摘要 ：整合蛋白是一類重要的細(xì)胞表面黏附分子，由 α 和 β 亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合而形成的異二聚體糖蛋白，對(duì)免疫反應(yīng)、免疫細(xì)胞的組織定位、凝血、組織愈傷、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和新血管生成以及骨重塑等都至關(guān)重要。整合蛋白的功能依賴于對(duì)其配體結(jié)合的親和性，以及所介導(dǎo)的下游信號(hào)通路。目前，對(duì)整合蛋白構(gòu)象調(diào)節(jié)及親和力調(diào)控機(jī)制已有深入了解。人類 24 種整合蛋白中，已有 3 種整合蛋白作為臨床治療靶點(diǎn)。這些藥物以單克隆抗體、多肽和小分子化合物為主，均針對(duì)配體識(shí)別序列而設(shè)計(jì)。該類抑制劑往往具有部分激活的作用，直接導(dǎo)致藥物的副反應(yīng)和毒性。為了改善第一代整合蛋白藥物的不足，目前基于晶體結(jié)構(gòu)研究、虛擬篩選、高通量篩選以及基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的新型整合蛋白抑制劑，已經(jīng)有許多進(jìn)入臨床試驗(yàn)。本文綜述了一系列晶體結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)與抑制劑的相互作用，以及借助晶體結(jié)構(gòu)獲得純抑制劑為目的的實(shí)例，這些策略將會(huì)對(duì)開發(fā)新型有效的整合蛋白抑制劑提供很好的參考。
整合蛋白( integrin) 是一類重要的細(xì)胞表面黏附分子( cell adhesion molecule，CAM) ，由 α 和 β 亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合而形成異二聚體糖蛋白。迄今，已發(fā)現(xiàn) 18 種不同的 α 亞單位和 8 種 β 亞單位，組成至少 24 種整合蛋白。根據(jù)整合蛋白分子中 β 亞基的不同，可將其分為8 個(gè)亞家族。如含有 β1 亞基的 VLA( very late appearing antigen) 亞家族; 含 β2 亞基的白細(xì)胞整合蛋白( leukocyte integrin) 亞家族; 以及細(xì)胞黏附素( cytoadhesin) 亞家族。此外，整合蛋白按識(shí)別配體不同可分為 3 大類，第 1 類識(shí)別血管中纖維蛋白原( fibrinogen) 的受體，如 aIIbβ3; 第 2 類識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)( extracellular matrix，ECM) 的受體，如 αvβ3、α4β7; 第 3 類識(shí)別白細(xì)胞的受體，如 αLβ2( lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1 又稱CD11a /CD18) ［1］。整合蛋白種類的多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，決定其生理功能的多樣性和重要性。作為聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外的橋梁，一方面負(fù)責(zé)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與病原體之間的相互作用，另一方面通過雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，對(duì)免疫反應(yīng)、免疫細(xì)胞的組織定位、凝血、組織愈傷、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和新血管生成以及骨重塑等都至關(guān)重要［2］。