摘要
抗癌肽能夠靶向作用于癌細胞，而不損傷正常組織細胞的主要原因在于癌細胞膜表面一些陰離子成分的特異性表達，包括磷脂酰絲氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和肝素等[11]。大量研究表明，抗癌肽的作用機制可以分為膜裂解機制和非膜裂解機制(圖 1和圖 2)。其中抗癌肽的膜裂解機制主要有以下3種，分別是“桶板模型”、“氈毯模型”和“環(huán)形孔模型”(圖 1)[12-13]。
2.1.1 桶板模型
1977年Ehrenstein等首次提出了抗菌肽的桶板模型(圖 1)[14]�？拱╇脑诎┘毎け砻嫱ㄟ^疏水作用寡聚體化，其中抗癌肽的疏水面向外朝向細胞膜的�；�，而親水面形成孔或槽，最終在不斷的聚集過程中形成穿透質(zhì)膜離子孔道，進而導(dǎo)致癌細胞內(nèi)容物流出，失去大量離子和能量，胞內(nèi)滲透壓改變，進而瓦解細胞膜。理論上這種孔道至少由3個抗癌肽分子組成，并且要求它們有一定的二級結(jié)構(gòu)，比如兩親性的α-螺旋、β-折疊或同時含有α-螺旋和β-折疊[15]。很多抗癌肽均被證明是通過桶板模型來發(fā)揮其抗癌作用的。如在1994年，Sui等證明了分離自意蜂Apis mellifera的Melittin可以通過桶板模型破壞癌細胞膜的完整性[16]。Melittin又名蜂毒肽，是蜂毒的主要成分，由26個氨基酸殘基組成，其功能多樣，如有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗HIV及抗腫瘤等多種藥理活性[17]。蜂毒肽具有廣譜的抗腫瘤活性，包括人肝細胞癌、白血病、乳腺癌等，桶板模型是其多種抗腫瘤機制之一[18-19]。來自咆哮草蛙Litoria raniformis的抗癌肽Aurein1.2對白血病、肺癌、結(jié)腸癌等均有殺傷作用，其主要機制也是通過桶板模型來破壞腫瘤細胞[20]。
2.1.2 氈毯模型
1992年P(guān)ouny等提出了抗菌肽的“氈毯”模型[21]。陽離子抗癌肽也可以通過靜電作用結(jié)合到帶負離子的癌細胞膜上，以類似氈毯的結(jié)構(gòu)平行排列，當(dāng)抗癌肽達到臨界濃度時，細胞膜能量惡化，穩(wěn)定性降低而出現(xiàn)顯著的彎曲從而破裂(圖 1)。區(qū)別于桶板模型，氈毯模型不需要抗癌肽具有特殊結(jié)構(gòu)，并且不形成跨膜通道[15]。Cecropins類抗癌肽，又名天蠶素，是第一個被發(fā)現(xiàn)的動物抗菌肽，在昆蟲和哺乳類動物中均有發(fā)現(xiàn)，其對白血病、膀胱癌等均有強殺傷作用，可通過氈毯模型發(fā)揮作用[22]。Chuang等報道了人體唯一一種Cathelicidin類抗菌肽LL-37，也可以通過氈毯模型選擇性地裂解卵巢癌[23]。另外，Magainins (來自非洲爪蟾，Xenopus laevis)[24]、Citropin 1.1 (來自雨濱蛙，Litoria citropa)[25]、Gaegurins (來自皺皮蛙，Rana rugosa)[26]等多種抗癌肽，均可通過氈毯模型來發(fā)揮其抗癌作用。
2.1.3 環(huán)形孔模型
在環(huán)形孔模型中，抗癌肽的疏水區(qū)與癌細胞膜上的疏水區(qū)相互移動而導(dǎo)致胞膜破裂缺失，最終形成跨膜孔道(圖 1)。其與桶板模型最主要的區(qū)別在于抗癌肽始終與磷脂的頭部結(jié)合而一起構(gòu)成跨膜通道。1997年，Matsuzaki等報道了Magainin-2可以“環(huán)形孔”模型發(fā)揮抗菌作用[27]。Magainins，又名爪蟾素，分離自非洲爪蟾的皮膚，是較早發(fā)現(xiàn)的兩棲動物抗菌肽，其具有廣譜的抗菌抗癌活性，其中可以通過環(huán)形孔模型破壞人的宮頸癌細胞HeLa的細胞膜[28]。
除了上述3種機制外，還有一種破膜機制叫做Shai-Huang-Matsuzaki (SHM)模型，被認(rèn)為是氈毯模型和環(huán)形孔模型的結(jié)合[29]。這些模型雖然都是抗癌肽與癌細胞膜的相互作用導(dǎo)致細胞膜裂解，但是其內(nèi)在的分子機制有所不同。但是，大量報道證明，許多抗癌肽可以通過不同的作用方式應(yīng)對不同的癌細胞，以Magainin類抗癌肽為例，其抗癌作用方式既有環(huán)形孔又有氈毯模型，甚至還有非膜裂解機制[24, 28, 30]。
2.2 抗癌肽的非膜裂解機制
抗癌肽的作用機制除了改變癌細胞膜通透性以外，還可以與癌細胞的內(nèi)源靶標(biāo)相互作用，進而誘導(dǎo)癌細胞的死亡(圖 2)。
2.2.1 誘導(dǎo)凋亡途徑
