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類 ACE 抑制肽的合成及體外活性分析
瀏覽量:1321 | 2024/5/9 10:15:47


摘要: 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶( angiotensin converting enzyme,ACE) 通過作用于維持血壓正常的腎素-血管緊張系統(tǒng) ( rennin-angiotensin system,RAS) 和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng) ( kallikrein-kinin system,KKS) ,使其失衡導(dǎo)致血壓升高. 而 ACE 活性抑制肽可以競爭性地與 ACE 的活性中心結(jié)合,從而抑制 ACE 的活性,使血壓降低. 天然來源的 ACE 抑制肽與傳統(tǒng)的降壓藥物相比效果較好,無毒副作用,對正常血壓沒有影響,對于高血壓的治療和人類健康具有重要意義. 本文以酪蛋白中提取的ACE 活性抑制肽KVLPVP為先導(dǎo)肽,根據(jù)ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)特點,設(shè)計合成一系列的類ACE肽( similar ACE-like peptides) . 利用反相高效液相色譜法( RP-HPLC) 直接測定其體外 ACE 抑制活性. 結(jié)果表明,當(dāng)芳香性的氨基酸殘基 Phe、Tyr、His 和疏水性 Val 殘基位于 C-端時會提高多肽的ACE 抑制活性,尤其是 His 位于 C-端時,ACE 抑制活性更強. 通過對比先導(dǎo)肽與所合成的類 ACE肽的 ACE 活性抑制率,可以發(fā)現(xiàn),類 ACE 肽的 ACE 活性抑制率均高于先導(dǎo)肽. 基于不同氨基酸殘基位于C-端時對多肽的 ACE 抑制活性的研究,可以為降血壓藥物分子設(shè)計和篩選提供基礎(chǔ).


高血壓是最常見的慢性病,也是心腦血管病最主要的影響因素,它能引起腦卒中、心肌梗塞、心力衰竭以及慢性腎臟病等并發(fā)癥,潛 在 的 危 害 性大[1,2]. 近年來,隨著人們生活水平的提高,高血壓的發(fā)病率也呈上升趨勢,嚴(yán)重威脅著人類健康[3-7].血管緊張素轉(zhuǎn)化酶( angiotensin converting enzyme ,ACE) 是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的含 Zn2 + 外肽酶,它不僅可以將沒有催化活性的血管緊張素 I轉(zhuǎn)化為對血管收縮具有促進(jìn)作用的血管緊張素 II;而且也可以使舒緩肌肽失活[8,9],對人體血壓的調(diào)節(jié)起到重要作用[10]. 目前,人們多使用合成的 ACE抑制劑如卡托普利等藥物來治療高血壓,但這些藥物存在一定的副作用和不良反應(yīng),天然來源的 ACE抑制肽可最大程度地減少傳統(tǒng)降壓藥物產(chǎn)生的一些不良反應(yīng),在控制和治療高血壓方面有著很大潛力,因此成為人們研究的焦點[9,11].


1970 年,F(xiàn)erreira等[12] 在蛇毒液中提取出ACE 抑制肽( ACE inhibitory peptides) ,目 前 已 有很多 ACE 抑制肽的研究報道. 其中 發(fā) 現(xiàn) 從 酪 蛋白源中提取分離出來 的KVLVPQ、MAIPKK,服 用很少劑量就能起到很顯著的降壓作用[13-15]. 但是,天然來源的 ACE 抑制肽結(jié)構(gòu)單一,較多的研究集中在其活性,而很少研究其構(gòu)效關(guān)系. 本文以天然提取的 ACE 活性抑制肽 KVLPVP( 酪蛋白源) 為先 導(dǎo) 肽,根 據(jù) ACE 抑制肽的結(jié)構(gòu)特點,采用 Fmoc 固相 合 成 法( SPPS) 合 成 了 3 種 類 ACE抑制肽KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY,研究不同的氨基酸殘基位于 C-端時對多肽的 ACE 抑制活性的影響.


1 材料與方法


1. 1 材料

Fmoc-AA-Wang Resin、Fmoc-AA-OH、HOBt、HBTU、DIEA、TFA、TIS ; 茚三酮、哌啶、無水乙醚、DMF 均為市售分析純試劑; ACE、HHL 購自美國 Sigma 公司; 馬尿酸( 生物純,上海晶純試劑有限公司) ; 乙腈、甲醇( 色譜純,天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司) .


FF210 型多肽固相合成管; Agilent 1200 高效液相色譜儀; LGJ-10 冷凍干燥機; Bruke Esquire-3000型離子肼液相色譜質(zhì)譜儀; UV-2450 紫外-可見分光光度計.