因此，在藥物研發(fā)以及臨床治療上，整合蛋白抑制劑的研發(fā)一直以來(lái)都是各大制藥公司和科研工作者的主要研究熱點(diǎn)。目前臨床上使用的藥物以單克隆抗體、多肽和小分子化合物為主，均針對(duì)配體識(shí)別序列而設(shè)計(jì)［3］。自從 2001 年第一個(gè)整合蛋白與配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道以來(lái)，已經(jīng)有近 500 個(gè) X 射線晶體結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù) ( Protein StructureDatabase，PDB) 中被報(bào)道，其中大多數(shù)晶體結(jié)構(gòu)是高分辨率的。眾多整合蛋白抑制劑復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)的獲得，為科研工作者更深刻認(rèn)識(shí)整合蛋白與抑制劑或生理狀態(tài)配體結(jié)合的胞外域構(gòu)象重排，以及金屬離子對(duì)整合蛋白構(gòu)象的調(diào)控機(jī)制提供重要的分子水平信息，對(duì)于優(yōu)化第一代抑制劑的活性及選擇性，探究新一代整合蛋白抑制劑的臨床藥物開發(fā)提供重要的理論支持。
1 整合蛋白的構(gòu)象調(diào)節(jié)和親和力調(diào)控機(jī)制
整合蛋白包含 2 個(gè)非共價(jià)結(jié)合的Ⅰ型跨膜糖蛋白 α 亞基和 β 亞基，如 Fig． 1 和 Fig． 2A 所示。α 亞基含 1 000 個(gè)氨基酸殘基，包括頭部 β-propeller 結(jié)構(gòu)域、有些還含有 αⅠ-結(jié)構(gòu)域，腿部的 thigh、genu、calf-1 和 calf-2 等 4 個(gè)結(jié)構(gòu)域、跨膜域和尾部胞內(nèi)域。β 亞基由 700 個(gè)氨基酸殘基組成，包括頭部的βⅠ結(jié)構(gòu)域，腿部的 hybird、PSI、EGF-1、EGF-2、EGF-3、EGF-4、β-tail 結(jié)構(gòu)域、跨膜域和尾部胞內(nèi)域( β4除外) ［4］。βⅠ結(jié)構(gòu)域可與 α 亞基的 β-propeller 結(jié)構(gòu)域一起組成配體的活性口袋，對(duì)于 α 亞基不含Ⅰ結(jié)構(gòu)域的整合蛋白，βⅠ結(jié)構(gòu)域是整合蛋白與配體的結(jié)合區(qū)域。βⅠ結(jié)構(gòu)域插入在 hybrid 結(jié)構(gòu)域中，其中含有 1 條 20 ～ 30 個(gè)氨基酸殘基組成的，能識(shí)別底物的特異性識(shí)別環(huán)( specificity-determining loop，SDL) ，負(fù)責(zé)調(diào)控整合蛋白的配體特異性結(jié)合。
1. 1 整合蛋白構(gòu)象調(diào)節(jié)
整合蛋白為多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的大型跨膜受體蛋白質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化最復(fù)雜，變化范圍最大的細(xì)胞表面受體。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞膜上的整合蛋白不 是 完 全 處 于 低 親 和 性 ( low affinity，bentclosed) 構(gòu)象或高親和性 ( high affinity，extendedopen) 構(gòu)象或中間親和性( intermediate affinity) 構(gòu)象，而是處于各種親和性構(gòu)象之間的動(dòng)態(tài)平衡中。