摘要 ：以基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)催化結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)，通過噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選和分子模擬、細(xì)胞免疫熒光、金屬離子親和層析以及體外細(xì)胞作用測定等技術(shù)，進(jìn)行了雙靶向 MMP-14 和金屬離子小分子結(jié)合多肽的篩選與研究. 經(jīng) 4 輪篩選，噬菌體得到有效富集并獲得 13 條不同的多肽序列. 序列分析顯示，可能的一致序列有:AHQLH、HHXH、EI / L PLL / I . 分子模擬與對(duì)接進(jìn)一步確認(rèn)一致序列 AHQLH、HHTH、LPLL 與 MMP-14 催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸 120-125 區(qū)域良好分子對(duì)接并具有一定的專一性，多條 MMP-14 結(jié)合肽不僅靶向 MMP-14，同時(shí)結(jié)合金屬離子. 細(xì)胞生物學(xué)研究確認(rèn)，所測定的結(jié)合肽噬菌體對(duì) MMP-14 誘導(dǎo)表達(dá)的 MG63 細(xì)胞具有良好的結(jié)合作用，揭示結(jié)合肽對(duì)MMP-14 的靶向結(jié)合特性，并且合成的 AHQLH、LPLL 一致序列多肽對(duì) MG63 細(xì)胞活力具有一定的抑制能力. 這些新的和具有一定 MMP-14 專一性的一致序列可望用于靶向 MMP-14 抗腫瘤藥物的研發(fā)和利用.
基質(zhì)金屬蛋白酶( MMPs)是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的Zn2+和Ca2+依賴的內(nèi)肽酶，屬于分解細(xì)胞外基質(zhì)組分( extracellular matrix，ECM ) 的蛋白水解酶超家族［1］. 自 1962 年首次由Gross和Lapiere 報(bào)道特異性膠原降解酶膠原酶以來［2]，至今至少已發(fā)現(xiàn) 23 種人MMPs. 研究結(jié)果顯示，MMPs 在許多生理和病理過程如胚胎發(fā)育、形態(tài)建成、組織修復(fù)和重建、血管發(fā)生、炎癥反應(yīng)，特別是在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［3，4］. MMP-14(也稱為 MT1-MMP)作為第 1個(gè)鑒別的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，直接或間接降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種組分，被認(rèn)為是MMPs家族中與腫瘤關(guān)系最密切的酶［5］.
生物技術(shù)的飛速發(fā)展為高通量快速篩選藥靶結(jié)合分子提供了新的思路和途徑，噬菌體展示技術(shù)就是近年來發(fā)展迅速且廣泛應(yīng)用的手段之一. 它是將編碼外源多肽(蛋白) 的基因或DNA片段與噬菌體的外殼蛋白融合而 展 示 在 噬 菌體表面. 若插入的DNA片段為隨機(jī)寡核苷酸，則構(gòu)建獲得噬菌體隨機(jī)肽庫. 該技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是將表型與基因型直接聯(lián)系在一起，利用配體與靶受體的特異性親和力可篩選出靶分子高效結(jié)合肽. 目前已開展多種 MMPs 相關(guān)蛋白的噬菌體文庫篩選工作，這方面國內(nèi)外均有相關(guān)研究報(bào) 道［6 ～ 10］. 盡 管 如 此，靶 向 MMP-14 的 生物文庫篩 選 少 有 研 究，而 深 入 開 展 雙 靶 向 MMP-14和金屬離子的結(jié)合肽分子篩選與研究則未見報(bào)道.
本研究以人工合成的 MMP-14 催化結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)，利用商品化噬菌體隨機(jī)十二肽庫對(duì)其進(jìn)行篩選，通過多輪篩選富集獲得與靶標(biāo)特異性結(jié)合的多肽，確定一致序 列，并對(duì)其進(jìn)行同源序列比對(duì)、分子模擬、金屬離子親和層析、體外細(xì)胞測定等分析，確定結(jié)合肽對(duì) MMP-14 和金屬離子的雙靶向性以及細(xì)胞活力的抑制作 用，為 基 于 MMP-14 的 抗 腫 瘤 先 導(dǎo) 藥物篩選和研發(fā)提供前期工作基礎(chǔ).
