摘 要 目的：探索自組裝短肽RAD16-Ⅰ構(gòu)建抗腫瘤藥物原位水凝膠的可能性。方法：采用流變儀測(cè)量含與不含抗腫瘤藥物紫杉醇的0.1％、0.2％、0.5％ RAD16-Ⅰ水溶液與等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）混合前后的儲(chǔ)存模量（G′）、損耗模量（G″）、相位角（Δ）等流變學(xué)參數(shù)；通過倒置顯微鏡觀察含與不含紫杉醇的RAD16-Ⅰ水溶液加入乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞的培養(yǎng)基后形成的水凝膠狀態(tài)及對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響（與紫杉醇水溶液比較）。結(jié)果：在含與不含紫杉醇的RAD16-Ⅰ水溶液中，G′近似或略大于G″，隨RAD16-Ⅰ濃度增加G′和G″變化很小；與不加PBS比較，加入PBS后G′顯著增加且呈濃度依賴性，G″也有增加但增加幅度比G′要小很多，Δ顯著變小。含紫杉醇的RAD16-Ⅰ溶液在細(xì)胞培養(yǎng)基中能形成并保持水凝膠狀態(tài)，水凝膠與同濃度紫杉醇水溶液作用于細(xì)胞相同時(shí)間后的細(xì)胞形態(tài)基本相同。結(jié)論：含紫杉醇的RAD16-Ⅰ水溶液可在模擬生理?xiàng)l件下形成水凝膠，并保持凝膠狀態(tài)和紫杉醇固有的抗腫瘤作用。
抗腫瘤藥物給藥的方法和途徑除常用的口服和靜脈用藥外，還可以局部或腔內(nèi)給藥。為了提高腫瘤區(qū)域的藥物濃度，腫瘤局部給藥系統(tǒng)的研究方興未艾[1-3]，研究的重點(diǎn)主要集中在提高療效和降低不良反應(yīng)方面[4-5]。近年來，用作藥物載體材料的釋藥特征[6]、對(duì)主藥活性的影響[7]以及所構(gòu)建的給藥系統(tǒng)的生物安全性[8]也為許多實(shí)驗(yàn)研究所關(guān)注。離子互補(bǔ)型自組裝短肽作為新型生物材料，由于其基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單可控且具有良好的自組裝特性和生物相容性，得到許多領(lǐng)域研究者的注意[9-10]，探討自組裝短肽以混懸液、水凝膠等形式被開發(fā)為藥物載體的研究是其中頗具特色的部分[9，11]。已有研究表明，離子互補(bǔ)型自組裝短肽RAD16-Ⅰ不僅能作為膠體穩(wěn)定劑使水難溶性藥物在水中相對(duì)穩(wěn)定地存在，而且在體液離子強(qiáng)度和（或）pH條件下能夠迅速形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠，顯示了其具有成為原位水凝膠藥物載體的潛力[12-13]。本研究采用臨床常用且療效顯著的抗腫瘤藥物紫杉醇（PAC）作為模型藥物[14]，初步探討以自組裝短肽RAD16-Ⅰ構(gòu)建抗腫瘤藥物原位水凝膠載體的可能性。
1 材料
1.1 儀器
AR200ex 流變儀（美國 TA 公司）；CKX41-A32PH 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；TGW16離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司，離心半徑：12 cm）。
1.2 藥品與試劑
RAD16- Ⅰ（Ac-RADARADARADARADA-CONH2，純度：≥98％，制成1％（m/V）的水溶液，臨用前稀釋為所需濃度）；PAC（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100382-201102，供含量測(cè)定用）；L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（100 u/ml的青霉素和100 μg/ml鏈霉素，使用時(shí)稀釋100倍）、胰酶細(xì)胞消化液 0.25％Trypsin-EDTA（美國 Invitrogen公司）；牛胰島素（美國Sigma公司）；水為超純水，其余試劑為分析純。
1.3 細(xì)胞
乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞（四川大學(xué)納米生物醫(yī)學(xué)與膜生物學(xué)研究所保存）。
2 方法與結(jié)果
2.1 含與不含PAC的RAD16-Ⅰ水凝膠的黏彈性特征
將1％的RAD16-Ⅰ水溶液稀釋制成0.1％、0.2％、0.5％的RAD16-Ⅰ水溶液。將1％的RAD16-Ⅰ水溶液和PAC水溶液（1.75 μg/ml）稀釋制成含PAC的不同濃度（0.1％、0.2％、0.5％）的RAD16-Ⅰ水溶液。取上述水溶液分別與等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混合，采用流變儀測(cè)量混合前、后的儲(chǔ)存模量（G′）、損耗模量（G″）和相位角（Δ）。測(cè)量用夾具直徑20 mm，不銹鋼錐板錐度1 °，平截25 μm，應(yīng)變?cè)O(shè)為固定的0.5％，頻率掃描時(shí)頻率范圍為0.1～100 Hz，時(shí)間掃描時(shí)頻率為1.0 Hz，加蓋防止溶液揮發(fā)，帕耳貼板控溫系統(tǒng)控制溫度為 25 ℃，每次測(cè)量用70 μl 樣品。含與不含 PAC 的 RAD16-Ⅰ水凝膠的黏彈性特征測(cè)定結(jié)果見表1。
