摘 要 目的：了解抗菌肽對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抗菌機(jī)制，以期為抗菌肽臨床治療MRSA肺炎提供參考。方法：查閱近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就各種抗菌肽對(duì)MRSA的抗菌機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行歸納和總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論：抗菌肽相對(duì)于抗菌藥物擁有較多優(yōu)勢(shì)——（1）抗菌肽是生物天然免疫系統(tǒng)的組成部分，容易獲得；抗菌肽氨基酸數(shù)較少、肽鏈較短，減小了合成抗菌肽的難度，為大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正電荷，YD1、Melittin 和Bac8c均通過(guò)其表面的正電荷與MRSA表面的負(fù)電荷結(jié)合并黏附于細(xì)菌表面，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌；LL-37能抑制MRSA生物膜的形成并破壞已經(jīng)形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通過(guò)在MRSA周圍聚集進(jìn)而發(fā)揮殺菌作用；J-AA、J-RR和J-AR利用其結(jié)構(gòu)特殊性，通過(guò)內(nèi)/外膜透化機(jī)制，破壞MRSA細(xì)胞膜，從而殺傷細(xì)菌。上述機(jī)制皆不涉及受體與配體之間的結(jié)合，避免了MRSA對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥性。（3）大部分抗菌肽在極低的MIC下即已對(duì)MRSA展示出了強(qiáng)大的殺菌作用�？咕牡氖褂靡泊嬖谝欢ǖ木窒扌浴�1）抗菌肽的肽鏈較短，增加了提取難度，人工合成抗菌肽則提高了藥物成本。（2）抗菌肽的短肽鏈和簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性較差。（3）抗菌肽是一種異種蛋白，可能誘發(fā)患者產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)和毒性作用。
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床常見(jiàn)的一種多重耐藥菌，主要造成院內(nèi)感染和社區(qū)感染。MRSA能定植于人體內(nèi)的不同組織表面導(dǎo)致多種疾病，38.3％的感染患者可從痰液分離培養(yǎng)得到 MRSA，MRSA肺炎是院內(nèi)危重患者的常見(jiàn)感染類型，其中腫瘤患者的 MRSA 肺炎感染率達(dá) 11.4％[1-2]。由于 MRSA 的多重耐藥性，使得MRSA肺炎的臨床治療困難，患者遷延不愈且病死率較高�？咕氖且活愑缮锩庖呦到y(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性多肽，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，已有研究將抗菌肽外用于感染部位并取得了較好的效果[3]。鑒于此，筆者查閱近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就各種抗菌肽對(duì)MRSA抗菌機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行歸納和總結(jié)，以期為抗菌肽臨床治療MRSA肺炎提供參考。
1 MRSA的耐藥機(jī)制
MRSA 的耐藥性主要依賴于一層胞外多糖基質(zhì)構(gòu)成的生物膜，由于生物膜的阻隔作用使膜內(nèi)部分細(xì)菌免受抗菌藥物的殺傷作用，并可在適當(dāng)時(shí)候釋放至膜外造成患者感染復(fù)發(fā)和遷延不愈。臨床使用的大部分抗菌藥物只能殺滅活動(dòng)中的MRSA，生物膜中細(xì)菌的代謝較弱，多數(shù)處于休眠狀態(tài)。生物膜的保護(hù)作用使 MRSA能有充足的時(shí)間開啟耐藥基因，產(chǎn)生大量抗菌藥物水解酶，進(jìn)一步降解進(jìn)入生物膜內(nèi)的抗菌藥物，使MRSA獲得耐藥性[4-5]。MRSA的耐藥機(jī)制還涉及對(duì)抗菌物質(zhì)相應(yīng)受體的封閉作用，通過(guò)改變自身細(xì)胞膜受體，阻礙抗菌物質(zhì)通過(guò)受體合黏附于細(xì)胞膜，從而逃避殺傷。