1 材料與方法
1. 1 材料
噬菌體隨機(jī) 十 二 肽 庫(1. 5 × 1013pfu /mL) 和 宿主菌 ER2738( F'lacIq Δ( lacZ)M15 proA + B + /zzf ﹕﹕Tn10( TetR ) fhuA2 supE thi Δ( lac-proAB) Δ ( hsdMSmcrB)5 ( r k－ mk－ )McrBC － )購自 New England Biolabs(Cat. 8110S) ;人成骨肉瘤 MG63 細(xì)胞，教育部生物材料重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn) 室 屈 樹 新 教 授 惠 贈(zèng);Hitrap 樹 脂 購 自Pharmacia Biotech(Cat. 17-0575-01) ;Ni-NTA 樹脂購自 Qiagen( Superflow 30430) ;MMP-14 蛋白催化結(jié)構(gòu)域購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司;.除標(biāo)明外，其它試劑均購于成都試劑公司，化學(xué)試劑均為分析純以上.
1. 2 MMP-14 靶蛋白的噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選
以 MMP-14 蛋白催化結(jié)構(gòu)域(100 μg /mL) 為靶標(biāo)，BSA 為陰性對(duì)照，篩選、擴(kuò)增、滴度測定、噬菌體單鏈 DNA( ssDNA) 的制備和測序等方法參照 Ph.D. -12 TM噬菌體展示肽庫手冊(cè). 每孔加 入 150 μL 樣品包被 96 孔 板，增 濕 容 器 中4 ℃ 輕 微 震 蕩 孵 育 過夜;倒去包被液，4 ℃ BSA 封閉振 搖 孵 育 1 h;除 去封 閉 液，TBS 緩 沖 液 ( 50 mmol /L Tris-HCl，150mmol /L NaCl) 快 速 洗 孔 6 次;每 孔 加 入 5. 0 × 1010pfu 噬菌體，室溫輕微震蕩結(jié)合 30 ～ 60 min;棄去未結(jié)合噬菌體，0. 1% TBST( TBS + 0. 1% Tween-20)清洗 5 次，200 μL 甘氨酸-HCl，pH2. 2 洗脫特異性 結(jié)合噬菌體，重復(fù) 2 次. 收集洗脫液，Tris-HCl( pH9. 1)中和. 保留 1 /5 樣品，其余用于滴度測定和洗脫物擴(kuò)增，擴(kuò)增物用于下輪篩選，共進(jìn)行 4 輪篩選. 計(jì)算 P /N 值( P:靶蛋白結(jié)合噬菌體洗脫物滴度，N:BSA 對(duì)照蛋白結(jié)合噬菌體洗脫物滴度) .
1. 3 噬菌體DNA測序
1. 4 單克隆噬菌體的親和力反篩測定
篩選獲得的含結(jié)合肽序列單克隆噬菌體擴(kuò)增后，按照類似 1. 2 所述方法進(jìn)行 MMP-14 靶 蛋 白 反篩，計(jì)算其 P /N 值，用于測定結(jié)合肽噬菌體對(duì) MMP-14 的親和力，P/N 值越高表示親和力越強(qiáng).
1. 5 結(jié)合肽序列分析與一致序列獲得
利用 Blastp、Clustal X 1. 81 等生物信息軟件進(jìn)行 MMP-14 結(jié)合肽 序 列 的 比 對(duì) 及 多 重 序 列 分 析，以獲得可能的一致序列.