整合蛋白 α 亞基的 genu 結(jié)構(gòu)域和 β 亞基的 EGF-1-2 部位彎曲并緊密排列，使頭部結(jié)構(gòu)域朝向細(xì)胞膜呈倒 V 字型結(jié)構(gòu)，處于彎曲低親和性構(gòu)象。β 亞基的腿部結(jié)構(gòu)域在彎曲構(gòu)象時(shí)也可以外擺，這有助于構(gòu)象平衡( Fig． 1) 。因?yàn)?β 亞基的腿部結(jié)構(gòu)如果是剛性的移動(dòng)，往往會(huì)同 α 亞基發(fā)生沖突。盡管兩亞基的膝蓋結(jié)構(gòu)域離開 70A，但其胞外域的羧基末端卻只分開了 15A［5，6］。如 Fig． 1 所示，在彎曲構(gòu)象中，當(dāng)大腿結(jié)構(gòu)域外擺時(shí)，具有柔性的 β 亞基的小腿結(jié)構(gòu)會(huì)做出調(diào)整，使 α、β 亞基的跨膜域保持連接。當(dāng)胞外配體與整合蛋白結(jié)合后，跨膜結(jié)構(gòu)域就會(huì)分開，這是整合蛋白由細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)初期的重要步驟。配體中 ＲGD 序列的 D 側(cè)鏈?zhǔn)紫扰c β1-α1 環(huán)骨架結(jié)構(gòu)形成氫鍵，接著 Ｒ 側(cè)鏈靠近 β-propeller 結(jié)構(gòu)域的 D224，整個(gè) ＲGD 骨架滑入配體結(jié)合巢中( Fig． 2A 和 2B，F(xiàn)ig． 3) 。此時(shí)處于高親和狀態(tài)的整合蛋白引起一系列的構(gòu)象重構(gòu)，首先始于β1-α1 環(huán)上帶著 ADMIDAS 的配位殘基朝左側(cè)移動(dòng)，引起 α1 /α1’螺旋合并，使 β1-α1 和 α1 螺旋朝向 α亞基移動(dòng)，如 Fig． 2A 所示。α1 螺旋的內(nèi)移，破壞M335 與 ADMIDAS 金屬離子之間的相互作用。α7螺旋空間移位限制打破，推 動(dòng) β6-α7 和 α7 遠(yuǎn) 離hybrid 結(jié)構(gòu)域，使其像活塞一樣向下移動(dòng)。α7 螺旋中的 333 ～ 352 殘基平均移動(dòng) 5. 3A，引起 hybrid 向外擺動(dòng)。配體介導(dǎo)整合蛋白構(gòu)象重排中，最終引起β1-α1 位移 2A，βⅠ位移 40A，α7 螺旋位移 10A，βⅠ / hybrid 結(jié)構(gòu)域夾角增加 62°。整合蛋白 α 和 β亞基的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)彼此分開，膝蓋部位完全伸展引起腿部結(jié)構(gòu)域直立并以大約 70A分離［6，7］。
整合蛋白作為金屬蛋白質(zhì)，與配體的結(jié)合必須依賴于二價(jià)金屬陽(yáng)離子的調(diào)控。β 亞基Ⅰ結(jié)構(gòu)域頂部含一個(gè)由 3 個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)組成的金屬離子結(jié)合點(diǎn)簇，如 Fig． 2A 和 C 所示。位于中間的金屬離子 結(jié) 合 位 點(diǎn) ( metal ion dependent adhesion site，MIDAS) 的金屬離子直接參與結(jié)合配體蛋白。位于左邊的正調(diào)控位點(diǎn) SyMBS( synergistic metal-bindingsite，SyMBS; 又稱 ligand-associated metal ion-bindingsite，LIMBS) 上的金屬離子對(duì)整合蛋白活化是必需的。