 與大分子陽離子聚合物共價連接后, 再通過靜電作用的非共價連接方式與核酸類藥物形成絡(luò)合物, 能夠獲得較好的基因遞送效率。
3 細胞穿膜肽在藥物遞送方面的應(yīng)用
細胞穿膜肽具有強大的運輸潛能, 迄今為止, CPPs 已經(jīng)有效地介導(dǎo)了不同分子量和粒徑的物質(zhì)進入細胞, 如蛋白質(zhì)、抗體、核酸 (寡核苷酸、cDNA、RNA 和 siRNA)、熒光染劑、納米粒、病毒、量子點、磁共振成像造影劑和小分子藥物等。
3.1 小分子藥物
P-糖蛋白的過度表達是腫瘤多藥耐藥性的重要機制之一, Mazel 等[23]將 P-糖蛋白外排泵的底物多柔比星連接到 CPPs 上, 顯著增加了多柔比星對腦腫瘤細胞的毒性作用。Lindgren 等[15]將甲氨蝶呤和兩個不同肽類 (YTA2 和 YTA4) 相連, 結(jié)果表明, 與游離藥物相比, 甲氨蝶呤-CPPs 共價物對靶酶二氫葉酸還原酶的作用提高了 15～20 倍, 同時體外多藥耐藥模型顯示其可用于克服 MDA-MB-231 細胞對甲氨蝶呤的耐受性。Zhou 等[24]將 2', 5'-寡腺苷酸四聚物 (2-5A) 與短鏈 Tat 肽用化學(xué)方法結(jié)合產(chǎn)生 2-5A-Tat 嵌合體, 此嵌合體可以被細胞吸收并能在完整的細胞中活化核糖核酸酶。
3.2 肽類和蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)或多肽類藥物可以用于許多疾病的治療, 但是分子量大和親水性極大地限制了它們透過細胞膜的能力而導(dǎo)致其生物利用度低。近年來, 許多學(xué)者開始利用 CPPs 來介導(dǎo)肽類藥物的遞送, 其中 Tat、penetratin 和合成聚精氨酸等是常用的 CPPs。Perea等[25]通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到一種可以抑制酪蛋白激酶 2 磷酸化的環(huán)狀九聚氨基酸長肽—P15 (酪蛋白激酶 2 在人體許多腫瘤中表達異常), 將 Tat 與P15 相連后給予荷瘤小鼠瘤內(nèi), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤重大幅下降。與完整的免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG) 相比, 單鏈 Fv (single-chain Fv, scFv) 抗體片段血清半衰期短, 被腫瘤組織攝取也更為迅速, 但由于 scFv在組織中的滯留時間短導(dǎo)致其在腫瘤部位的凈沉積劑量較低而明顯限制了 scFv 在放射免疫療法中的應(yīng)用。為了提高 scFv 在腫瘤組織的攝取量和滯留時間, Jain 等[26]將 penetratin 和 Tat 分別與 scFv 相連, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后 24 h, 對照組 (未連接肽)、penetratin 組和 Tat 組在腫瘤組織中滯留百分比分別為 27.25%、79.84%和 48.55%, 且 Tat 組在正常肺部組織攝取量明顯增加但 penetratin 組在其他組織中的攝取沒有增加。
3.3 核酸
CPPs 也可以作為核酸類大分子如寡核苷酸類, 包括核酸肽 (PNA) 和 siRNA、質(zhì)粒 DNA 等的載體, 在基因表達的調(diào)節(jié)中可以靶向作用于細胞質(zhì)或細胞核[27, 28]。Davidson 等[29]將 penetratin 連接到 siRNA 有義鏈的 5'末端, 沒有經(jīng)過進一步純化而將其有效地遞送進入初級神經(jīng)細胞中引起了蛋白產(chǎn)物的下調(diào)。Chiu 等[30]將 Tat 連接到 siRNA 上, 并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化結(jié)合物, 該結(jié)合物能夠沉默報告基因的表達。
3.4 納米載體
納米載體較難跨過細胞脂質(zhì)膜, 這大大地限制了其體內(nèi)外應(yīng)用, 但將 CPPs 與納米粒相連形成復(fù)合體后往往能克服這種困難。
3.4.1 脂質(zhì)納米載體