2 抗菌肽
抗菌肽具有來(lái)源廣泛、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)和不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[6]�？咕牡目咕鷻C(jī)制主要在于其能抑制細(xì)菌生物膜的形成，并破壞已形成的生物膜，通過(guò)激發(fā)機(jī)體的天然免疫功能殺死游離細(xì)菌，從而發(fā)揮有效的殺菌作用，其殺菌機(jī)制不涉及受體機(jī)制的特點(diǎn)，避免了MRSA對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[7]。
2.1 YD1（Glycin-rich antimicrobial peptide）
YD1是一種從解淀粉芽孢桿菌中分離出來(lái)的多肽類抗菌物質(zhì)，多存在于發(fā)酵食物中（如泡菜）�？咕腨D1表面黏附著大量正電荷，而細(xì)菌細(xì)胞膜表面存在負(fù)電荷團(tuán)，故細(xì)菌能被YD1黏附、殺傷。YD1的正電荷與MRSA的負(fù)電荷結(jié)合，在細(xì)菌表面形成包裹，黏附于細(xì)菌表面的YD1通過(guò)穿胞作用進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，進(jìn)一步激活細(xì)菌 DNA，誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡。YD1 的穿胞作用不涉及受體結(jié)合，避開了MRSA產(chǎn)生耐藥性的途徑。
Rahman MS等[8]的研究旨在比較抗菌肽YD1、桿菌肽和萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA的殺菌作用，檢測(cè)了3種抗菌物質(zhì)的最低抑菌濃度（MIC），進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)MRSA肺炎的治療作用。結(jié)果顯示，桿菌肽對(duì) MRSA 的 MIC 為 64µg/mL，萬(wàn)古霉素的 MIC＞128 µg/mL，抗菌肽 YD1 的MIC 為 32 µg/mL，可見(jiàn)抗菌肽 YD1 較桿菌肽和萬(wàn)古霉素顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)（P＜0.05）。抗菌肽YD1對(duì)MRSA具有明顯的抑制作用，其殺菌機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)菌滅亡，且不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，在治療MRSA肺炎的藥物研究中具有較好的前景。
2.2 LL -37（Leucine Leucine-37）
抗菌肽家族主要包括防御素和 Cathelicidin，LL-37是 Cathelicidin 家族唯一的抗菌物質(zhì)。LL-37 存在于人體內(nèi)多種上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、體液和創(chuàng)傷分泌物中，能夠發(fā)揮抗微生物活性、參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等作用，是具有多種功能的活性小分子肽[9]。
LL-37針對(duì)MRSA肺炎的殺菌機(jī)制包括直接殺死游離MRSA，抑制MRSA生物膜的形成和破壞已經(jīng)形成的MRSA 生物膜。MRSA 在肺組織表面的初始附著量決定了其能否在肺內(nèi)形成成熟的細(xì)胞膜，而LL-37能夠直接減少人體肺組織表面的MRSA初始附著量，并影響生物膜的形成[10]。此外，LL-37還能夠抑制MRSA在肺組織表面的局部聚集，通過(guò)阻礙MRSA在肺組織表面的附著和聚集成團(tuán)，從而有效阻礙MRSA形成有效穩(wěn)定的生物膜。LL-37參與構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)，能募集各種免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞），調(diào)節(jié)人體炎癥反應(yīng)，協(xié)調(diào)非特異性和特異性兩大免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用殺滅MRSA。由于這一殺菌機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，因而能避免MRSA對(duì)抗菌肽LL-37產(chǎn)生耐藥性[11]。