而位于右邊的負(fù)調(diào)控位點(diǎn)( adjacent to MIDAS，ADMIDAS) 被鈣離子占據(jù)后，可以使整合蛋白處于低親和構(gòu)象。在生理狀態(tài)下，鈣離子和鎂離子以約1 mmol /L 同時(shí)存在。通常，鎂離子對(duì)整合蛋白的活化具有促進(jìn)作用，而鈣離子可以抑制整合蛋白的活化。微摩爾水平低濃度鈣離子可以與鎂離子一起協(xié)同促進(jìn)整合蛋白與配體的結(jié)合，而毫摩爾水平高濃度鈣離子則會(huì)抑制整合蛋白與配體結(jié)合［8,9］。
MIDAS 與配體結(jié)合時(shí)，配體中帶正電荷的 Ｒ或 K 結(jié)合到 αIIβ 的 D224 或 αv 的 D150、D218 上，如 Fig.2A 和 B 所示。盡管 Mg2 + 和 Ca2 + 離子有助于配體與 αⅡbβ3 結(jié)合，但是在 MIDAS 晶體結(jié)構(gòu)上只找到 Mg2 + 。此時(shí)，Mg2 + 的結(jié)合狀態(tài)比較弱，是由 4 個(gè)水分子和 S121 羥基氧及 E220 羧基氧參與形成 6 對(duì)氫鍵。整合蛋白處于低親和狀態(tài)，需要低摩爾濃度的 Mg2 + 來(lái)提高與配體的結(jié)合。β3結(jié)構(gòu)域上的 MIDAS 處于較弱的結(jié)合狀態(tài)，使其能留足更大的正電性與配體中的 D 上羧基氧作用。配體中的羧基氧不僅與 Mg2 + 作用，還能與 β3 亞基的Ⅰ結(jié)構(gòu)域上的 β1-α1 環(huán)骨架結(jié)構(gòu)上的 Y122和 S123 形成氫鍵。這些穩(wěn)定的作用形式，為 β1-α1 環(huán)移動(dòng)靠近 MIDAS，促發(fā) hybrid 向外擺動(dòng)提供基礎(chǔ)［10-13］。
β3 亞基中的 E220 的一個(gè)羧基氧與 SyMBS 的Ca2 + 作用，另一個(gè)氧與 MIDAS 的 Mg2 + 作用，F(xiàn)ig． 2C所示。SyMBS 的金屬離子對(duì) E220 殘基上羧基氧的配位 鍵 調(diào) 節(jié)，會(huì) 降 低 E220 的另一個(gè)羧基氧對(duì)MIDAS 金屬離子的作用，最后增強(qiáng)了 MIDAS 金屬離子的正電性，能促進(jìn)與配體中 D 上羧基氧的結(jié)合。SyMBS 環(huán) 上 的 Ｒ216-D217-A218 與 α 亞 基 上 的propeller 結(jié)構(gòu)域中的殘基相互聯(lián)系。將 α Ⅱ β-SyMBS 環(huán)對(duì)面的界面殘基 F191 突變成 W，SyMBS上的金屬離子失去穩(wěn)定性，降低對(duì) Mn2 + 的親和作用; 然而將 αv-SyMBS 環(huán)面對(duì)的界面殘基 W191 突變成 F，SyMBS 上的金屬離子穩(wěn)定性增加，但作用很弱。測(cè)量 αv 和 αIIb 亞基與對(duì)面 SyMBS 環(huán)上殘基的作用能 量 時(shí) 發(fā) 現(xiàn)，αv 與 SyMBS 環(huán)的作用能量比αIIb 高出 2 ～ 3 倍。αvβ3 的 SyMBS 配位鍵口袋受到扭轉(zhuǎn)成平面狀，使 SyMBS 環(huán)朝著 αv 亞基移動(dòng)，Ca2 + 在 SyMBS 上明顯不穩(wěn)定，在晶體結(jié)構(gòu)中該位點(diǎn)的金屬離子具有變動(dòng)性［11，12］。β 亞基上 SyMBS 的金屬離子的可變性，最終會(huì)改變受體對(duì)配體的結(jié)合能力。