脂質(zhì)體是粒徑為 50～1 000 nm的脂質(zhì)囊泡, 被廣泛用于藥物載體。研究發(fā)現(xiàn)表面經(jīng)Tat 肽修飾的、粒徑約 200 nm 的脂質(zhì)體可以有效地將藥物遞送到胞內(nèi)[31], 而且藥動−藥效學(xué)結(jié)果表明, 遞送效率與肽的數(shù)量、肽序列、細胞來源和培養(yǎng)時間相關(guān)。Torchilin 等[31−33]將 Tat 與脂質(zhì)體相連, 與無 Tat肽修飾的普通質(zhì)粒−脂質(zhì)復(fù)合物相比, 體外實驗表明Tat 肽−脂質(zhì)復(fù)合物提高了質(zhì)粒 pEGFP-N1 進入癌細胞的遞送率和轉(zhuǎn)染率。脂質(zhì)體進入細胞 1 h 后仍在胞漿中保持完整的形態(tài); 入胞后 2 h, 脂質(zhì)體遷移進入細胞核周圍區(qū)域; 9 h 后, Tat 修飾的脂質(zhì)體開始在核周圍區(qū)域分解。Khalil 等[34]將八聚精氨酸 (R8) 與脂質(zhì)體相連并考察了 R8 不同修飾密度對脂質(zhì)體的細胞攝取和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 低密度 R8 修飾的脂質(zhì)體主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞, 在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解; 高密度 R8 修飾的脂質(zhì)體則主要通過巨胞飲作用進入細胞且不易被溶酶體降解, 脂質(zhì)體上不同 R8 密度產(chǎn)生不同基因表達水平的原因主要是由不同的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑所引起, 而不是由于細胞對脂質(zhì)體的不同攝入量。研究者進一步將質(zhì)粒DNA 壓縮包入高密度 R8-脂質(zhì)體, 基因表達提高了 3倍。Dasai 等[35]將 Tat 肽連接到固體脂質(zhì)納米粒上用于經(jīng)皮給藥。在體外細胞模型中, 通過激光共聚焦顯微鏡和拉曼共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 對照組納米粒主要分布在毛囊層 (皮下深度約 80 μm), 經(jīng) Tat 修飾的納米粒在毛囊層和表皮層 (皮下深度約 120 μm) 均可觀察到; 與對照組相比, Tat-脂質(zhì)納米粒使塞來昔布的經(jīng)皮滲透能力提高了 3～6 倍。
3.4.2 聚合物納米載體
經(jīng) CPPs 修飾后的聚合物膠束或納米粒為提高難溶性生物活性藥物和核酸類藥物的胞內(nèi)遞送提供了有效手段。與未經(jīng)修飾的膠束相比, Tat 肽修飾的 PEG-PE 膠束增加了其與腫瘤細胞的相互作用, 給藥濃度為 5 和 50 nmol·L−1 時, Tat-PEGPE 組都顯著提高了紫杉醇對 MCF7 和 4T1 細胞的 毒性 (P<0.05)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn), 通過對腫瘤組織進行TUNEL 檢測, Tat-PEG-PE 組細胞凋亡更為明顯[36]。Cheng 等[37]制備了一種 PEG-PLGA 納米粒用于遞送siRNA, 并在納米粒表面連接了兩種不同的配體: 葉酸和 penetratin。通過這兩種配體發(fā)揮協(xié)同作用, 該 雙功能化納米粒與細胞的親和性增加, 細胞對納米粒的結(jié)合能力和攝取能力增強, 基因沉默效率提高。Han 等[38]將 PAMAM 樹狀大分子和 Tat 肽與細菌磁性納米粒 (bacterial magnetic nanoparticles, BMPs) 相連, 構(gòu)建了一種具有穿膜作用的靶向 siRNA 遞送系統(tǒng) (Tat-BMPs-PAMAM), 用于腦部腫瘤的基因治療。與對照組相比, Tat-BMPs-PAMAM /psiRNA-EGFR 更好地下調(diào)了 U251 細胞的 EGFR 表達, 顯著抑制了U251 細胞的增殖和侵襲能力。在 U251 裸鼠皮下瘤模型中, Tat-BMPs-PAMAM 治療組的腫瘤生長速率減慢, 腫瘤蛋白 (EGFR、P-AKT、MMP-2/9、PCNA、VEGF、Bcl-2 和 cyclin D1) 表達顯著下調(diào), 細胞凋亡數(shù)量明顯增加。