Dürr UH等[12]的研究通過(guò)結(jié)晶紫染色法分析了抗菌肽 LL-37 對(duì) MRSA 初始附著量的影響。該研究在無(wú)菌96 孔板中接種 MRSA 菌液 100 µL，實(shí)驗(yàn)組在每孔各加入不同濃度的 LL-37 溶液 100 µL，兩組皆在 37 ℃下培養(yǎng)24 h，并通過(guò)酶標(biāo)儀在結(jié)晶紫染色后測(cè)定其570 nm 吸收度值。結(jié)果顯示，在 LL-37 溶液濃度為 0.625 µmol/L時(shí)，LL-37 對(duì) MRSA 臨床株生物膜形成的抑制率為27％，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；LL-37溶液濃度增加至3.130 µmol/L時(shí)，LL-37對(duì) MRSA臨床株生物膜形成的抑制率達(dá)63％。對(duì)兩組培養(yǎng)基形成的生物膜在激光共聚焦顯微鏡下掃描的結(jié)果顯示，兩組培養(yǎng)基形成的生物膜差異顯著：對(duì)照組培養(yǎng)基形成的生物膜熒光信號(hào)強(qiáng)、結(jié)構(gòu)完整、細(xì)菌排列致密，成型生物膜平均厚度為15～25 µm，生物膜發(fā)育較為成熟；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基形成的生物膜熒光信號(hào)弱、細(xì)菌排列疏松，成熟菌斑總量明顯減少，成型生物膜厚度偏�。�3～7 µm）；兩組成型生物膜厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
抗菌肽LL-37可抑制和破壞MRSA生物膜，還參與構(gòu)成人體非特異性免疫系統(tǒng)，減少超敏反應(yīng)的發(fā)生率。這些優(yōu)勢(shì)使抗菌肽 LL-37 在治療 MRSA 肺炎上具有巨大的潛力。
2.3 hBD3-CBD（Human beta defensin 3-Carbohy-drate Binding Domain）
hBD3 為抗菌肽防御素家族的重要成員，參與構(gòu)成人體非特異性免疫系統(tǒng)，并在生理?xiàng)l件下具有一般抗菌肽不具有的穩(wěn)定性。hBD3 廣泛表達(dá)于人體的免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和創(chuàng)傷部位[4]。
hBD3 的抗菌機(jī)制主要與其糖類結(jié)合域（CBD）相關(guān)，通過(guò)與MRSA表面糖鏈的結(jié)合在MRSA附近聚集，并黏附于 MRSA 表面，再通過(guò) hBD3 表面的正電荷與MRSA表面負(fù)電荷結(jié)合并經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，誘導(dǎo)MRSA細(xì)胞膜破裂，從而殺滅細(xì)菌[13]。
為進(jìn)一步提升hBD3的抗菌效力，CBD的寡核苷酸鏈和 hBD3 基因片段被研究者重組，從而增強(qiáng)抗菌肽hBD3 黏附細(xì)菌的能力，得到合成產(chǎn)物 hBD3-CBD。通過(guò)重組質(zhì)粒將 CBD 和 hBD3 基因融合，并在真核細(xì)胞（pVAX1）中表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其抑菌能力進(jìn)行評(píng)估[13]。該研究分別給3組培養(yǎng)基接種MRSA，其中2組分別加入hBD3和hBD3-CBD，另一組作為對(duì)照組，通過(guò)計(jì)算3組培養(yǎng)基在感染3、6、12 h不同時(shí)間點(diǎn)的菌落生成數(shù)和上清液中炎癥因子指標(biāo)白細(xì)胞介素6（IL-6）的濃度來(lái)評(píng)價(jià)抗菌肽的抑菌能力和抗炎癥能力。對(duì)各組上清液進(jìn)行IL-6濃度檢測(cè)的結(jié)果顯示，感染6、12 h時(shí)，對(duì)照組的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中 IL-6 的濃度較感染前明顯增加，且顯著高于另外 2 組。