在 αvβ3 和 αⅡbβ3 未結(jié)合配體的晶體結(jié)構(gòu)中，ADMIDAS 的金屬離子分別與 β1-α1 環(huán)上的 S123，α1 螺旋上的 D126 和 D127，及 β6-α7 環(huán)上的 M315的氧原子形成氫鍵［2，3］。纖維蛋白原 γ 亞基羧基端的十二肽( HHLGGAKQAGDV) 纈氨酸上的羧基氧通過水分子能與 ADMIDAS 間接作用，這對(duì)含 ＲGD 序列的配體在與受體結(jié)合過程中非常重要［14］。當(dāng)把纈氨酸酰胺化后，其對(duì)受體的親和能力下降 80% 。隨著配體的結(jié)合，β3 亞基上 I 結(jié)構(gòu)域 α1 螺旋內(nèi)移和 ADMIDAS 的左移破壞了 M335 與 ADMIDAS 的作用，最 后 被 D251 取 代，使 β6-α7 環(huán) 進(jìn) 一 步 遠(yuǎn) 離ADMIDAS。ADMIDAS 配位鍵口袋的重排，使 D251遠(yuǎn)離 MIDAS，增 強(qiáng) 了 MIDAS 金屬離子的正電性［11，12］。α5β1 可以與含 ＲGD 序列的纖連蛋白結(jié)合，其中線性肽序列為 GＲGDSP，環(huán) 肽 序 列 為ACＲGDGWCG。α5β1 與 ＲGD 線形肽序列的晶體結(jié)構(gòu)中，當(dāng)去除 Ca2 + 時(shí)，S134 可直接與 MIDAS 上的Mg2 + 作 用; 當(dāng) Ca2 + 存 在 時(shí)，被 水 分 子 取 代［12］。ADMIDAS 上的 Ca2 + 能抑制 ＲGD 多肽介導(dǎo)構(gòu)象重排。有趣的是，ＲGD 環(huán)肽在 Ca2 + 存在時(shí)的作用與ＲGD 線形肽去除 Ca2 + 時(shí)的結(jié)合狀態(tài)一致，S123 能與 MIDAS 直接形成氫鍵，引起 β1-α1 環(huán)向 MIDAS移動(dòng)。因 此，線 性 ＲGD 在 Ca2 + 缺失時(shí)以及環(huán)肽ＲGD 在 Ca2 + 存在時(shí)，都能提高配體與受體的結(jié)合能力。αvβ3 能識(shí)別纖維蛋白原中的 572ＲGD574 序列而不能識(shí)別 γ 亞基羧基端的十二肽序列［11，12，15］。當(dāng) αvβ3 中 Ca2 + 缺失時(shí)，能提高配體中 D 與 MIDAS的 結(jié) 合 能 力，但使羧基末端的纈氨酸不能與ADMIDAS 的 Ca2 + 形成氫鍵。
2 基于結(jié)合模式的整合蛋白抑制劑的性質(zhì)
整合蛋白的功能依賴于對(duì)其配體結(jié)合的親和性以及所介導(dǎo)的下游信號(hào)通路，整合蛋白構(gòu)象的活化受阻或過度都會(huì)引起疾病。在藥物研發(fā)以及臨床治療上，對(duì)整合蛋白抑制劑的設(shè)計(jì)策略主要是通過抑制整合蛋白與配體結(jié)合的親和性。截止至 2016 年，已有5 種整合蛋白藥物被 FDA 批準(zhǔn)上市，分別是以 αⅡbβ3 為靶點(diǎn)的 abciximab( 阿昔單抗) 、eptifibatide( 依替巴 肽，PDB: 2VDN) 和 tirofiban ( 替 羅 非 班，PDB:2VDM) ; 以 α4β1 和 α4β7 為靶點(diǎn)的 natalizumab( 那他珠單抗) ; 以 α4β7 為靶點(diǎn)的 vedolizumab( 維多珠單抗) 。整合蛋白抑制劑可以根據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行劃分［2，3］。第一代以配體識(shí)別序列設(shè)計(jì)的抑制劑，是整合蛋白生理性配體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這類抑制劑一般含有 ＲGD 序列，目前大部分 FDA 批準(zhǔn)的藥物都屬于這一類型，如 Table 1 所示。