Jiang 等[39]用 R8 與葉酸共同修飾了PEG 化聚乙烯亞胺 (0.6 kDa)-β-環(huán)糊精, 用于遞送質(zhì)粒 DNA。結(jié)果表明, 葉酸介導(dǎo)的入胞作用和 R8 介導(dǎo)的穿膜作用共同提高了質(zhì)粒 DNA 體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染率。此外, 經(jīng) Tat 修飾的殼聚糖納米粒不僅可以有效地轉(zhuǎn)染 pDNA[40], 而且遞送功能性 siRNA 能顯著抑制小鼠乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移, 延長荷瘤鼠的生存期, 研究發(fā)現(xiàn)[41, 42]生理鹽水組與裸 siRNA 組的小鼠在接種后第 56 天時全部死亡, 而納米粒組的小鼠生存期延長至 69 天。
3.4.3 無機物納米載體
近年來, 無機納米載體以其獨特的性質(zhì)獲得了研究者的廣泛關(guān)注, CPPs 可以提高無機納米載體 (包括硅、鐵、金和銀等材料制成納米粒) 的胞內(nèi)遞送效率。Josephson 等[43]將粒徑約為 40 nm 的右旋糖酐包衣的超順磁性氧化鐵納米粒(SPIONs) 與 Tat 肽相連, 與未經(jīng)修飾的納米粒相比, 淋巴細胞對 SPIONs 的攝取效率提高了 100 倍左右。Santra 等[44]設(shè)計了一種粒徑約為 70 nm、經(jīng) Tat 肽修飾的熒光納米探針——Tat-異硫氰酸熒光素−硅納米粒 (Tat-FSNPs), 它可以標記人肺腺癌 (A549) 細胞, 且能夠有效地穿過大鼠的血腦屏障。Oh 等[45]研究了粒徑在 2.4～89 nm 之間的 Tat 肽-PEG-金納米粒的細胞 攝 取 和 胞 內(nèi) 分 布 情 況 , 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) , 金 納米粒(AuNP) 的細胞攝取依賴于納米粒表面的穿膜肽, 但是 AuNP 的胞內(nèi)定位則由其粒徑?jīng)Q定。粒徑介于5.5～8.2 nm 間的粒子只有部分被運送至細胞質(zhì)內(nèi), 16 nm 以上的金納米粒則不會進入細胞, 而是分布在細胞外圍或細胞外發(fā)生聚集。
3.5 刺激響應(yīng)型“智能”納米載體
盡管 CPPs 具有相當大的臨床應(yīng)用潛能, 但是也存在一些重要的缺點和局限性。首先, CPPs 的特異性差, 可以進入任何與之接觸的細胞內(nèi), 可能會對正常組織產(chǎn)生毒性。第二, 穿膜肽在到達靶部位之前存在體內(nèi)穩(wěn)定性問題。為了防止 CPPs 在血漿中發(fā)生酶解, 目前可采取的措施有: ① 對其進行空間保護; ② 使用具有蛋白酶抗性的 D 型肽取代 L-氨基酸形式; ③將 CPPs 包入“智能”納米載體中, 在納米載體運行的第一階段, 非特異性 CPPs 被聚合物或靶向抗體空間保護 (即所謂的“隱藏”), 當?shù)竭_靶部位后, 在局部環(huán)境的作用下, 載體表面的保護基團通過刺激敏感性共價鍵的斷裂而與載體分離, 將 CPPs 暴露出來進而發(fā)揮其穿膜作用。臨床研究發(fā)現(xiàn), 腫瘤、梗死和炎癥部位常常存在低 pH 值、高溫和基質(zhì)金屬蛋白酶等“局部環(huán)境”, 加熱、輻射、超聲、射頻和磁場等外界刺激常�？梢杂脕碛|發(fā) CPPs 的暴露。
Koren 等[46]設(shè)計了一種多功能刺激敏感性脂質(zhì)體遞送系統(tǒng), 該系統(tǒng)在脂質(zhì)體表面連接了 3 種基團: ①腫瘤特異性 2C5 單克隆抗體 (mAb 2C5); ② Tat 肽連接的短鏈 PEG; ③ 位于長鏈 PEG 和 PE 之間可降解的 pH 敏感性腙鍵。在正常生理 pH 下, Tat 分子被長鏈 PEG 和 mAb 2C5“隱藏”, 當短暫 (15～30 min)暴露于酸性環(huán)境 (pH 5.0～6.0) 后, 腙鍵斷裂, PEG保護去除, Tat 肽暴露出來發(fā)揮其穿膜作用。這里的mAb 2C5 不僅可以介導(dǎo)載體對腫瘤的主動靶向, 而且可以提高載體與腫瘤細胞的相互作用, 與被“隱藏”的 Tat 肽發(fā)揮協(xié)同作用。