同時(shí)，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在感染6、12 h時(shí)，hBD3組和hBD3-CBD組的抑菌作用明顯高于對(duì)照組；感染12 h時(shí)，hBD3組和hBD3-CBD組的菌落生成數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），hBD3-CBD 顯示出對(duì) MRSA 更強(qiáng)的抗菌作用�？梢�(jiàn)，通過(guò)增加CBD的數(shù)量提高抗菌肽對(duì)細(xì)菌的黏附作用，能使人工合成的新型抗菌肽hBD3-CBD較hBD3具有更強(qiáng)的抑菌作用。
2.4 J-AA（Junction-Anoplin-Anoplin）、J-RR（Junction-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide-Argi-nine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）和 J-AR（Anop-lin-Arginine- and Trytophan-Rich Hexapeptide）
Anoplin 是一種從黃蜂毒液中提取的抗菌肽，RW（Arginine- and Trytophan-Rich Hexapeptide）是通過(guò)“鏈接”化學(xué)合成的人工抗菌肽，從而合成新型抗菌肽J-AA、J-RR和J-AR。這3種抗菌肽均擁有雙親性結(jié)構(gòu)，能夠穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜并在短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，包括外膜透化作用和內(nèi)膜透化作用。這兩種穿透細(xì)胞膜的機(jī)制不需要受體介導(dǎo)，使得MRSA無(wú)法對(duì)抗菌肽進(jìn)行受體的改變從而產(chǎn)生耐藥性。
研究者將這3種抗菌肽與臨床常規(guī)使用的抗菌藥物卡那霉素及其親本 Anoplin 和 RW 進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用 MRSA 肺炎模型大鼠[14]。結(jié)果顯示，卡那霉素對(duì)MRSA 的 MIC＞298 µg/mL，Anoplin 和 RW 的 MIC 分別為 73.8、64.3 µg/mL，而人工合成抗菌肽 J-AA、J-RR 和J-AR的MIC分別為21.1、18.7、19.9 µg/mL�？梢�(jiàn)，該研究中的新型抗菌肽的抗 MRSA 作用是其親本的 4～6倍，同時(shí)強(qiáng)于抗菌藥物卡那霉素的抑菌能力。該研究結(jié)果還顯示，J-RR對(duì)MRSA的抑制效果較好，J-AR和J-RR的劑量達(dá)到120 mg/kg后才顯示出對(duì)MRSA肺炎模型大鼠的毒性作用，具有較大的安全治療窗。J-RR通過(guò)內(nèi)外膜透化機(jī)制破壞MRSA細(xì)胞膜的完整性，不依賴受體的結(jié)合從而具有不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，故而這種新型合成抗菌肽成為治療MRSA肺炎的重要選擇之一。
2.5 Melittin和Bac8c（Bactenecin-8c）
Melittin是從蜂毒中提取的多肽類抗菌物質(zhì)；Bac8c是利用合成技術(shù)生成的人工抗菌肽。細(xì)菌細(xì)胞膜的負(fù)電荷被兩者表面的正電荷團(tuán)結(jié)合，相互黏附最終形成致死的孔隙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌被殺滅。
研究者比較了Melittin和Bac8c對(duì)MRSA菌株的作用，該研究分別在不同培養(yǎng)基中加入同樣濃度的不同菌株的 MRSA，并且分別注入抗菌肽 Melittin 和 Bac8c[15]。結(jié)果顯示，Melittin 在不同菌株的 MRSA 中 MIC 均為 5µg/mL；而 Bac8c 在 WBG8287 菌株中 MIC 為 7 µg/mL，在W17S和Aus3菌株中MIC均達(dá)80 µg/mL。結(jié)果還顯示，Melittin 對(duì)不同菌株的 MRSA 具有更穩(wěn)定的治療作用，殺滅MRSA的能力更強(qiáng)。
2.6 其他