由于這些抑制劑都結(jié)合于 ＲGD 結(jié)合口袋，而大部分整合蛋白的結(jié)合口袋都比較保守，所以絕大多數(shù)這類抑制劑都對(duì)同一家族的其他亞型有抑制作用。另外，抑制劑與整合蛋白的結(jié)合往往是快速可逆的，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)指出，在抑制劑解離后，整合蛋白高親和構(gòu)象處于待發(fā)狀態(tài)可以保持?jǐn)?shù)小時(shí)，因此這類抑制劑往往都具有部分激活的作用［16］。選擇性的缺失以及部分激活作用直接導(dǎo)致藥物的副反應(yīng)和毒性。為了改善第一代整合蛋白藥物的不足，目前基于晶體結(jié)構(gòu)研究、虛擬篩選、高通量篩選以及基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)的新型整合蛋白抑制劑，有許多已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)［17-20］。
2. 1 配體識(shí)別序列抑制劑及其設(shè)計(jì)
第一個(gè) FDA 批準(zhǔn)的整合蛋白肽類藥物依替巴肽，在其結(jié)構(gòu)中仍保留 ＲGD 序列。ＲGD 肽類模擬抑制劑在體內(nèi)代謝中常因分子量大、極性表面積高、clog P 低及結(jié)構(gòu)柔性大而受到限制，如 Table 1所示。相比肽類抑制劑，小分子抑制劑往往半衰期長(zhǎng)、特異性高和選擇性強(qiáng)。依據(jù) ＲGD 肽類抑制劑的結(jié)合模式，很快第一個(gè)非肽類 ＲGD 抑制劑替羅非班研發(fā)成功，1998 年首次在美國(guó)上市［21］。如Fig.3 所示，這類抑制劑往往含有能與 MIDAS 上Mg2 + 作用的酸性基團(tuán)，周圍的 N215、S121 和 S123通常也參與氫鍵的形成; 以 及 能 與 α 結(jié) 構(gòu) 域 中D224 形成氫 鍵 的 堿 性 基 團(tuán)( 如精氨酸和哌嗪) 。但在治療中發(fā)現(xiàn)，第一代以配體識(shí)別序列設(shè)計(jì)的抑制劑需要靜脈注射給藥，引起患者血小板減少和出血等副作用。用于治療侵襲性強(qiáng)的腦惡性膠質(zhì)瘤西侖 吉 肽( cilengitide) 在三期臨床試驗(yàn)中失敗，該抑制劑反而提高患者腫瘤的發(fā)生率。另外，在對(duì) αⅡbβ3 口服型抑制劑研發(fā)中也發(fā)現(xiàn)，口服型抑制劑使患者死亡率增加 30% ～ 35%［2，3，22］。為了解決上述問題，現(xiàn)今也已開發(fā)針對(duì) αⅡbβ3的小分子非肽類 ＲGD 抑制劑 UＲ-2922，UＲ-2922 為單純抑制劑，不會(huì)引起 β3 結(jié)構(gòu)域的重排。同源建模數(shù)據(jù)分析表明，UＲ-2922 不直接與 MIDAS 作用，抑制劑的羧基同 Y166 形成氫鍵，與 Ｒ165 形成鹽橋，同 F160 形成 π-π 芳香共軛鍵。又如，化合物 87與替羅非班結(jié)合模式基本一致，但其羧酸端只與S123 形成氫鍵，不與 Y122 和 N215 產(chǎn)生氫鍵，出血時(shí)間比替羅非班明顯縮短［25］�；衔� 38，與傳統(tǒng)ＲGD 類 αvβ3 抑制劑的結(jié)合模式完全不同，抑制劑在結(jié)合口袋中取向相反，二甲氧基的 2 個(gè)氧原子與受體中的 S121、S123 及 MIDAS 中的 Mn2 + 結(jié)合，羧基氧與 Ｒ216，A149 及 Y166 形成 3 對(duì)氫鍵［26］。