大量的研究證實抗癌肽可通過激活凋亡通路來執(zhí)行功能，凋亡細胞表現(xiàn)出一系列形態(tài)和生化特征的變化，如胞質(zhì)皺縮、磷脂酰絲氨酸外翻、染色質(zhì)凝聚、DNA片段化、核膜核仁破碎等[31]。一般來說凋亡分為內(nèi)源性凋亡即線粒體途徑和外源性凋亡即死亡受體途徑，其中半胱天冬酶(Caspase)-9和-8分別是二者標(biāo)志性中間激活物，caspase-3，6，7是二者共同的凋亡執(zhí)行者[32]。Lee等發(fā)現(xiàn)來自中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans的抗癌肽BuforinⅡb對多達62株癌細胞都有強殺傷作用，其可破壞線粒體膜，釋放細胞色素C，進而激活caspase級聯(lián)，誘導(dǎo)一系列蛋白水解反應(yīng)導(dǎo)致細胞瓦解(內(nèi)源性凋亡)[33]。Chen等將tachyplesinⅠ的C端連接一段帶有RGD的短肽，發(fā)現(xiàn)獲得的RGD-tachyplesinⅠ在體內(nèi)外均可抑制腫瘤生長，并且激活caspase-3,6,7,8,9以及fas配體相關(guān)死亡域表達，也就是說其可同時激活線粒體途徑和死亡受體途徑[34]。不僅如此，近年來相繼出現(xiàn)很多報道證明抗癌肽還能夠激活不依賴于caspase的凋亡通路。這種凋亡通路不需要caspase的激活，而是促使存在于線粒體內(nèi)外膜間隙的細胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和核酸內(nèi)切酶G (EndoG)核轉(zhuǎn)移，進而引起DNA裂解和染色質(zhì)凝集等[35]。Ren等發(fā)現(xiàn)LL-37是通過激活caspase非依賴性的凋亡通路抑制人結(jié)腸癌細胞的生長。LL-37有效激活細胞中的抑癌基因p53的表達，進而誘導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的表達包括Bcl-2家族的促凋亡蛋白如BAX、Bak和Puma，這些因子能促進線粒體生理機能的改變，進而釋放AIF和EndoG進入細胞核執(zhí)行凋亡功能[36]。本實驗室前期工作從海南湍蛙Amolops hainanensis中提取到了一種抗菌肽HN-1具有廣譜的抗菌活性[37]，后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)其對癌細胞具有選擇性殺傷作用，且有效激活了caspase非依賴性的凋亡通路抑制人乳腺癌細胞MCF-7的生長(圖 3)。
2.2.2 阻止細胞周期于G0、G1或S期
細胞周期是細胞生命活動的基本過程，其依賴于各級調(diào)控因子的精確調(diào)控。大量報道指出抗癌肽可阻滯癌細胞于不同時期，從而抑制癌細胞的增殖。Li等[38]發(fā)現(xiàn)TachyplesinⅠ使人肝癌細胞SMMC-7721細胞阻滯在G0/G1期，實驗中TachyplesinⅠ下調(diào)突變p53、細胞周期蛋白D1和CDK4的蛋白水平，降低c-Myc的mRNA水平，并且促進p16和p21WAF1/CIP1的表達，可見TachyplesinⅠ通過對這些細胞周期相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)，進而抑制SMMC-7721的增殖。Zhao等利用原核表達獲得抗癌肽AGAP的重組體rAGAP，發(fā)現(xiàn)rAGAP能夠抑制人膠質(zhì)瘤細胞SHG-44的增殖和遷移，其機理是通過抑制G1細胞周期調(diào)控蛋白CDK2、CDK6和p-RB的表達，使SHG-44細胞周期被阻滯在G1階段，進而顯著抑制其增殖[39]。將胡桃肽WP1與納米硒結(jié)合能夠阻滯MCF-7細胞于S期，進而抑制其增殖[40]。
2.2.3 破壞溶酶體
癌細胞中溶酶體的通透性通常會發(fā)生改變，并且合成分泌大量的組織蛋白酶，它們與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)[41]。據(jù)報道一些抗癌肽可以破壞溶酶體膜，釋放溶酶體內(nèi)容物，導(dǎo)致細胞內(nèi)環(huán)境酸化，直至癌細胞死亡[42]。如來自一種海參Elysia rufescens的抗癌肽Kahalalide F (KF)，可以通過破壞癌細胞溶酶體結(jié)構(gòu)來殺死癌細胞，其抑制的細胞株包括結(jié)腸癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等[43]。宿主防御肽模擬物OAK對小鼠前列腺腺癌細胞TRAMP-C2及其動物模型均有良好的抑制作用，并且可以克服多藥耐藥性。Held-Kuznetsov等發(fā)現(xiàn)，OAK的作用機制是通過破壞線粒體和溶酶體發(fā)揮作用[44]。
