摘 要 目的：制備細(xì)胞穿膜肽PFV修飾紫杉醇（PTX）/青蒿琥酯（ART）共載靶向膠束，并考察其體外抗腫瘤活性。方法：按前期優(yōu)化的工藝，采用薄膜水化法制備PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，并對(duì)其進(jìn)行表征。以空白膠束作為空白對(duì)照，采用磺基羅丹明B法評(píng)價(jià)PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的毒性；以香豆素作為熒光探針取代PTX，制成相應(yīng)的不同膠束，采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡測(cè)定和觀察BGC-823細(xì)胞對(duì)各膠束的攝取情況和靶向性；并通過(guò)Transwell小室法考察PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對(duì)BGC-823細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果：PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的平均粒徑為（51.30±3.95）nm，分散系數(shù)為 0.19±0.01，Zeta 電位為（0.21±0.02）mV，PTX、ART的包封率均高于90％，形態(tài)呈圓球形�？瞻啄z束對(duì)BGC-823細(xì)胞無(wú)明顯毒性，PTX膠束、PTX/ART膠束以及 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束對(duì) BGC-823 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為（3.09±0.22）、（1.93±0.24）、（1.11±0.15）μmol/L；不同膠束在BGC-823細(xì)胞核中的分布數(shù)量排序依次為PFV修飾香豆素/ART膠束＞香豆素/ART膠束＞香豆素膠束＞空白對(duì)照，抑制細(xì)胞侵襲作用的大小依次為 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束＞PTX/ART 膠束＞ART 膠束＞PTX 膠束＞空白對(duì)照。結(jié)論：制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束符合《中國(guó)藥典》要求；其對(duì)BGC-823細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可提高藥物的靶向性和細(xì)胞對(duì)藥物的攝取能力，并能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
胃癌是消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。目前，化療是胃癌的主要治療方式，但化療后殘余的癌細(xì)胞會(huì)通過(guò)侵襲作用導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，且化療藥物會(huì)增加機(jī)體的毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[2]。紫杉醇（PTX）具有較高抗癌活性，在臨床用于多種癌癥的治療，但溶解性低、生物利用度差、無(wú)選擇分布是限制其臨床應(yīng)用的主要原因[3]。提高PTX的靶向性以降低其毒副作用并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移顯得尤為重要。細(xì)胞穿膜肽（簡(jiǎn)稱“PFV”）具有細(xì)胞穿透能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并且能增加藥物在腫瘤部位的蓄積[4]。青蒿琥酯（ART）具有抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增敏抗腫瘤化療藥物的作用[5-7]。膠束具有粒徑小和對(duì)機(jī)體毒性低等優(yōu)點(diǎn)，可增加化療藥物的溶解度并提高化療藥物對(duì)腫瘤的被動(dòng)靶向性[8-11]。為提高PTX的腫瘤靶向性及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用，本課題組前期優(yōu)化工藝后采用薄膜水化法制備了 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束，其中PFV用來(lái)提高細(xì)胞對(duì)藥物的攝取能力，PTX作為化療藥物，ART用來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)所制膠束進(jìn)行表征后并進(jìn)一步考察PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的體外抗腫瘤作用，為膠束包載PTX的靶向給藥和ART抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)制劑開(kāi)發(fā)提供參考。
1 材料
1.1 儀器
FA1004 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SG3300H型超聲波清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DZKW-S-4型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)療器械五廠）；HBS-1096A型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；JEM-1200EX 型透射電鏡（日本 Tokyo 公司）；Ac-curi C型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；ZS90型激光散射粒徑測(cè)定儀（英國(guó)Malvern公司）；WJ-80B-Ⅱ型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SW-CJ-1D型超凈臺(tái)（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）。
1.2 藥品與試劑
PTX原料藥（批號(hào)：MB1178，純度：≥99％）、ART原料藥（批號(hào)：J0101A，純度：≥98％）、TPGS1000（批號(hào)：MB2036）、胰蛋白酶、磺基羅丹明B（SRB）、青鏈霉素雙抗；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Soluplus兩親性接枝共聚物（德國(guó)BASF公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-PFV（DSPE-PEG2000-PFV）修飾膠束的靶向材料由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室合成；三氯甲烷、甲醇等試劑均為分析純，水為娃哈哈牌純凈水。
1.3 細(xì)胞
人胃癌BGC-823細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。
2 方法與結(jié)果
2.1 膠束的制備
按照文獻(xiàn)方法[12]，精密稱取 DSPE-PEG2000-PFV 1.5mg、ART 2 mg、Soluplus 60 mg、TPGS1000 12 mg、PTX 0.5mg于50 mL圓底燒瓶中，加5 mL三氯甲烷使溶解，然后在40 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷。待燒瓶底部形成一層均勻白色膜時(shí)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）5 mL，在35 ℃水浴下振搖11 min，再以微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò) 2 次，隨后將濾過(guò)的膠束溶液轉(zhuǎn)移至 5mL量瓶中，以PBS定容至刻度，即得PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束。同時(shí)，按照上述方法制備空白膠束（空白對(duì)照）、PTX膠束、ART膠束和PTX/ART膠束，其中空白膠束只添加處方量的 Soluplus 和 TPGS1000，PTX 膠束只添加處方量的 Soluplus、TPGS1000和 PTX，ART 膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和ART，PTX/ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000、ART和PTX。