1. 2 先 導(dǎo) 肽 KVLPVP 及 其 類 似 物 KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY 的固相合成

以 Wang Resin 作為固相載體,F(xiàn)moc 保護(hù)的氨基酸 為 原 料,采用固相合成法[16,17],用 HOBT /HBTU / DIEA 混合試劑進(jìn)行縮合,用體積比為 95∶2. 5∶ 2. 5 的 TFA / TIS / H2O 混合試劑把目標(biāo)肽從王樹脂上切割下來,即得到以 KVLPVP 為先導(dǎo)肽的類 ACE 抑制肽 KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY.


1. 3 類 ACE 抑制肽的體外抑制 ACE 活性測定

ACE 抑制劑的活性檢測方法主要有體外檢測法和體內(nèi)檢測法[10,18],體外檢測方法主要包括紫外分光光度法[10,19]、高效液相色譜法[10,20]等. 高效液相色譜法具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點,所以得到廣泛的應(yīng)用[10,11]. 本文也采用高效液相色譜法測定類 ACE 抑制肽的體外抑制 ACE 活性.


1. 4 多肽的 ACE 抑制活性測定

在 ACE 的作用下,三肽 HHL 被催化分解為二肽 His-Leu 和馬尿酸,緩沖溶液作為空白對照,當(dāng)ACE 抑制劑加入以后,抑制了三肽 HHL 的分解,使馬尿酸的生成量減少. 通過三肽 HHL 在加入 ACE抑制劑前后生成的馬尿酸的峰面積的不同,得出ACE 抑制劑的活性大小,計算公式為:


IR = ( A-B) /A × 100%     ( 1)


式( 1) 中 IR 為 ACE 抑制肽樣品對 ACE 的抑制率( % ) ; A 為空白對照組中馬尿酸的峰面積; B 為添加 ACE 抑制肽組中馬尿酸的峰面積


ACE 溶液配制: 用1mL 0. 1mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3,含 0. 3 mol /L NaCl) 溶解 0. 1 U 的 ACE,即得所需溶液. 配制 類 ACE 抑 制 肽 溶 液 ( 2. 0 mg /mL) : 用 1 mL0. 1mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3,含0. 3 mol /L NaCl ) 溶解2. 0mg 多肽純品,即可配制成一系列所需肽溶液. 配制 HHL 溶液( 5. 0 mmol /L) : 用10 mL 0. 1 mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3,含 0. 3mol /L NaCl ) 溶解 0. 02167 g HHL,即配制成所需溶液. 配制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液( 1. 0 mmol /L) : 首先稱 18. 0mg 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)樣品,將其溶解于適量雙蒸水,然后定容到 100 mL,即得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 配制反應(yīng)液: 移取 40 μL ACE 抑制肽溶液 2. 0 mg /mL 多肽溶液,置于 1. 5 mL 離心管中,加入 ACE 溶液 30 μL,37 ℃下保溫 5 min,再加入 HHL 溶液 80 μL,混合均勻后反應(yīng) 60 min( 在 37 ℃ 恒溫水浴槽中) ,最后加入 1. 0mol /L HCl 200 μL 中止反應(yīng),即配制成所需反應(yīng)液.配制空白對照液: 將上述反應(yīng)液中的 ACE 活性抑制肽溶液用40 μL 的0. 1 mol /L 硼酸緩沖液( pH 8. 3,含 0. 3 mol /L NaCl ) 代替即可.


色譜條件為流動相: 乙腈/超純水 = 50 /50 ( 各含 0. 05 % TFA) ,流速: 0. 6 mL /min; 檢測波長: 228nm; 色譜柱: Agilent Eclipse XDB-C18( 4. 6 mm × 150mm,5 μm) ,柱溫 25 ℃ ; 進(jìn)樣量: 20 μL.


2 結(jié)果


2. 1 ACE 抑制肽及其類似物的合成及表征
先 導(dǎo) 肽 KVLPVP 及其類似物KVLPVF、KVLPVY、KVLPHY 的 ESI-MS 表征如 Fig.1中所示,分離純化及質(zhì)譜表征結(jié)果如 Table 1.


由 Table 1 可以看出,用固相合成法合成的多肽副產(chǎn)物少且產(chǎn)率較高,合成的粗肽經(jīng) ESI-MS 表征,其分子離子峰值都與其相對分子質(zhì)量一致,將粗肽經(jīng) RP-HPLC 分離純化后,產(chǎn)品純度都達(dá)到 90 %以上.


