摘 要 目的：制備序列為丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（簡稱為“AEYLR”）的小肽修飾的紫杉醇（PTX）納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（A-P-NLC），并對其體內(nèi)外抗腫瘤效果進行評價。方法：采用熔融乳化-低溫固化法制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）、PTX納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（P-NLC）和A-P-NLC，表征其外觀形態(tài)、粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta電位，并檢測其包封率、載藥量及體外釋放度；以NCI-H1299細胞和S180細胞為對象，采用CCK-8法對游離PTX、P-NLC、A-P-NLC（0.44～44.00 μg/mL，以PTX計）的細胞抑制作用進行考察，并計算其半數(shù)抑制濃度（IC50）；以S180荷瘤小鼠為模型動物，對游離PTX、P-NLC、A-P-NLC（5 mg/kg，以PTX計）的抑瘤效果進行評價。結(jié)果：P-NLC和A-P-NLC外觀均呈類圓形、分布均勻；A-P-NLC的粒徑、PDI、Zeta電位分別為（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（－19.77±1.16）mV，較P-NLC有所增加；A-P-NLC的包封率、載藥量分別為（95.71±0.68）％、（1.97±0.25）％，較P-NLC有所降低；A-P-NLC在48 h內(nèi)累積釋放百分率達（35.17±2.08）％，較游離PTX表現(xiàn)出明顯的緩釋作用，且比P-NLC的釋放更緩慢。與游離PTX和P-NLC比較，相同質(zhì)量濃度的A-P-NLC對NCI-H1299細胞和S180細胞的抑制率大部分均顯著升高，IC5值均顯著降低；A-P-NLC給藥處理的S180荷瘤小鼠無死亡現(xiàn)象，一般狀態(tài)良好，且瘤體積顯著縮小、瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：A-P-NLC具有明顯的緩釋作用，其對NCI-H1299細胞和S180細胞的體外抑制作用以及對小鼠S180實體瘤的抑制作用均優(yōu)于游離PTX和P-NLC，且毒性有所降低。
紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是從紅豆杉中提取的一種四環(huán)二萜類化合物，在臨床上主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等的一線/二線治療；其常規(guī)劑型為溶液型注射劑，但該類劑型含有的增溶劑聚氧乙烯蓖麻油會引起過敏反應(yīng)，故將其制備成各種納米制劑以降低其毒性已成為研究熱點[1-4]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（Nanostructrued lipid carriers，NLC）是采用單甘油酯、雙甘油酯、其他類甘油酯、磷脂、鞘脂類等脂質(zhì)為載體，并添加一定比例的液態(tài)油，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)核中而形成的脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng)[5-6]。NLC具有良好的生物相容性，適于靜脈注射、口服等多種途徑給藥[7-8]，具有極大的潛在應(yīng)用價值。序列為丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（Ala-Glu-Tyr-Leu-Arg，簡稱為“AEYLR”）的小肽來自于表皮生長因子受體（EGFR）自磷酸化位點 Y1173，前期研究已證明其對 EGFR 高表達的腫瘤具有良好的體內(nèi)外靶向性[9-10]。為降低抗腫瘤藥物的毒性并提高其靶向性，本課題組將 PTX 制成 AEYLR 小肽修飾的 NLC（簡稱為“A-P-NLC”），對其進行表征，并對其體內(nèi)外抗腫瘤效果進行評價，為 PTX 抗腫瘤制劑的進一步開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。
1材料
AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano-ZS90型納米粒徑電位分析儀（英國Malvern公司）；ZHWY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）；2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；5804R型臺式高速大容量離心機（德國 Eppendorf 公司）；3111 型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Tecan Safire 2型酶標儀（瑞士Tecan公司）；ARZ型電子數(shù)顯游標卡尺（寧波市魯匠工具有限公司）；MD44MM透析袋（美國Viskase公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。
PTX對照品（，批號：17022701，純度：≥98％）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-AEYLR（DSPE-PEG2000-AEYLR，廣州特立生物科技有限公司，批號：GT60304-0324-A，純度：≥90％）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20332）；山崳酸甘油酯（ATO，法國Gattefossé公司）；單硬脂酸甘油酯（GMS，馬來西亞KLK公司）；中鏈三酰甘油（MCT，北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP）、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯（HS15）（德國BASF 公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；聚山梨酯80（美國Sigma公司）；pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，由北京酷來博科技有限公司的固體粉末產(chǎn)品用超純水配制）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純化水或超純水。