經(jīng)過對(duì)整合蛋白構(gòu)象調(diào)節(jié)和親和力調(diào)控機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，大部分配體識(shí)別序列設(shè)計(jì)的抑制劑能與整合蛋白快速可逆性結(jié)合，在抑制劑解離后，整合蛋白仍處于高親和構(gòu)象的待發(fā)狀態(tài)，并能與生理性配體結(jié)合，引起構(gòu)象重排，使構(gòu)象表位暴露，如 LIBS ( ligandinduced binding sites) 的表達(dá)以及整合蛋白在細(xì)胞膜表面的聚簇( clustering) ，促發(fā)由外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。盡管如此，在以 ＲGD 序列開發(fā)的抑制劑中，仍有超過 800 萬(wàn)的患者在使用，例如 αⅡbβ3 抑制劑依替巴肽［2，3］。第一代抑制劑具有部分激活作用的性質(zhì)，往往引起毒副反應(yīng)。因此，對(duì)于獲取純抑制效果和口服型抑制劑的開發(fā)，一直成為各類藥物研究所和科研工作者們研究的熱點(diǎn)。想要獲得不引起整合蛋白部分激活的新型抑制劑，需要改變?cè)瓉?lái)模擬天然配體的思路，從定量構(gòu)效關(guān)系和藥效團(tuán)模型構(gòu)建，篩選非 ＲGD 模擬抑制劑是當(dāng)前科研工作者們的主要策略。2008 年，第一個(gè)非 ＲGD 模擬抑制劑 ＲUC-1，是通過高通量篩選 33 264 個(gè)小分子化合物而得到的。ＲUC-1 能高效且專一的作用于 αⅡbβ3，對(duì) αvβ3 無(wú) 作 用。分子對(duì)接數(shù)據(jù)表明，ＲUC-1 只結(jié)合在 αⅡβ 結(jié)構(gòu)域上，在骨架結(jié)構(gòu)中，哌嗪上的氮能與 αⅡβ 亞基上的 D224 形成氫鍵，苯乙酰胺上的氮與 β3 亞基上的 N215 形 成 氫 鍵，稠 環(huán) 結(jié) 構(gòu) 能 與 αⅡ β 亞 基 上Y190 形成 π-π 芳香堆積作用，稠環(huán)結(jié)構(gòu)中的氧通過水 分 子 與 αⅡ β 亞 基 上 D232 形 成 氫 鍵( Fig.3) ［25］。與配體識(shí)別序列設(shè)計(jì)的抑制劑相比，ＲUC-1 與 αⅡbβ3 的共結(jié)晶( PDB: 3NIF) 數(shù)據(jù)顯示，整合蛋白的頭部結(jié)構(gòu)處于低親和的構(gòu)象，ＲUC-1 不與 MIDAS 的金屬離子作用，因此不引起整合蛋白構(gòu)象重 排。基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)獲得的 ＲUC-2 ( PDB:3T3M) ，其活性大約提高 100 倍。與 ＲUC-1 相比，兩者的結(jié)合模式基本一致，但 ＲUC-2 上的伯胺能與 E220 競(jìng)爭(zhēng) MIDAS 上的 Mg2 + ，使 Mg2 + 缺失。當(dāng)Mg2 + 濃度 在 20 mmol /L 時(shí)，ＲUC-2 缺 失 ( Fig.2，3) ［25-27］。這是整合蛋白抑制劑中第一個(gè)取代離子的配體類抑制劑。
接著通過構(gòu)效關(guān)系研究，在 ＲUC-2 的基礎(chǔ)上獲得 ＲUC-3 和 ＲUC-4，如 Fig.3 所 示。ＲUC-3 的IC50較 ＲUC-2 低，但化學(xué)穩(wěn)定性差。與 ＲUC-2 相比，ＲUC-4 溶 解 性 高 出 500 倍，抑 制 效 果 高 出20% 。ＲUC-4 的結(jié)合模式 相 比 于 ＲUC-2，其 苯 環(huán)上額外的氮原子能通過水分子間接作用于 β3 亞基上 Y166［20，23，28］。藥物動(dòng)力學(xué)研究顯示，相比于ＲUC-4，ＲUC-2 的線粒體穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)更好( -1. 16 mL-1 min-1，human) 。