摘要： 肽適體是一種從隨機(jī)氨基酸的肽文庫中篩選出來 ,可以高親合力地與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的短肽序列. 它的主要結(jié)構(gòu)包括恒定的展示支架蛋白及通過兩端限制性插入的高變肽環(huán). 酵母雙雜交技術(shù)常用于篩選針對細(xì)胞內(nèi)特異性靶蛋白的肽適體過程 ,篩選出的肽適體通過特異性結(jié)合識(shí)別靶標(biāo)發(fā)揮類似“干擾基因”的作用從而影響蛋白的生物學(xué)活性.
適體 (aptamer) 源于拉丁語 aptus ,即配對、適應(yīng)之意 , 是 利 用 指 數(shù) 富 集 配 體 的 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 技 術(shù)( systematic evolution of ligands by exponentialenrichment ,SELEX) 從含有大量序列的隨機(jī)文庫中 ,通過多次循環(huán)選擇富集 ,獲取所需要的特定結(jié)構(gòu)或功能的生物適配子. 它具有庫容量大、篩選范圍廣、與靶物質(zhì)親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) ,并以其穩(wěn)定、易修飾等優(yōu)于抗體的特性在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研制方面得以廣泛應(yīng)用.
肽適體(peptide aptamers , pepaptamers)是一種具有與核苷酸適體相類似性質(zhì)的短肽序列:即利用 SELEX技術(shù)從人工合成的隨機(jī)氨基酸肽文庫中篩選出的可特異性、高親合力結(jié)合靶物質(zhì)的復(fù)合蛋白[1]. 并通過與靶物質(zhì)識(shí)別結(jié)合 ,發(fā)揮其特定的生物學(xué)功效.
1 肽適體的功能基礎(chǔ)
肽適體也可稱為誘餌 (decoys) 或化學(xué)抗體分子(chemical antibodies) ,是一種新近出現(xiàn)的生物功能性分子[2 ]. 最早對于肽適體的設(shè)計(jì)靈感來源于免疫球蛋白和 T細(xì)胞受體所共有的保守區(qū)框架結(jié)構(gòu)和高度特異性的可變區(qū)肽段結(jié)構(gòu). 其設(shè)計(jì)原理是將大量人工合成的隨機(jī)肽序列插入、整合于蛋白支架 (proteinscaffolds) 之上 , 利用隨機(jī)區(qū)域的信號模序 (signalmotif) 與特異性靶蛋白之間的相互作用 ,通過多元化的分子生物學(xué)展示技術(shù) (display technique) ,篩選得到針對靶蛋白的高親和力、高特異性的肽適體. 它是一類能在體內(nèi)以特定三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在的短肽序列 ,高度可變的功能性結(jié)構(gòu)域 (functional structuredomain ) 是篩選的物質(zhì)基礎(chǔ). 隨機(jī)序列可變區(qū)域與支架蛋白兩端相互作用的識(shí)別、融合位點(diǎn)構(gòu)成了肽適體的雙重限制性 ,有利于篩選后的修飾、變構(gòu)[3 ]. 與自然存在的氨基酸肽片段相比 ,人工合成的肽適體只包含單一變量的肽環(huán) (loop) 結(jié)構(gòu) ,且兩端的連接限制性也不依賴于二硫鍵 ,而是利用支架蛋白殘基的定義位點(diǎn)相互識(shí)別連接的 ,有利于提高在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性[4 ](Fig. 1 ) .
2 肽適體的篩選原理及技術(shù)路線
肽適體的篩選流程是一種遵循嚴(yán)格限制性的模塊式的進(jìn)化富集過程. 目前主要有 3 種生物學(xué)展示方法用于篩選 :利用酵母雙雜交技術(shù)從細(xì)胞內(nèi)篩選出能與作為“魚餌”的蛋白靶物質(zhì)特異性識(shí)別的肽適體 ,方法簡便、快捷[5 ];通過噬菌體展示技術(shù)優(yōu)化抗體、蛋白或是針對活細(xì)胞的肽適體篩選[6 ];采用逆轉(zhuǎn)錄病毒展示系統(tǒng)建立多種細(xì)胞表型相關(guān)蛋白的篩選平臺(tái)[7 ]. 現(xiàn)就以目前使用最廣泛的酵母雙雜交系統(tǒng)為例介紹肽適體的篩選過程.