2.2.4 增加鈣離子內(nèi)流
癌細胞中Ca2+穩(wěn)態(tài)會發(fā)生改變，這些改變與腫瘤的發(fā)生、增殖、代謝和血管的生成有關(guān)[45]�？拱╇目筛淖兗毎ねㄍ感远M入細胞，并且可增加細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，隨后通過靜電吸附作用于線粒體，在Ca2+的協(xié)同下作用于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)，導(dǎo)致內(nèi)容物外流引起癌細胞死亡。蜂毒肽Melittin可以通過增強Ca2+的流入和桶板模型等機制來殺死人的肝癌細胞[46]。另外，Risso等也發(fā)現(xiàn)來自家牛Bos taurus的BMAP-27/28對白血病、淋巴癌等都有很好的抑制作用，其機制就是改變細胞膜的通透性和提高細胞中Ca2+內(nèi)流，并伴隨著DNA的片段化，進而誘導(dǎo)癌細胞的死亡[47]。
2.2.5 抑制DNA合成
誘導(dǎo)靶細胞DNA片段化是多種抗癌肽的作用效果，但不一定是抗癌肽直接作用于DNA，比如凋亡通路也會引起DNA斷裂。近年來研究發(fā)現(xiàn)有些抗癌肽可以直接與癌細胞染色體DNA或相關(guān)酶相互作用，進而干擾或抑制癌細胞的DNA合成。Gower等[48]發(fā)現(xiàn)4種利尿鈉肽(LANP、ANP、BNP和CNP)對人的結(jié)腸癌細胞有抑制作用，其抗腫瘤機制就是通過抑制環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic GMP)介導(dǎo)的癌細胞DNA合成來阻止癌細胞增殖的。Hariton-Gazal等[49]通過實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過加工改造后的抗癌肽PV-S4和RR-S4可以結(jié)合到Hela細胞核染色體上，使其DNA出現(xiàn)斷裂，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡。另外，分離自Elysia rufescens的抗癌肽Kahalalide F (KF)、來自淀粉核小球藻的CPAP等均能通過阻止DNA復(fù)制來殺死腫瘤細胞[18]。
2.2.6 促使癌細胞自噬
細胞自噬也稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是細胞中高度保守的自行降解過程，自噬使饑餓或缺乏生長因子的細胞得以暫時成活，而那些持續(xù)不能獲得營養(yǎng)的細胞將消化所有可獲得的基質(zhì)，最終導(dǎo)致自噬相關(guān)性細胞死亡。近年來發(fā)現(xiàn)其也是抗癌肽的腫瘤抑制機制之一[50-51]。Ren等[52]報道了LL-37的片段FK-16 (第17–32個氨基酸)可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞HCT116凋亡和自噬，但是對正常結(jié)腸上皮細胞NCM460毒性很小。FK-16提高了結(jié)腸癌細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5和Atg7的表達量，同時在共聚焦和電子顯微鏡下觀察到LC3陽性的自噬體的形成。當(dāng)敲除掉Atg5和Atg7后，大大降低了FK-16對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用，說明誘導(dǎo)癌細胞自噬是FK-16發(fā)揮作用的重要機制。
2.2.7 激活腫瘤免疫