2. 2 類ACE抑制肽的體外抑制ACE活性分析
2. 2. 1 檢測波長的選擇 在 190 nm~300 nm 波長范圍內(nèi),對 1. 0 mmol /L 馬尿酸標(biāo)液進(jìn)行掃描. 結(jié)果表明,馬尿酸在波長 228 nm 處有最大吸收,所以把 228nm 作為體外抑制 ACE 活性分析中的檢測波長.
2. 2. 2 多肽的體外抑制 ACE 活性分析 因為時間原因,對合成的多肽分兩次進(jìn)行研究. 按照 1. 4 中方法配制空白對照溶液 a、b,在色譜條件下進(jìn)行液相分析,其液相色譜圖如 Fig. 2 所示.
在空白對照溶液 a 的液相色譜圖( A) 中,Rt =4. 523 的峰為三肽 HHL 在 ACE 的催化下分解產(chǎn)生的馬尿酸,峰面積 S 為 939. 9 mAU·S,在空白對照溶液 b 的液相色譜圖( B) 中,Rt = 4. 539 的峰為三肽HHL 在 ACE 的催化下分解產(chǎn)生的馬尿酸,其峰面積 S 為 3066. 6 mAU·S.
按照方法配制先導(dǎo)肽及類 ACE 抑制肽的反應(yīng)液,在色譜條件下進(jìn)行液相分析,其液相色譜圖如Fig.3所示.


通過 Fig.3( A) 、( B) 、( C) 分別與 Fig.2 空白對照液 a( A) ,F(xiàn)ig. 3 中( D) 與 Fig. 2 空白對照液 b( B)比較,可 以 看 出,當(dāng) 加 入 先 導(dǎo) 肽 KVLPVP 及 其 類ACE 抑制肽后,馬尿酸的峰面積有所減小,對比先導(dǎo)肽與類 ACE 抑制肽的反應(yīng)液相圖,發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)肽液相圖中馬尿酸峰面積大于其類似物液相圖中的馬尿酸峰面積,這說明其幾種類似物的 ACE 抑制活性大于先導(dǎo)肽對 ACE 的活性抑制作用,具體的 ACE 活性抑制率見 Table 2.


通過 Table 2 可以看出: 用芳香性的氨基酸殘基Phe、Tyr、His 和疏水性的 Val 替換先導(dǎo)肽 KVLPVP中 C-端的氨基酸殘基 Pro 后,相應(yīng)的 ACE 活性抑制率都升高了,其中抑制作用最大的是多肽 KVLPHY,其抑制率達(dá)到 100% .


3 討論


大多數(shù) ACE 活性抑制肽目前都是采取天然分離提取的方法得到的[21,22]. 研究發(fā)現(xiàn),ACE抑制肽的活性與氨基酸種類有關(guān)[7,9]. 由于天然提取的過程較為復(fù)雜,且提取的ACE活性抑制肽結(jié)構(gòu)比較單一,不便于對其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究. 與天然提取方法不同,本文采用 Fmoc 固相合成法合成先導(dǎo)肽及其一系列類ACE抑制肽,經(jīng)RP-HPLC 分離純化并對其進(jìn)行 ESI-MS 表征.結(jié)果表明是所需要的目標(biāo)肽,這為活性研究提供了原料基礎(chǔ). 然后,利用RP-HPLC 法直接測定類 ACE 抑制肽的體外抑制 ACE活性,對比加入類 ACE 抑制肽與空白對照液的液相色譜圖,可以看出多肽的加入對溶液中的ACE活性發(fā)生了不同程度的抑制作用. 這也表明,ACE 抑制肽的活性與其肽鏈C-端的氨基酸種類有著很大的關(guān)系. 通過 Table 2 中不同的 6 肽的ACE活性抑制率的比較,表明當(dāng)先導(dǎo)肽 KVLPVP 的 C-端的氨基酸殘基Pro被芳香性的氨基酸殘基 Phe、Tyr、His 和疏水性 Val 替代后,類ACE抑制肽與ACE活性中心的結(jié)合作用力增強,其 ACE 活性抑制率提高且都高于先導(dǎo)肽,推測芳香性的氨基酸殘基 Tyr 因其側(cè)鏈上有具有親核性的吲哚基,可以增強多肽與 ACE 活性中心 Zn2 + 的作用力. 尤其是His位于C-端時,ACE抑制活性更強,推測是位于 ACE 活性中心的Zn2 +與His 殘基上的咪唑基與發(fā)生了配位作用,咪唑基在與 ACE 結(jié)合的過程中和緩激肽、血管緊張素 I 形成了競爭性作用,使 ACE 的催化活性降低,從而提高其 ACE 抑制活性.


ACE 活性抑制肽降壓效果顯著,同時能減少傳統(tǒng)的降壓藥物所產(chǎn)生的不良反應(yīng),在治療和控制高血壓方面有著廣闊的的應(yīng)用前景. 基于以上不同的氨基酸殘基位于 C-端時對多肽的 ACE 抑制活性影響的研究,可以為降血壓藥物分子的進(jìn)一步設(shè)計和篩選提供了研究基礎(chǔ). 但對于 His 殘基在肽鏈 C-端的具體位置以及它在肽中 C-末端的個數(shù)對肽鏈的ACE 抑制活性有什么影響,將在以后進(jìn)行進(jìn)一步的研究.


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