人非小細胞肺癌細胞NCI-H1299、小鼠腹水瘤細胞S180均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。
SPF級昆明小鼠50只（雌性30只、雄性20只），體質(zhì)量 18～22 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2013-001。所有動物均飼養(yǎng)于SPF級實驗室，環(huán)境溫度為 18～22 ℃、濕度為 50％～60％，飼喂清潔級真空包裝小鼠飼料。
2 方法與結(jié)果
采用熔融乳化-低溫固化法進行制備。稱取 ATO40 mg、GMS 13 mg、MCT 27 mg、ELP 54 mg 作為油相，另稱取/量取 HS15 54 mg、水 4 mL 作為水相，將油相和水相分別置于 80 ℃水浴中熔融或溶解；在恒溫磁力攪拌下，將油相緩慢滴入水相，待滴加完成，繼續(xù)乳化 10min；隨后將油水混合物迅速置于冰水浴中固化15 min，再分別經(jīng)0.45 μm、0.22 μm微孔濾膜濾過后，即得NLC溶液。另外，先單獨將 5 mg/mL 的 PTX 無水乙醇溶液200 μL（揮干乙醇）或與DSPE-PEG2000-AEYLR 8 mg同時加入上述油相中，再按同樣的操作方法分別制得PTX納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（P-NLC）溶液和修飾有AEYLR小肽的 PTX 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（A-P-NLC）溶液。3 種 NLC樣品溶液均顯藍色乳光。
采用高效液相色譜（HPLC）法測定PTX含量。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）；流速為 1 mL/min；柱溫為 25 ℃；檢測波長為 227 nm；進樣量為 20 μL[11]。精密稱取 PTX 對照品適量，以流動相制成質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的系列標準溶液，按上述色譜條件測定；以 PTX 的峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c，μg/mL）進行線性回歸，得標準曲線方程為A＝0.558 5c+0.910 7（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，PTX 的質(zhì)量濃度在5.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
采用超濾離心法[12]測定樣品的載藥量和包封率。取“2.1”項下制備的 P-NLC 樣品溶液適量，置于超濾離心管（截留分子量：10 kDa，下同）中，10 000 r/min 離心40 min，收集下清液，經(jīng)甲醇適當稀釋后，按上述色譜件進樣測定，得游離藥物含量（W 游離）；另取P-NLC樣品溶液適量，置于離心管中，經(jīng)乙腈破乳后，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，按上述HPLC色譜條件進樣測定，得總藥物含量（W 總）。按照公式計算 P-NLC 的載藥量（DL）和包封率（EE）：DL（％）＝（W 總 －W 游 離）/W 脂 質(zhì) ×100％，EE（％）＝（W 總－W 游離）/W 總×100％；式中，W 脂質(zhì)為處方中液態(tài)脂質(zhì)和固態(tài)脂質(zhì)的總量[13]。另取“2.1”項下制備的A-P-NLC樣品溶液適量，同法測定。試驗均重復(fù)3 次 。結(jié) 果 ，P-NLC 和 A-P-NLC 的 載 藥 量 分 別 為（99.13 ± 0.86）％ 、（95.71 ± 0.68）％ ，包 封 率 分 別 為（2.33±0.15）％、（1.97±0.25）％，A-P-NLC 的載藥量和包封率較P-NLC均有所降低。
取游離PTX和“2.1”項下制備的P-NLC和A-P-NLC樣品溶液適量，采用透析法[13]模擬藥物釋放過程，設(shè)置截留分子量為10 kDa、釋放介質(zhì)為含0.2％聚山梨酯80的PBS，于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h時取樣，按“2.3”項下 HPLC 法測定 PTX 質(zhì)量濃度，考察其體外釋放度，并按公式計算累積釋放百分率：累積釋放百分率（％）＝[V0×Ct+V（C1+C2+C3+……+Ct－1）]/m×100％，其中，m是加入制劑含藥總量，V是每次取樣體積，V0是釋放介質(zhì)的總體積，C1、C2、C3……Ct分別是第1、2、3……t取樣時間點的濃度。試驗均重復(fù)3次。結(jié)果顯示，游離PTX在12 h時的累積釋放率已達到（90.00±2.33）％，而 P-NLC、A-P-NLC 在 48 h 時的累積釋放百分率分別為（43.053.74）％、（35.17±2.08）％；與游離 PTX 比較，P-NLC 和A-P-NLC 均表現(xiàn)出明顯的緩釋作用，且 A-P-NLC 較P-NLC的釋放更緩慢，詳見圖3。