首先 ,構(gòu)建氨基酸肽文庫 :將一段長度約為 60bp 的隨機(jī)寡核苷酸片段插入編碼支架蛋白的開放閱讀框 ,利用兩端的高度限制性互相識(shí)別融合 ,使質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后可以穩(wěn)定表達(dá)含有大約 20 個(gè)隨機(jī)氨基酸序列的支架蛋白2肽文庫復(fù)合物 (Fig. 2) . 理論上 ,20 個(gè)隨機(jī)氨基酸序列可通過工程菌株產(chǎn)生約2 ×10的8次方個(gè)不同肽段結(jié)構(gòu)的克隆子 ,作為篩選特異性靶分子的初級文庫. 通過不同的修飾可提高肽適體的穩(wěn)定性 ,增加生物利用度 ,如在編碼肽適體的側(cè)翼序列處引入連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (protein transductiondomain ,PTD) ,有利于肽適體在篩選過程中的外源性攝取[9 ]. 目前 ,最常見的 PTD 是來源于 HIV2TAT 蛋白的攜帶正電荷的編碼序列[10 ]，它可與質(zhì)膜表面攜帶負(fù)電荷的硫酸肝素葡聚糖相互作用介導(dǎo)融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)攝[11-13 ].
3 肽適體的特性
3. 1 肽適體多元生物活性
與基因敲除、RNA 干擾技術(shù)[16 ] 相比 ,肽適體以其精細(xì)的調(diào)控機(jī)理在研究各條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中引起廣泛的關(guān)注. 它對同源靶物質(zhì)具有極高的特異性 ,因此可用于區(qū)分同一蛋白家族的不同成員 ,甚至是不同等位基因變異產(chǎn)生的異構(gòu)體 ,其作用的機(jī)制為封閉蛋白的聚合位點(diǎn) ,抑制信號分子的運(yùn)輸、活化、代謝 ,以及各種酶作用底物的催化激活[17 ]. Zhao 等[18 ]篩選出特異性結(jié)合 Smad224 , Smad7 的 SARA (Smadanchor for receptor activation) 肽適體 ,用于抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial2to2mesenchymal transitionby , EMT) 的生理過程.TGF 激活途徑是與體內(nèi)特異性配體結(jié)合后 ,激活受體激酶 ,引起 Smad2 和 Smad3 的磷酸化[18 ].研究發(fā)現(xiàn) ,實(shí)驗(yàn)中肽適體只能與磷酸化的Smad224 特異性結(jié)合 ,與無活性 Smad224 結(jié)合很少 ,這可能是由于 Smad 經(jīng)磷酸化后暴露出 Smad 錨定受體能與篩選出的 SARA 肽適體通過結(jié)合模序相互識(shí)別、結(jié)合 ,從而抑制二聚化 ,阻礙了 TGF 介導(dǎo)的基因表達(dá). Smad7 是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子[19 ],SARA 肽適體與 Smad7 的結(jié)合與前介紹的有所不同 , 它不受Smad7 磷酸化水平的影響 ,因此 SARA 肽適體可以用于檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中 Smad 的活性水平.
肽適體與現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測技術(shù)相比 ,優(yōu)勢在于可以直接鑒定真核細(xì)胞載體所表達(dá)的靶標(biāo)蛋白 ,無需純化 ,為“邏輯遺傳學(xué)”(logic of genetics) 的研究發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ). 肽適體是一種內(nèi)源性的多肽片段 ,通過與特異性靶蛋白特異功能位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)從而模擬“干擾基因”(perturbogens)的作用[20 ]. de Chassey 等[8 ] 篩選出了一種可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖的 R5G42 肽適體 ,分析其機(jī)制可能是通過肽適體特異性識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)控蛋白 ,二者結(jié)合后形成一定的空間位阻 , 直接或間接的抑制基因表達(dá) ,從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化. Abed等[21 ] 研制的肽適體 F4 ,針對其靶蛋白 Fur (ferricuptake regulator) 具有明顯的抑制作用 ,并通過與基因敲除等技術(shù)比較 ,表明肽適體在多功能蛋白的選擇性抑制方面具有特殊的作用. 肽適體不但具有抑制作用 ,對某些靶蛋白而言 ,肽適體還是一種有效的激活劑.