1. 6 一致序列與 MMPs 的分子對(duì)接
為了在分子水平預(yù)測一致序列對(duì) MMP-14 的靶向性，利 用 Molegro Virtual Docker ( MVD) 和 SwissPDB Viewer 軟 件 進(jìn) 行 了 一 致 序 列 與 MMP-14 及MMPs 家族成員的分子模擬與對(duì)接分析. MVD 是最新的一個(gè)跨平臺(tái)對(duì)接軟件，它提供了對(duì)接所需要的所有功能，并且對(duì)接結(jié)果較為準(zhǔn)確，界面容易使用.簡單地，首先通過查詢 PDB 數(shù)據(jù)庫獲得 MMP-14 的三維 結(jié) 構(gòu) 1bqqM，一 致 序 列 短 肽 結(jié) 構(gòu) 模 擬 采 用Swiss-PDB Viewer 軟 件，然 后 將 獲 得 的 MMP-14 與一致序列三維結(jié)構(gòu)依次 導(dǎo) 入 到 MVD 對(duì) 接 軟 件 中，經(jīng)結(jié)合區(qū)域預(yù)測、對(duì)接過程設(shè)置 等 步 驟，經(jīng) 過 約 10輪迭代找到能量最 優(yōu) 的 對(duì) 接 模 式 并 得 到 對(duì) 接 自 由能、親和力、作用靶點(diǎn)以及氫鍵 作用等相關(guān)數(shù)據(jù).同樣方法進(jìn)行 了 一 致 序 列 與 MMPs 家 族 其 它 成 員的分子模擬對(duì)接. 通 過 查 詢 PDB 數(shù) 據(jù) 庫 共 獲 得 13種 MMPs( MMP1 ～ 3、MMP7 ～ 14、MMP16、MMP 20和 MMP 23 ) 的 已 知 三 維 結(jié) 構(gòu)，對(duì) 應(yīng) 模 板 分 別 為1SU3A、1RTG、1C3IB、2DDY、3DPE、1L6J、1Q3A、1HV5、2W08、1EUBA、1bqqM、1RM8A、2JSD 和2K72.
1. 7 單克隆結(jié)合肽噬菌體對(duì)金屬離子的親和測定
1. 7. 1 NTA樹脂去Ni2+處理 吸取等體積樹脂，分裝于2支離心管中，TBS 洗滌，其中1支離心管中加入 0. 5 mol /L EDTA ( pH8. 0 ) ，重 復(fù) 1 次，再 用0. 1%TBST洗3 次，最后加入TBS，混勻、分 裝 為100 μL /管，4 ℃ 保存. EDTA 處和未處理的樹脂分別命名為 M － 和 M + ，M 表示金屬元素.
1. 7. 2 Hitrap 樹脂加Zn2+處理 方法與NTA 樹脂處理相似，不同的是 Hitrap 樹脂未加載金屬離子. 吸取等體積 Hitrap 樹脂，加載足夠量 Zn2 + (0. 3 mol /LZnSO4) ，離心，依次TBS，0. 1%TBST洗滌，分裝和4 ℃ 保存.
1. 7. 3 單克隆結(jié)合肽噬菌體的Zn2+親和測定 分別以加載和未加載 Zn2 + 的 Hitrap 樹脂為陽、陰性處理，取 M + 、M － 樹脂Ep 管各1支，加入 BSA 封閉培養(yǎng)1h，棄上清，加入 5 × 1010pfu 擴(kuò)增的單克隆噬菌體結(jié)合培育 1 h，棄上清，0. 1% TBST 洗滌，0. 2 mol /L 甘氨酸-HCl 洗脫 2 次，合并 2 次洗脫液，測定噬菌體滴度，計(jì)算 P /N 值( 金屬離子螯合樹脂噬菌體洗脫滴度 /未加載金屬離子螯合樹脂的噬菌體洗脫滴度) . Ni2 + 樹 脂的親和力測定方法類同 Zn2 + 樹脂測定.