目前，ＲUC-4 已獲得專利，正處于院前治療心肌梗塞的相關(guān)研究。通過對(duì) ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)中 25 萬(wàn)個(gè)先導(dǎo)化合物進(jìn)行虛擬篩選，分別從藥物結(jié)合模式、化合物結(jié)構(gòu)特征和工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)行考量，得到 500 個(gè)高得分的化合物，從中篩選得到 5 個(gè)具有潛在活性的抑制劑( MSSM-1～ 5) 。5 個(gè)化合物中 MSSM-1 對(duì) αⅡbβ3 生物活性最高，MSSM-1 較于 ＲUC-2，不存在通過水分子與 αⅡβ 亞基上 D232 形成氫鍵，取而代之的是稠環(huán)上的 2 個(gè)氮與 D224 形成 2 個(gè)氫鍵［18］。另外，基于ＲUC-2 關(guān)鍵的結(jié)合模式進(jìn)行虛擬篩選，通過分子對(duì)接獲得化合物 14 和 15，其中化合物 14 抑制效果最好。當(dāng)把化合物 14 骨架結(jié)構(gòu)縮短一個(gè)碳原子而獲得的化合物 15，其抑制 活 性 降 低 100 倍。研究發(fā) 現(xiàn)，化 合 物 14 的 2 個(gè)正離子中心距離為15. 8 A。
3 問題與展望
整合蛋白抑制劑從第一代基于配體識(shí)別序列設(shè)計(jì)的兩親性肽類和非肽類抑制劑，到目前開發(fā)的基于受體構(gòu)象設(shè)計(jì)的純抑制劑的跨越，然而應(yīng)用于臨床的藥物并不多，也存在許多挑戰(zhàn)性的問題。第一代部分激活的抑制劑通常具有以下特征: 針對(duì) αvβ3 抑制劑兩親酸堿基團(tuán)中的碳原子和氮原子中心距離為 12. 8 ～ 14. 5A，相當(dāng)于 12 個(gè)鍵長(zhǎng)度，而對(duì) αⅡbβ3 作用的抑制劑兩親酸堿基團(tuán)中的原子中心距離為 15. 5 ～ 16. 5A，相當(dāng)于 15 個(gè)鍵長(zhǎng)度; 親脂片段需連接在抑制劑酸性基團(tuán)端; 親脂片段連接的酸性基團(tuán)可與 Ｒ214 殘基形成氫鍵18］。近些年，用于治療不同疾病開發(fā)的整合蛋白抑制劑被設(shè)計(jì)合成出來(lái)，特別是針對(duì)整合蛋白構(gòu)象與親和力調(diào)節(jié)設(shè)計(jì)的抑制劑。這類以受體構(gòu)象設(shè)計(jì)的抑制劑往往需要滿足以下條件: 抑制劑堿性基團(tuán)端( 特別是哌嗪) 能與 D224 殘基作用; 抑制劑骨架結(jié)構(gòu)中的雜環(huán)可與 Y190 形成 π-π 芳香堆積作用; 稠環(huán)上的氮原子與 D232 形成氫鍵; 另一個(gè)陽(yáng)離子端能與 E220 競(jìng)爭(zhēng) MIDAS 上的 Mg2 + ［18］。整合蛋白抑制劑的安全問題主要?dú)w咎于口服抑制劑的致死率問題，以及大部分抑制劑的部分激活作用。盡管整合蛋白在生理狀態(tài)下的構(gòu)象調(diào)節(jié)以及金屬離子對(duì)其構(gòu)象的調(diào)控機(jī)制越來(lái)越清晰，但在第一代整合蛋白抑制劑的基礎(chǔ)上所開發(fā)的新一代抑制劑走上臨床的有效案例尚未實(shí)現(xiàn)［29-31］。迄今為止，大量抑制劑的出現(xiàn)得益于抑制劑與整合蛋白的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。目前對(duì)于獲取純抑制效果的整合蛋白抑制劑迫在眉睫，特別是口服型抑制劑的研發(fā)，以及通過綠色環(huán)保及溫和條件合成新一代 整 合 蛋 白 抑 制劑將是未來(lái)的又一挑戰(zhàn)［10，31-33］。