2.5.2 不同PTX樣品的細胞抑制作用 按“2.5.1”項下方法取細胞接種并培養(yǎng)，分為對照組（細胞+培養(yǎng)基）和各藥物組（細胞+游離PTX或P-NLC或A-P-NLC的含藥培養(yǎng)基，所含 PTX 的終質(zhì)量濃度均分別為 0.44、1.10、4.40、11.00、44.00 μg/mL）；另設(shè)不含細胞的空白組（培養(yǎng)基），每組設(shè)置6個孔。劑量均根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置。按照“2.5.1”項下方法培養(yǎng)并測定各孔OD值，并按公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（％）＝（OD 藥 物 組 －OD 空 白 組）/（OD 對照組－OD 空白組）×100％。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗（P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義）；同時，計算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。
2.6.1 S180荷瘤小鼠模型建立 取對數(shù)生長期的S180細胞，以4 ℃生理鹽水漂洗并調(diào)節(jié)細胞濃度至1×107個/mL，按200 μL/只接種于小鼠（雌性10只）的腹腔[14]。4～5 d后可見小鼠腹部凸起、明顯增大，此時取其S180腹水瘤細胞用于傳代[13]。傳至第3代后，抽取腹水瘤模型小鼠的腹水，以 4 ℃生理鹽水漂洗并調(diào)節(jié)細胞濃度至 1×108個/mL，另取小鼠（雌雄各20只），按200 μL/只注射至其腋窩皮下，并觀察其腋窩處實體瘤形成情況。當小鼠腋窩處出現(xiàn)小的突起且觸摸有硬結(jié)感時，即為荷瘤造模成功。
2.6.2 A-P-NLC 的體內(nèi)抗腫瘤作用考察 取“2.6.1”項下造模成功的荷瘤小鼠 32 只，隨機分為對照組、游離PTX組、P-NLC組、A-P-NLC組，每組8只。各組小鼠均尾靜脈給藥100 μL/次，隔天1次，連續(xù)8次。除對照組給予生理鹽水外，各給藥組的給藥劑量均以5 mg/kg PTX計算，劑量根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置。每天觀察小鼠一般狀態(tài)，并測量其體質(zhì)量；以游標卡尺測量腫瘤垂直方向上的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V＝ab2/2）[15]；末次給藥24 h后處死小鼠，剖取腫瘤，稱定瘤質(zhì)量，并按公式計算瘤質(zhì)量抑制率：瘤質(zhì)量抑制率（％）＝（1－給藥組瘤質(zhì) 量/對 照 組 瘤 質(zhì) 量）× 100％ [16]。統(tǒng)計學方法同“2.5.2”項。
各組小鼠瘤體積均隨時間延長而呈增加趨勢；與對照組比較，各給藥組小鼠自給藥3 d時起瘤體積均顯著縮小，P-NLC組和A-P-NLC組小鼠在末次給藥后24 h時瘤質(zhì)量均顯著降低；與游離 PTX 組比較，P-NLC 組和A-P-NLC 組小鼠分別自給藥 7、5 d 時起瘤體積顯著縮小，在末次給藥后24 h時瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高；與P-NLC組比較，A-P-NLC組小鼠自給藥7 d時起瘤體積顯著縮小，在末次給藥后24 h時瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高。以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表2、表3。
3 討論
經(jīng) PEG 修飾的 NLC 可通過“高滲透、長滯留”效應(yīng)被動靶向進入腫瘤組織，即通過腫瘤微血管的空隙滲漏進入腫瘤組織，但進入腫瘤組織的NLC因其表面修飾有PEG 故親水性增強，會使其跨膜進入細胞受到影響；AEYLR 小肽對 EGFR 具有特異的靶向性，可使連接有AEYLR的NLC對EGFR高表達的細胞及腫瘤組織具有主動靶向作用，同時還可通過EGFR受體介導(dǎo)腫瘤細胞對NLC的內(nèi)吞，提高NLC的入胞量[9-10]。
DSPE-PEG2000-AEYLR 是 AEYLR 通過 PEG 末端活化技術(shù)連接在 DSPE-PEG2000 末端的產(chǎn)物。本研究采用熔融乳化-低溫固化法制備 A-P-NLC，在乳化過程中DSPE-PEG2000-AEYLR結(jié)構(gòu)中的親水部分PEG2000-AEYLR存在于乳滴表面，而在低溫固化后AEYLR部分即被修飾到了P-NLC的表面。與P-NLC比較，A-P-NLC在制備過程中加入了 DSPE-PEG2000-AEYLR，增加了NLC表面PEG的量，導(dǎo)致粒徑、粒度分布及Zeta電位絕對值均有所增長，同時空間位阻的增加使其包封率和載藥量略有降低；二者的體外釋放行為相似，均有緩釋效果，但 A-P-NLC 的緩釋效果更為明顯，可能是由于DSPE-PEG2000-AEYLR的加入使P-NLC的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，從而使藥物釋放更緩慢。
本研究選擇 EGFR 高表達的人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299和鼠源S180細胞系[17-18]作為模型細胞，主要考察了 A-P-NLC 對兩種腫瘤細胞的體外抑制效果。結(jié)果顯示，與游離PTX和P-NLC比較，加入了具有主動靶向作用的AEYLR后，A-P-NLC顯示出更強的體外腫瘤細胞抑制效果。而進一步采用S180細胞建立小鼠荷瘤模型并進行體內(nèi)抑瘤作用考察的結(jié)果顯示，與游離PTX組和P-NLC組比較，A-P-NLC組小鼠的瘤體積、瘤質(zhì)量均顯著縮小或降低，瘤質(zhì)量抑制率均顯著升高；另外，游離 PTX 組有 3 只小鼠由于 PTX 的長期毒性而死亡，而P-NLC組與A-P-NLC組小鼠死亡情況減少，且體質(zhì)量較游離PTX組顯著增長，提示PTX制成NLC后可減小藥物的毒副作用，提高用藥安全性。
綜上，A-P-NLC 具有明顯的緩釋作用，其對 NCIH1299 細胞和 S180 細胞的體外抑制作用以及對小鼠S180 實體瘤的抑制作用均優(yōu)于游離 PTX 和 P-NLC，且毒性有所降低。
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