1. 7. 4 單克隆結(jié)合肽噬菌體的Ni2+親和測定 方法同1. 7. 3，以加載和未加載Ni2+的NTA樹脂為陽、陰性處理.
1. 8 單克隆結(jié)合肽噬菌體與細(xì)胞結(jié)合的免疫熒光檢測
MG-63細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)按常規(guī)操作 ( 含 10%FBS 的 DMEM，2 mmol /L谷氨酰胺，100 U /mL青 霉素和 100 μg /mL鏈霉素于37 ℃ ，5% CO2 的 FORMACO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)) ，在6孔板中制備 MMP-14 誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)表達(dá)的MG-63細(xì)胞，然后加入擴(kuò)增的單克隆噬菌體，經(jīng)孵育、洗滌，細(xì)胞固定等步驟后，加入鼠抗M13單抗( Amersham Biosciences 公司) ，經(jīng)結(jié)合、洗滌等步驟，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗 IgG，甘油封片，Olympus熒光顯微鏡下觀察噬菌體與細(xì)胞表面分子的結(jié)合水平，并計(jì)算熒光率.
1. 9 合成多肽對(duì)MG-63 細(xì)胞活力的體外MTT測定
MG-63 細(xì) 胞 復(fù) 蘇、培養(yǎng)按常規(guī)操作，配 制 5 ×104 個(gè) /mL 細(xì)胞懸液，于 96 孔 板 中每孔加 100 μL，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 貼壁后，依次加入不同濃度的合成多肽(0. 1，1，10 和 100 μg /mL)繼續(xù)培養(yǎng)72h 后，每孔加入 20 μL MTT(5 mg /mL) ，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸盡上清，再加 入 DMSO 150 μL，振蕩10min，使其充分溶解，酶標(biāo)儀測定 490 nm 波長處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率.
抑制率 = (1-加藥組的平均A值 /對(duì)照組的平均 A 值) ×100% ，重復(fù)3次.
2 結(jié)果
2. 1 靶向MMP-14的噬菌體隨機(jī)肽庫篩選
以MMP-14蛋白催化結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)，經(jīng)過4輪噬菌體隨機(jī)12肽庫篩選，噬菌體得到富集，洗脫噬菌體的滴度結(jié)果見 Fig. 1，可見噬菌體隨著篩選輪數(shù)的增加而逐漸得到富集，其噬菌體滴度從第1輪的3. 8×103pfu /μL升至 第4輪的5. 3 × 104pfu /μL;同時(shí)在1～3輪中，其P /N 值也隨著篩選輪數(shù)的增加而提高，見 Table 1.
2. 2 靶向 MMP-14 結(jié)合肽序列的確定及親和力反篩測定
2. 3 MMP-14 結(jié)合肽序列的同源比對(duì)及一致序列確定
對(duì)篩選得到的 MMP-14 結(jié)合肽序列在 NCBI 進(jìn)行 GenBank Blast 搜索，未發(fā)現(xiàn)其他生物體存在同源序列. 所有多肽序列經(jīng)經(jīng)驗(yàn)分類后進(jìn)行Clustal X1. 81多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在可能的一致序列AHQLH、HHXH、L / IE PLL / I(X 代表任意氨基酸) ，見Fig. 2，專利申請(qǐng)?zhí)?200910161829X［12］.
2. 4 一致序列多肽與 MMP-14 的分子模擬對(duì)接
為進(jìn)一步預(yù)測和確定一致序列對(duì)MMP-14的專一性，采用類似的方法就 AHQLH、HHTH、LPLL 等 3條一致序列對(duì) PDB 數(shù)據(jù)庫中已解析三維結(jié)構(gòu)的 14種 MMPs ( MMP1-3，MMP7-14，MMP16，MMP 20，MMP 23)進(jìn)行了分子對(duì)接. 結(jié)果發(fā)現(xiàn):一致序列可與MMP7-8，MMP12-13 和 MMP20 等5種MMPs 家 族成員的催化結(jié)構(gòu)域?qū)樱c其它8種 MMPs 家族成員則對(duì)接無效. 這可能與這5種MMPs 的基本結(jié)構(gòu)有關(guān):MMP7 有 著 最基本的結(jié)構(gòu)域，而其它4種MMPs 有著標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)域［13，14］. 3 種一致序列對(duì)接和能量變化等見 Fig. 4 和 Table 4.