TempL（Temporin L）是從青蛙體內(nèi)提取的抗菌肽，由13 個(gè)氨基酸組成，其對(duì) MRSA 的 MIC 為 25.5 µg/mL[6]。但由于TempL的肽鏈太短，造成提取工藝復(fù)雜和操作困難。TempL的抗菌機(jī)制尚不清楚，研究者們正致力于尋找該肽鏈中決定TempL多種抗菌能力的片段，為人工合成TempL提供可能性[16]。
抗菌肽 Clavanin-A 對(duì) MRSA 的 MIC 為 2.4 µg/mL，具有強(qiáng)大的殺菌作用，但由于表達(dá)量少且合成困難限制了其臨床研究的開展[6]。研究者通過(guò)對(duì)Clavanin-A進(jìn)行修改，得到新型抗菌肽Clavanin-MO，其殺菌作用與親本Clavanin-A 相仿，且 Clavanin-MO 基因能在畢赤酵母中得到大量的穩(wěn)定表達(dá)，可能成為未來(lái)治療MRSA肺炎的重要抗菌藥物[17]。
活魚體內(nèi)有一種 Piscidin 家族的抗菌肽。Rbmoro（Moronecidin）隸屬于Piscidin家族，由70個(gè)氨基酸組成，可從巖鯉科魚中提取，對(duì)MRSA的MIC為6.9 µg/mL[5]。研究者已獲得決定Rbmoro殺菌能力的相應(yīng)肽段，并通過(guò)人工合成在不同的細(xì)菌中將此肽段大量表達(dá)。但當(dāng)這種具有殺菌作用的肽段回輸至活魚體內(nèi)后，卻產(chǎn)生了明顯的溶血反應(yīng)，溶血的原因?yàn)榇穗亩螌?duì)活魚的紅細(xì)胞產(chǎn)生了破壞作用，而相應(yīng)的機(jī)制尚未明確[17]。
抗菌肽殺菌機(jī)制包括阻礙MRSA生物膜形成，影響基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)菌滅亡，促進(jìn)上皮組織生長(zhǎng)覆蓋創(chuàng)口，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞表達(dá)和招募 TB 淋巴細(xì)胞等[3，18-19]。目前發(fā)現(xiàn)對(duì)MRSA具有殺菌作用的抗菌肽較多，其中一部分對(duì)MRSA的殺菌效果顯著，但由于其對(duì)患者同時(shí)存在的毒性作用、穩(wěn)定性差和提取難度大等原因，使得其離臨床應(yīng)用依然有一定距離。
3 結(jié)語(yǔ)
綜上所述，抗菌肽相對(duì)于抗菌藥物擁有較多優(yōu)勢(shì)：（1）抗菌肽是生物天然免疫系統(tǒng)的組成部分，容易獲得；抗菌肽氨基酸數(shù)較少、肽鏈較短，減小了合成抗菌肽的難度，為大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正電荷，YD1、Melittin 和 Bac8c 均通過(guò)其表面的正電荷與MRSA表面的負(fù)電荷結(jié)合并黏附于細(xì)菌表面，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌；LL-37 能抑制MRSA生物膜的形成并破壞已經(jīng)形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通過(guò)在MRSA周圍聚集進(jìn)而發(fā)揮殺菌作用；J-AA、J-RR 和 J-AR 利用其結(jié)構(gòu)特殊性，通過(guò)內(nèi)/外膜透化機(jī)制破壞MRSA細(xì)胞膜，從而殺傷細(xì)菌。上述機(jī)制皆不涉及受體與配體之間的結(jié)合，避免了MRSA對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥性。（3）大部分抗菌肽在極低的MIC下即已對(duì)MRSA展示出了強(qiáng)大的殺菌作用。
然而，抗菌肽的使用也存在一定的局限性：（1）抗菌肽的肽鏈較短，增加了提取難度，人工合成抗菌肽則提高了藥物成本。（2）抗菌肽的短肽鏈和簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性較差。（3）抗菌肽是一種異種蛋白，可能誘發(fā)患者產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)和毒性作用。
目前，抗菌肽還處在研究階段，其作用機(jī)制尚未完全明確，但其抗菌譜廣，具有不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)，且不同的抗菌肽具有各自的特點(diǎn)。上述特點(diǎn)使抗菌肽具有成為未來(lái)治療MRSA肺炎的重要抗菌物質(zhì)的潛力。
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