免疫系統(tǒng)在機體控制和清除腫瘤方面起到了至關(guān)重要的作用，但仍難以阻止腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。這與復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境密不可分，一方面，腫瘤細胞可分泌促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的細胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長等[53]；另一方面，惡性腫瘤可以通過多重機制免疫應(yīng)答，從而逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊作用，如使腫瘤浸潤的CD8+ CTLs和CD4+ Th1細胞處于一種功能耗竭或無能狀態(tài)，無法對腫瘤進行免疫監(jiān)視和清除[54]。因此誘導(dǎo)免疫活化、打破免疫耐受等已成為熱門的免疫治療方向，如免疫檢查點抑制劑[55]。有研究證明有些抗癌肽可以調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答發(fā)揮其抗腫瘤作用。Chen等[56]報道TachyplesinⅠ能夠促使細胞表面的透明質(zhì)烷和血清中補體途徑的關(guān)鍵成分C1q補體相互作用，并且激活其下游的C3和C4的裂解和沉積，以及C5b-9的形成，激活典型補體途徑從而破壞癌細胞的完整性。Chernysh等報道了來自紅頭麗蠅Calliphora vicina的抗菌肽alloferon可通過激活免疫應(yīng)答抑制腫瘤生長。通過體外將小鼠淋巴細胞或人的血液單核細胞進行試驗，發(fā)現(xiàn)alloferon可激活自然殺傷(NK)細胞和干擾素(IFN)的表達[57]。Huang等[58]發(fā)現(xiàn)從比目魚豹鰨Pardachirus marmoratus分離的抗癌肽GE33可以作為疫苗佐劑提升滅活膀胱癌細胞(MBT-2)的免疫原性，在小鼠體內(nèi)顯著提高了CTL細胞和NK細胞數(shù)量以及特異性抗體水平等，證明了抗癌肽的免疫調(diào)節(jié)潛能。本課題組發(fā)現(xiàn)的抗癌肽HN-1在動物體內(nèi)激活了CD4+ T細胞和巨噬細胞在腫瘤中的浸潤，并且提高了腫瘤相關(guān)細胞因子在血清中的水平(圖 3)。
2.2.8 抑制腫瘤血管新生
新生血管形成與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，其為腫瘤組織提供氧氣和營養(yǎng)，促進腫瘤細胞迅速增殖，同時為腫瘤的遠端轉(zhuǎn)移提供轉(zhuǎn)運[59]。因此靶向腫瘤新生血管生成或相關(guān)因子的抗癌類藥物研發(fā)具有重大意義。Mader等[60]通過實驗發(fā)現(xiàn)Lactoferricin B在體外通過阻止細胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF165)與受體結(jié)合而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖，并且在C57BL/6小鼠體內(nèi)抑制二者誘導(dǎo)的血管生成。Hou等[61]將人工設(shè)計抗菌肽與靶向給藥序列isoDGR相連接，發(fā)現(xiàn)其能夠與αvβ3+ (腫瘤細胞過表達)結(jié)合從而抑制血管的生成，充分證明了抗癌肽具有抑制血管新生的潛能。
3 總結(jié)與展望
在過去的20年中，天然活性分子的多種治療潛能的持續(xù)發(fā)現(xiàn)引發(fā)了科學(xué)界的廣泛注意。抗癌肽由于其特殊的陽離子和兩親性的結(jié)構(gòu)特征以及其眾多的抗癌機制，使其發(fā)揮了良好的抗癌作用或者增強化療藥物的效果，因而有望用于提高化療藥物的敏感性，同時減少對正常組織的毒副作用。目前已有大量不同治療目的肽類藥物進入臨床或批準(zhǔn)上市，如表 1所示，當(dāng)前已有部分處于臨床試驗階段的抗癌肽，并取得了一定的效果[62]。但是抗癌肽的應(yīng)用和研發(fā)仍面臨一些挑戰(zhàn)，如合成成本較高、易被蛋白酶水解、易聚合、半衰期較短等[63]。因而當(dāng)前抗癌肽的設(shè)計也集中于截短序列等，以降低成本[64]；解決蛋白酶的水解問題，可以通過將天然氨基酸替換成非天然氨基酸，比如設(shè)計D-對映體肽、β2,2氨基酸替換、肽骨干環(huán)化、end-capping如c-酰胺化、糖類coating等[65-67]；提高半衰期可以將抗癌肽聚乙二醇修飾(PEGylation)，結(jié)合到血清白蛋白或抗體片段等[68]。由此可見雖然抗癌肽在腫瘤治療方面有很好臨床應(yīng)用價值，但是仍需克服這些缺陷和挑戰(zhàn)，才能在腫瘤藥物治療領(lǐng)域有一席之地。因此，進一步確定和發(fā)現(xiàn)更多抗癌肽模板和抗腫瘤機制以及克服肽類藥物缺點的新方法對抗腫瘤臨床治療藥劑的發(fā)展具有重大意義。
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