2. 5 單克隆噬菌體對(duì)金屬離子的親和能力
2. 6 單克隆結(jié)合肽噬菌體對(duì) MMP-14 在細(xì)胞水平的靶向性
SABC-FITC 免疫熒光檢測單克隆結(jié)合肽噬菌體C3-5、C3-52 與 MMP-14 誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)表達(dá)的MG-63細(xì)胞的結(jié)合水平，結(jié)果見 Fig. 5. 可見與對(duì)照相比，2種噬菌體與MMP-14誘導(dǎo)表達(dá)MG-63 細(xì) 胞 的 熒 光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照細(xì)胞，其誘導(dǎo)細(xì)胞的熒光率明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞，見 Table 6.
2. 7 一致序列多肽對(duì) MG-63 細(xì)胞活力的抑制作用
采用MTT方法檢測 合 成 的 一 致序列多肽 對(duì)MG-63 細(xì)胞活力的抑制作用，共合成和測定了2 條多肽序列 AHQLH 和 LPLL，結(jié)果見 Fig. 6. 可見隨著合成多肽濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系. 其中 AHQLH 在濃度為 10 μg /mL 下 對(duì)細(xì)胞的抑制率即 可達(dá)到41. 6% .
3 討論
近 20 年來，基于 MMPs 的多種抗腫瘤抑制劑先后進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但大多因藥物副作用大 /選擇性差而在臨床試驗(yàn)的Ⅱ、Ⅲ期被否決. 其中的一個(gè)重要原因是因?yàn)檫@些抑制劑具有廣譜的特異性，不僅抑制了靶酶，也抑制了一些有益酶［15］. 迄今為止，只有 1個(gè)基于 MMPs 的 Doxycycline 通過 FDA 認(rèn)證.
考慮 MMP-14 被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的一種 MMPs，我們選擇 MMP-14 為靶標(biāo)進(jìn)行噬菌體隨機(jī)肽庫的篩選與研究，期望通過噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選和分子模擬、細(xì)胞 in vitro 等研究確定高效和專一性的 MMP-14 抑制劑，從而用于靶向 MMP-14先導(dǎo)藥物的研發(fā). 以 MMP-14 催化區(qū)蛋白為靶標(biāo)的噬菌體隨機(jī)肽庫篩選，我們得到了噬菌體的富集，但總體 P /N 值較低( < 8) ，且第4輪低于第3輪，而在第5輪 P /N 值也未有提高(資料未發(fā)表) ，為此我們選取了第3、4 輪的富集噬菌體進(jìn)行測序，考慮第4 輪的多肽已含多個(gè)His，而我們前期的研究已經(jīng)明，His 的存在對(duì) 包 括 Zn2 + 在內(nèi)的多種金屬離子強(qiáng)的親和力［11，16］，顯然含多個(gè) His 的序列特征不適宜作為 MMPs 的專一性抑制劑. 為此，我們對(duì)第 3 輪富集的噬菌體進(jìn)行了大量的測序. 如我們所期望，獲得了多條含一致序列的多肽，多肽序列所含 Ala、Leu 等氨基酸 與 MMP-14 底物蛋白的相似性，也 揭示本篩選結(jié)果的可靠性，更且令我們興奮的是，通過親和力反篩，得到了多條高P/N 值 的結(jié)合肽，其最高單條噬菌體親和力達(dá)到 4024. 39，遠(yuǎn)高于該輪的富集倍數(shù)( P /N = 7. 93)