在腫瘤細胞的酸性環(huán)境下, 與未經(jīng)修飾的 Doxil 相比, 包載了阿霉素的這種多功能性載體, 提高了細胞對載體的攝取作用, 增強了藥物對細胞的毒性。Lee 等[47]設(shè)計了一種“彈出”系統(tǒng), 該系統(tǒng)是由兩種嵌段聚合物自組裝形成的: PLA3kDb-PEG2kD-b-polyHis2kD-Tat 和 polyHis5kD-b-PEG3.4kD。PLA3kD 嵌段構(gòu)成了納米粒的疏水核, 被 PEG2kD 和PEG3.4kD 組成的親水殼所環(huán)繞。在正常生理 pH 下, polyHis2kD 處于非離子化狀態(tài), 與其相連的 Tat 肽分子緊密地綁定在納米粒表面, 而被長鏈 PEG3.4kD“隱藏”; 當處于腫瘤的弱酸環(huán)境時, polyHis發(fā)生離子化作用使得親水殼帶正電。結(jié)果說明, 靜電排斥作用克服了疏水作用, 引起 polyHis2kD-Tat 彈出表面, pH 觸發(fā)的 Tat 肽暴露于腫瘤環(huán)境中。Wang 等[48]構(gòu)建了一種納米靶向復(fù)合膠束, 該復(fù)合膠束是將構(gòu)象可變的聚谷氨酸−聚乳酸嵌段共聚物和 Tat 肽修飾的 PEGDSPE 嵌段共聚物通過自組裝方式形成。在血液循環(huán)中, 聚谷氨酸鏈段可以屏蔽 Tat 肽的跨膜遞送功能, 防止其針對正常細胞發(fā)揮跨膜遞送作用。同時, 這種屏蔽作用還可以保護 Tat 肽, 防止其被酶解而失去跨膜遞送活性。該復(fù)合膠束首先通過 EPR 效應(yīng)在腫瘤組織內(nèi)蓄積, 實現(xiàn)被動靶向。然后, 在腫瘤組織弱酸性條件下聚谷氨酸鏈段發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變暴露出 Tat 肽, 進一步發(fā)揮 Tat 肽的跨膜遞送作用, 促進載體中藥物吸收。聚谷氨酸的構(gòu)象轉(zhuǎn)變還可以在膠束外殼中形成通道, 加速藥物釋放。
在多功能性基因遞送載體中常常出現(xiàn)納米載體經(jīng) PEG 化修飾后產(chǎn)生細胞攝取量減少和核內(nèi)體逃逸下降等問題, 因此有學(xué)者采用特異性配體、可裂解的PEG 系統(tǒng)或核內(nèi)體融合/裂解肽等方式來克服。Kale等[11, 13]制備了一種載有質(zhì)粒 pGFP 的 PEG 化脂質(zhì)體, 該系統(tǒng)表面連接了 Tat 肽 (PE-PEG-Tat), 并用具有 pH敏感性酰腙鍵將 PEG 嵌段與 PE 相連 (mPEG-HZPE)。當脂質(zhì)體在 EPR 效應(yīng)下到達腫瘤部位后, 腫瘤細胞低 pH 的微環(huán)境使酰腙鍵斷裂, 脫掉 PEG 外殼, 暴露出隱藏的 Tat 肽, 然后 Tat 肽再介導(dǎo)脂質(zhì)體進入腫瘤細胞內(nèi)�；|(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 是一組位于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有極大同源性、能夠降解細胞外基質(zhì)蛋白的內(nèi)肽酶總稱。研究 發(fā)現(xiàn)[49]許多腫瘤組織的 MMPs 表達上調(diào)且酶催化反應(yīng)可以放大 MMPs 的作用效應(yīng), 因此 MMPs 成為侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的理想靶點。Harris 等[50]開發(fā)了 一種基于 MMPs敏感和 EPR效應(yīng)的磁性熒光納米粒。研究者將被葡聚糖包裹的氧化鐵磁性納米粒通過對MMP-2 敏感的多肽片段 (GPLGVRGC) 與 PEG 相 連, 用來掩飾 CPPs。該納米粒在血液循環(huán)中穩(wěn)定, 避免了非特異性相互作用, 當納米粒通過 EPR 效應(yīng)蓄積在腫瘤部位后腫瘤組織中的 MMPs 促使對其敏感的化學(xué)鍵斷裂, PEG 脫離將 CPPs 暴露, CPPs 介導(dǎo)的細胞穿膜作用被激活。該結(jié)果通過熒光和核磁共振成像得到了證實。
4 細胞穿膜肽應(yīng)用的安全性問題