2.2 膠束的表征
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
將 BGC-823 細(xì)胞接種到含 1％青鏈霉素和 10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)（下同）。第2天換液，隔天傳代，采用4～6代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。
2.4 膠束對(duì)BGC-823細(xì)胞的毒性作用考察
2.5 BGC-823細(xì)胞對(duì)膠束的攝取情況考察
以香豆素作為熒光探針考察細(xì)胞對(duì)膠束的攝取情況。以香豆素代替PTX，按“2.1”項(xiàng)下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束（香豆素的含量均為2 μmol/L[3]，其余藥物和輔料的用量不變），并同時(shí)制備空白膠束作為空白對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞接種至6孔板中（2.5×105個(gè)/孔），分為不同膠束給藥組，先用不含藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，然后加入新鮮含藥培養(yǎng)基[180 μL/孔，其中膠束給藥量均為20 μL/孔（含藥膠束中ART濃度均為100μmol/L）]，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h。然后以 PBS 洗板，以 0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入 0.5 mL PBS。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，該值越大，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)膠束的攝取越多。
2.6 膠束對(duì)BGC-823細(xì)胞的靶向性考察
以香豆素作為熒光探針考察膠束的靶向性。以香豆素代替PTX，按“2.1”項(xiàng)下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束；同法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，以PBS洗板，加入4％多聚甲醛固定細(xì)胞8 min，在避光處用Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中藥物的分布情況，其中藍(lán)色熒光區(qū)域代表BGC-823細(xì)胞核，綠色熒光區(qū)域代表香豆素，藍(lán)綠色熒光區(qū)域?yàn)榧?xì)胞與香豆素分布的疊加處。
2.7 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束對(duì) BGC-823 細(xì)胞侵襲的影響
采用Transwell小室法進(jìn)行測(cè)定。按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備空白膠束（空白對(duì)照）、PTX 膠束、ART 膠束、PTX/ART 膠束和 PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束，各含藥膠束中 PTX 濃度均為 10 μmol/L，ART 濃度均為100 μmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，以0.25％胰蛋白酶溶液消化后，接種在 Transwell 小室中（1.5×105個(gè)/孔），分為不同膠束給藥組，各小室中加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基[200 μL/室，給藥量為20 μL/室]。在24孔板中加入含 10％胎牛血清的培養(yǎng)基（700 μL/孔），將上述 Transwell小室放在24孔板中培養(yǎng)10 h后，用棉球擦去小室中未侵襲的細(xì)胞，并用4％多聚甲醛固定小室下方侵襲的細(xì)胞25 min，然后用0.1％結(jié)晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察，并隨機(jī)選取1個(gè)視野拍照，鏡下紫色信號(hào)的強(qiáng)度與侵襲通過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量成正比。
3 討論
近年來(lái)，膠束作為化療藥物的運(yùn)送載體在抗腫瘤方面的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注，其疏水嵌段組成的聚合物膠束內(nèi)核能夠?yàn)殡y溶性藥物提供貯藏空間，而疏水性化療藥物的溶解度也在親水外殼的共同作用下明顯提高[8]。基于此，本課題組將化療藥PTX和ART共同包埋于膠束內(nèi)，使這兩種藥物達(dá)到協(xié)同增效的目的。PFV是一種疏水性的電中性短肽，經(jīng)PFV修飾的脂質(zhì)體等遞藥系統(tǒng)能明顯增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取[4]。本課題組前期通過(guò)�；磻�(yīng)合成了DSPE-PEG2000-PFV，其可嵌入膠束中使PFV修飾于膠束外周。本研究制備的PFV修飾PTX/ART 共載靶向膠束呈圓球形，粒徑在 51 nm 左右，有良好的粒徑分布和形態(tài)，藥物的包封率均大于90％，符合2015版《中國(guó)藥典》（四部）的要求[13]。
體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，PTX 的終濃度設(shè)置為 10μmol/L是為了保證在殺傷腫瘤細(xì)胞的前提下，還能保證本研究各項(xiàng)試驗(yàn)中有足夠的細(xì)胞存活量；在 ART 的Transwell 小室預(yù)試驗(yàn)中，當(dāng) ART 的濃度為 100 μmol/L時(shí)，恰能抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此本研究在膠束的處方中設(shè)置 ART 的濃度為 100 μmol/L。本研究結(jié)果顯示，空白膠束對(duì)BGC-823細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，這提示膠束膜材安全性較高，可作為運(yùn)送藥物的載體[14]。PFV修飾 PTX/ART 共載靶向膠束中 PTX 濃度為 0.63～10μmol/L時(shí)，與其他膠束樣品比較具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
因 PTX 和 ART 都不具有熒光活性，所以在細(xì)胞攝取和膠束靶向性試驗(yàn)中，本課題組選擇具有熒光活性的香豆素作為探針?biāo)幬�。香豆素作為熒光探針在研究脂質(zhì)體等給藥體系的藥物攝取情況中已有運(yùn)用，具有簡(jiǎn)便、易操作的特點(diǎn)[15]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對(duì)PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束進(jìn)行定量和定性考察，發(fā)現(xiàn)香豆素的熒光強(qiáng)度在PFV修飾膠束組細(xì)胞中顯著增強(qiáng)，表明PFV修飾后可增加載藥膠束在腫瘤細(xì)胞中的分布，提高了藥物的腫瘤靶向性，并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。此外，本研究通過(guò)細(xì)胞侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，載有 ART 的膠束均呈現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用，這表明 ART 的加入可抑制 BGC-823 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
綜上所述，本研究成功制備了 PFV 修飾 PTX/ART共載靶向膠束，其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能提高藥物的腫瘤靶向性和細(xì)胞對(duì)藥物的攝取能力，并且可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。但由于試驗(yàn)均在體外完成，并不能代表體內(nèi)結(jié)果，在接下來(lái)的研究中，筆者將進(jìn)一步展開(kāi)PFV 修飾 PTX/ART 共載靶向膠束的體內(nèi)抗腫瘤作用研究。
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