為了進(jìn)一步預(yù)測和確認(rèn)所得到的一致序列與MMP-14 是否存在相互作用以及確定在 MMP-14 上相互作用的結(jié)構(gòu)域，我們采用計(jì)算機(jī)分子模擬與對(duì)接和細(xì)胞免疫熒光兩種方法進(jìn)行了相關(guān)分析. 包括催化結(jié)構(gòu)域、類血紅素結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的 MMP-14 蛋白的多個(gè)區(qū)域以及多種 MMPs 家族成員三維結(jié)構(gòu)的完全解析，為我們進(jìn)行精確的分子對(duì)接提供了巨大的方便與基礎(chǔ). 我們從初步確定的一致序列中選取了3 條短肽(AHQLH，HHTH，LPLL) 進(jìn)行了其與 MMP-14 的計(jì)算機(jī)分子模擬與對(duì)接，對(duì)接結(jié)果一方面進(jìn)一步確認(rèn)了 3 條一致序列與MMP-14有效結(jié)合，而且確定了其分子對(duì)接位點(diǎn)在MMP-14 催 化 結(jié) 構(gòu) 域 的His-Asn-Glu 位點(diǎn)，與HX對(duì)接的不成 功，從另一角度證明了篩選獲得的一致序列多肽與MMP-14 催化結(jié)構(gòu)域的專一 性結(jié)合作 用，同樣也證明了我們以MMP-14的催化結(jié)構(gòu)區(qū)為靶標(biāo)隨機(jī)肽庫篩選的準(zhǔn)確性. 不盡人意的是，該3條一致序列與 14 種已解析三維結(jié)構(gòu)的 MMPs 中的 5 種MMPs 也能夠有效分子對(duì)接，提示我們需進(jìn)一步的優(yōu)化該 3 條一致序列以提高其對(duì)MMP-14 的專一性. 進(jìn)一步的在細(xì)胞水平的免疫熒光檢測也確認(rèn)結(jié)合肽噬菌體與MMP-14 的有效結(jié)合. MG-63 細(xì)胞的一個(gè)重要特征是在雌激素的誘 導(dǎo)下可以過量表達(dá)MMP-14 ( 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 未發(fā)表) ，通過誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)表達(dá) MG-63細(xì)胞的免疫熒光檢測，我們?cè)诩?xì)胞水平確認(rèn)了單克隆結(jié)合肽噬菌體是通過結(jié)合肽與細(xì)胞表面誘導(dǎo)表達(dá)的 MMP-14 的結(jié)合而發(fā)揮作用的. 另外，分子對(duì)接結(jié)果同時(shí)還揭示，我們篩選獲得部分多肽可能還與金屬離子具有靶向結(jié)合作用，為此，我們進(jìn)行的金屬離子親和力測定確認(rèn)了該種作用，確認(rèn)部分一致序列具有 MMP-14 和 金屬離子雙靶向的作用. 這是非常重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)楝F(xiàn)行研發(fā)的靶向 MMPs 的抑制劑大多 是 在抑制分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上偶聯(lián)金屬離子螯合劑而形成［1］，一致序列的金屬離子親和特征可以避免金屬離子螯合劑的使用而可望在降低毒副作用方面發(fā)揮重要作用.
在以上工作的基礎(chǔ)上，我們就篩選一致序列進(jìn)行了初步的細(xì)胞活力 抑 制 測定，考慮多聚His 短 肽對(duì)金屬離子廣譜的親和特性，顯然不宜作為靶向先導(dǎo)多肽藥物. 為此，我們合成了 AHQLH，LPLL兩條短肽，初步的體外細(xì)胞抑制研究證明所測定的兩條短肽對(duì) MG-63 細(xì)胞具有一定的細(xì)胞活力抑制作用，但與期望作為先導(dǎo)藥物濃度仍存在較大差距，進(jìn)一步的短肽優(yōu)化與改造仍在進(jìn)展中.
4 主要結(jié)論
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