從圖1中可以看出，未加入PBS之前，溶液的G′在頻率達(dá)到1 Hz后隨頻率增加急劇增加，而加入PBS之后，在10 Hz以下，G′隨頻率變化的幅度都很小，且在不同頻率下G′遠(yuǎn)大于G″。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)基中含與不含PAC的RAD16-Ⅰ水凝膠的形態(tài)特征及抗腫瘤效果
MDA-MB-435S細(xì)胞貼壁達(dá)80％時(shí)，胰酶消化，離心（135×g，5 min），細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞終濃度為1×104/孔。接種于96孔板，置于37 ℃下培養(yǎng)，在分別培養(yǎng)1 d后，更換培養(yǎng)基，分別加入含與不含PAC（75 nmol/L）的不同濃度（0.2％、0.5％）的RAD16-Ⅰ水凝膠或PAC溶液（75 nmol/L），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24、48 h后觀察水凝膠的形狀、透明程度、凝膠狀態(tài)的維持情況以及不同給藥情形下培養(yǎng)基或水凝膠中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞密度、細(xì)胞形狀，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白對(duì)照進(jìn)行比較。含與不含PAC的0.2％ RAD16-Ⅰ水凝膠作用24 h的細(xì)胞顯微鏡圖見圖 2，含與不含 PAC 的 0.2％、0.5％ RAD16-Ⅰ水凝膠作用 24、48 h的細(xì)胞顯微鏡圖見圖3。
由圖2可知，含與不含PAC的RAD16-Ⅰ溶液均能在培養(yǎng)基中形成水凝膠，水凝膠呈透明的膜片狀；在未更換培養(yǎng)基的情況下，水凝膠與細(xì)胞共處24 h時(shí)仍然很好地保持其存在的狀態(tài)。由圖3可知，從細(xì)胞密度、細(xì)胞形狀等方面對(duì)比，含PAC水凝膠的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與加入PAC水溶液的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況相似，提示水凝膠形成后保持了其中所加載藥物PAC固有的抗腫瘤效果。
3 討論
水溶液具有的黏彈性，可用G′和G″的大小和對(duì)頻率的依賴性來表征[15-16]。G′代表材料的彈性特征，此值增加意味著材料特性更接近于彈性固體；G″代表材料的黏性特征，此值增加意味著材料特性更接近于黏性液體；Δ的正切等于G″/G′，其值的增加意味著材料在相對(duì)黏彈性上趨向于黏性液體。本研究中流變學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，含與不含PAC的RAD16-Ⅰ水溶液在與PBS接觸前表現(xiàn)為更接近于黏性液體的行為特性，與PBS接觸后表現(xiàn)更接近于標(biāo)準(zhǔn)的彈性體行為，表示溶液中粒子間相互締合、纏結(jié)作用較強(qiáng)，已處于聚集狀態(tài)，表現(xiàn)出一定的機(jī)械強(qiáng)度；較低頻率時(shí)呈現(xiàn)出顯著的彈性且隨頻率變化不明顯，表明水溶液中形成了典型的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這提示RAD16-Ⅰ在接觸到 PBS 后能夠迅速形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠。由于PBS 能基本模擬體液中的離子強(qiáng)度和pH 情況，所以上述實(shí)驗(yàn)顯示的RAD16-Ⅰ的動(dòng)態(tài)黏彈流變性能表明RAD16-Ⅰ具有成為PAC等抗腫瘤藥物原位水凝膠載體的潛力。
原位水凝膠作為藥物載體需要形成的水凝膠在目的作用部位以一定的形狀保持足夠的時(shí)間，以保證所加載藥物的緩控釋作用發(fā)揮。觀察水凝膠在有細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的存在狀態(tài)和保持時(shí)間，以及細(xì)胞的形狀和生長(zhǎng)狀況，可以簡(jiǎn)單、直觀地初步表征這種原位水凝膠在體內(nèi)應(yīng)用的可能性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的含與不含PAC的RAD16-Ⅰ水溶液均能在模擬生理?xiàng)l件下形成透明的膜片狀的凝膠并維持相當(dāng)時(shí)間，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀況對(duì)比提示水凝膠形成后保持了其中所加載藥物PAC固有的抗腫瘤效果。
本研究初步表明了自組裝短肽構(gòu)建抗腫瘤藥物原位水凝膠并在體內(nèi)應(yīng)用的可能性。離子互補(bǔ)型自組裝短肽屬于具有高度生物相容性的生物可降解合成生物材料，可以利用其在腫瘤組織原位形成親水性凝膠而作為抗腫瘤藥物載體。后續(xù)研究需要進(jìn)一步開展深入的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以充分驗(yàn)證其可行性。
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