CPPs 為促進藥物轉(zhuǎn)運入胞開辟了一條新的途徑, 但是若將其應(yīng)用于臨床尚有幾個問題需要進行全面深入的研究: 第一, 明確 CPPs 的轉(zhuǎn)運特征, 包括轉(zhuǎn)運的機制、效率和動力學(xué)等; 第二, 闡明 CPPs 介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)在體內(nèi)的組織分布和藥動學(xué); 第三, CPPs 進入體內(nèi)后對組織和細胞潛在的毒副作用以及是否會引起機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)等。
CPPs 一般通過作用于細胞膜和細胞器膜或與細胞組分相互作用而對細胞產(chǎn)生毒性[51, 52]。研究發(fā)現(xiàn), 與細胞作用時間、CPPs 的長度和濃度、CPPs 相連載體種類和細胞類型等因素都會影響穿膜肽的毒性[53]。體外研究發(fā)現(xiàn), 不同長度的 Tat 衍生肽其毒性隨著長度和劑量不同而發(fā)生改變, Tat48−85 在較高濃度 (100 μmol·L−1) 時仍不會對 HeLa、CHO 和神經(jīng)元細胞產(chǎn)生毒性[53−55], 但是 Tat37−60 在濃度較低 (100 nmol·L−1) 時即引起 HeLa GH、HL116 和 CCL39 細胞發(fā)生壞 死[56]。MAP 通過破壞細胞膜殺死微生物細胞[57]。當濃度超過 1 μmol·L−1時, MAP 對小牛主動脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生較強的毒性作用[58]。
目前, 對 CPPs 的體外毒性評價較多, 但其體內(nèi)毒性的考察受到限制。較少研究者針對 CPPs 的體內(nèi)毒性、免疫原性及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)進行較為系統(tǒng)和全面的評價。只有少數(shù)文獻報道了 CPPs 應(yīng)用于體內(nèi)研究時所產(chǎn)生的毒性。Olson 等[59]發(fā)現(xiàn) D-型寡聚精氨酸 (R9) 在靜脈給藥劑量大于5 μmol·kg−1時會引起嚴重的全身毒性, 小鼠因呼吸衰竭而死亡。Bolton 等[60]發(fā)現(xiàn), 當penetratin劑量大于10 μg時會引起腦部神經(jīng)細胞死亡和炎癥細胞聚集, 但劑量為 1 μg 時顯著減輕。而 Low 等[61]研究發(fā)現(xiàn) penetratin 還會通過與 Toll樣受體通路相互作用而影響內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。因此, 只有對 CPPs 的體內(nèi)外行為進行全面深入評價, 才能防止其對正常組織產(chǎn)生不良反應(yīng), 只在靶部位發(fā)揮治療作用。
5 展望
藥物遞送系統(tǒng)在到達靶部位前必須克服多重生物學(xué)屏障, 提高藥物遞送效率不僅可以減少給藥劑量, 而且可以避免過量藥物對正常組織產(chǎn)生的毒副作用。雖然 CPPs 在體內(nèi)外實驗中能夠協(xié)助各類活性分子進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用, 為疾病治療帶來了新的希望, 但 CPPs 缺乏組織特異性和細胞類型特異性, 且在生理條件下易發(fā)生蛋白酶水解, 這些“缺陷”推動了基于生理學(xué)或微環(huán)境特征而設(shè)計定向于靶組織或靶細胞的“智能”遞送平臺的發(fā)展, 使其在細胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運及細胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)具有良好的應(yīng)用前景。如何控制“智能”載體的響應(yīng)靈敏度、克服較高的組織間質(zhì)液壓 (interstitial fluid pressure, IFP) 以及促進藥物深入組織內(nèi)部發(fā)揮藥效等是基于 CPPs 的藥物遞送系統(tǒng)亟需解決的主要問題, 也是將此項技術(shù)應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在。
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