3. 2 肽適體的穩(wěn)定性和穿透性
肽適體在體內(nèi)可折疊形成穩(wěn)定的三級構(gòu)象 ,與一般游離的氨基酸相比降低了熱力學(xué)的熵值 ,有利于保持較高的生物學(xué)活性. 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展 ,人工表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)率都在不斷提高. 現(xiàn)已有多種小片段 ,易表達(dá)的支架蛋白被廣泛用于肽適體領(lǐng)域[22 ]. 它們各自的生物學(xué)特性有利于肽適體應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展 ,如在表達(dá)過程中能通過空間折疊形成保護(hù)功能效應(yīng)域 ,與效應(yīng)分子結(jié)合后 ,通過變構(gòu)效應(yīng)暴露活性功能效應(yīng)域 ,達(dá)到對肽適體的保護(hù)作用. 目前使用較廣泛的是硫氧還蛋白 A(thioredoxinA ,TrxA) ,利用 TrxA 作為限制性肽適體的支架有利于提高肽適體與篩選靶物質(zhì)結(jié)合的親和力. 經(jīng)研究證明 ,Colas 等[23 ] 篩選出的一種用于抑制依賴細(xì)胞周期性激酶 2 (cdk2) 的 TrxA2肽適體復(fù)合物 ,其半抑制濃度 ( IC50) 比普通游離狀態(tài)下要低 50～1 000倍. 更重要的是 ,肽適體融合于 Trx 支架蛋白上有利于其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá). Cohen等[24 ]構(gòu)建了利用骨肉瘤細(xì)胞 (Saos22) 表達(dá)的 TrxA2肽適體可以有效地抑細(xì)胞增殖和分化. 并以此為基礎(chǔ)研發(fā)出可與 Mdm2 基因編碼的鋅指蛋白特異性結(jié)合的 TrxA2肽適體 ,用于活化 p53 敏感的報(bào)道基因具有良好的效果[25 ]. Cui 等[26 ]篩選出的以 TrxA 作為支架蛋白并在 xFoxH1b 和 Lef1 中較好表達(dá)的肽適體 ,可與 Smads 特異性結(jié)合并選擇性的抑制 TGF 敏感的報(bào)告基因.
具有細(xì)胞穿透性的氨基酸肽段一般為兼性氨基酸 ,它們通過與轉(zhuǎn)運(yùn)載體共價(jià)連接介導(dǎo)其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn). Matsushita 等[27 ]設(shè)計(jì)了一種新型調(diào)控分泌的生物開關(guān). 先在多肽片段的 N2末端上連接 1 個(gè)保持細(xì)胞穿透性的序列 ,而在 C 末端固定一個(gè)抑制分泌功能的序列 ,通過激活不同序列的轉(zhuǎn)錄活性 ,活化或抑制分泌功能. 并以此為基礎(chǔ)研制出了細(xì)胞穿透性肽適體(cell2penetrating aptamer peptides CPAPs) . 多種來源的 CPAPs 可與不同生物學(xué)活性的修飾基團(tuán)共價(jià)連接 ,介導(dǎo)其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并特異性識(shí)別靶物質(zhì) ,發(fā)揮作為靶向分子的生物學(xué)作用[28 ]. Green 等[29 ] 利用CPAPs 構(gòu)建了研究蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域的生物學(xué)模型.Trehin 等[30 ]將 CPAPs 用于靶向定位藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的研究獲得了良好的成效.
4 肽適體的應(yīng)用
肽適體通過與配基的特異性識(shí)別 ,為高置信限水平靶標(biāo)確認(rèn)提供了有利的工具. 分析肽適體與目的蛋白之間的精細(xì)調(diào)節(jié)可在候選蛋白群中篩選出意義蛋白 ,為新藥研發(fā)中的藥物靶向位點(diǎn)確定提供了
一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái). 現(xiàn)已有一種肽適體印記技術(shù)(AptaPrintTM)[3 ]可用于快速靶向定位 (Fig. 4) . 首先通過分析靶蛋白的生物學(xué)活性 ,定位特征性功能域或是構(gòu)建同源性模型 ,如 :酶的活性位點(diǎn)、介導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn) ,或是形成特殊空間的“口袋”結(jié)構(gòu)域 ;接著利用氨基酸置換介導(dǎo)這些功能特異性位點(diǎn)的定向突變 ,經(jīng)酵母雙雜交系統(tǒng)展示突變異種 ,并可通過自身的陽性選擇鑒別有意義的結(jié)構(gòu)功能域. 這種技術(shù)的突破在于 AptaPrintTM 可依靠目的位點(diǎn)或是鄰近部位的高分辨率解決由于氨基酸置換介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)修飾 ,而產(chǎn)生誘導(dǎo)作用或是影響了蛋白質(zhì)固有的折疊. 另一個(gè)突破就是利用軟件可以精確地構(gòu)建同源性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型. 肽適體可以結(jié)合于不同物質(zhì)的反應(yīng)表面 ,特異性識(shí)別蛋白的不同功能域.雖然肽適體是小分子蛋白 ,但它不是一種平面結(jié)構(gòu) ,而是以一種多態(tài)性的空間結(jié)構(gòu)存在的 (包括各種折疊、螺旋、口袋等) .
5 展望
與反義核酸技術(shù)相比 ,肽適體技術(shù)還顯得相當(dāng)年輕 ,但它們針對靶物質(zhì)的多元生物學(xué)活性(既可以抑制 ,也可以激活) 已引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注. 利用肽適體對不同表型的篩選以及對不同表面分子不同功能結(jié)構(gòu)域的鑒別 ,有利于拓寬對蛋白質(zhì)組學(xué)的研究 ,加快新藥研發(fā)的進(jìn)程.
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