摘 要 目的：制備T7肽修飾的硫酸長春新堿（VCR）-脫鐵鐵蛋白（APO）納米粒，并研究其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外靶向性。方法：采用解離-重組法制備VCR-APO納米粒，以靶頭（T7肽）修飾后制成T7-VCR-APO納米粒。采用質(zhì)譜分析和紫外-可見分光光度法評價靶頭連接效率，并對所制納米粒進(jìn)行形態(tài)、粒徑、Zeta 電位、包封率等進(jìn)行表征。以膠質(zhì)瘤 C6 細(xì)胞為模型，考察T7-VCR-APO納米粒對C6細(xì)胞及腫瘤球的靶向作用，并以低溫條件和4種細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑考察C6細(xì)胞對T7-VCR-APO納米粒的攝取機(jī)制。結(jié)果：經(jīng)質(zhì)譜檢測證明T7肽已連接在納米粒上，連接率為68.39％；所制得的T7-VCR-APO納米粒形態(tài)圓整、均一，粒徑為（31.14±1.26）nm，Zeta電位為（－23.30±0.42）mV，包封率為（39.49±2.84）％。體外靶向性研究顯示，T7-VCR-APO納米�？捎行У乇籆6細(xì)胞及腫瘤球攝取，并可到達(dá)腫瘤球核心位置；C6細(xì)胞對納米粒的攝取是多通路共同作用的結(jié)果，主要是通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞并伴隨巨胞飲途徑。結(jié)論：本研究成功制得T7-VCR-APO納米粒，其能夠?qū)δz質(zhì)瘤C6細(xì)胞實現(xiàn)體外靶向遞送藥物，入胞效率大大提高。
腦膠質(zhì)瘤是最富于血管的人體腫瘤之一，其具有惡性化程度高、生長速度快、患者生存期短等特點(diǎn)[1]。腦膠質(zhì)瘤極易侵入周圍正常組織間隙從而與正常腦組織分界不清，導(dǎo)致手術(shù)幾乎不可能完全切除，如果采用單純的手術(shù)切除反而會刺激腫瘤，加快其增殖速度、加重其惡變程度[2-3]。因此，在腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)后常常需要輔以放療、化療，以延緩腫瘤復(fù)發(fā)、延長患者生存期[4]。然而由于腦膠質(zhì)瘤增長迅速，腫瘤部位因缺氧而對放療不敏感，而化療藥物又大多具有嚴(yán)重的副作用或難以透過血腦屏障（BBB），給術(shù)后治療帶來了許多困難�；诖�，探尋新的、安全有效的治療方法是目前腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，其中藥物治療在腦膠質(zhì)瘤綜合治療策略中具有重要地位。
硫酸長春新堿（VCR）為臨床常用的一線抗癌藥物，但其對BBB的透過率不高、生物利用率較低，長期使用極易引起腫瘤細(xì)胞對藥物的耐受[5]。為了解決以上問題，本課題組選用 VCR 為模型藥物，以脫鐵鐵蛋白（Apoferritin，APO）納米粒為載體包載 VCR，并以 T7 肽對納米粒進(jìn)行修飾，制備T7-VCR-APO納米粒。其中，APO源于人體天然蛋白，相對于其他人工合成的材料具有生物相容性良好、毒性低、半衰期較長等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的納米級藥物載體[6]；T7 肽作為小分子多肽，具有可化學(xué)合成、穩(wěn)定性好、靶頭基團(tuán)空間位阻小等優(yōu)點(diǎn)，與在BBB和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表面均高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）受體親和性強(qiáng)，能夠協(xié)助載藥納米遞釋系統(tǒng)透過BBB并向膠質(zhì)瘤細(xì)胞濃集，直接作用于病灶部位，從而提高藥物的生物利用度和治療效果[7]。同時，本課題組還考察了T7-VCR-APO納米粒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外靶向性，以期為開發(fā)一種能有效治療腦膠質(zhì)瘤的新型藥物遞釋系統(tǒng)提供參考。
1 材料
BT25S 型電子分析天平、PB-10 型 pH 計[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DF-101S型磁力攪拌器（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；Heal Force型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；3K-15型臺式高速冷凍離心機(jī)（美國 Sigma-Aldrich 公司）；UV-1800型紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司）；JEM1230型透射電鏡（日本電子株式會社）；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度儀（英國Malvern公司）；1200型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。
VCR（海南長春花藥業(yè)有限公司，批號：20150902，純度：≥98％）；APO納米粒膠體溶液（北京成志科為生物科技有限公司，批號：A36101）；琥珀酰亞胺酯-聚乙二醇3500-馬來酰亞胺（SCM-PEG3500-MAL，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號：22268p082）；T7肽；5（6）-羥基二乙酸熒光素（CFDA，批號：21877-1G-F）、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，批號：D80002-25G）、N- 羥 基 琥 珀 酰 亞 胺 酯（NHS，批 號 ：130672-5G）均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；熒光染料Cyanine 5.5 NHS ester（cy5.5，廣州市銳博生物科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（賽默飛世爾儀器有限公司，批號：8117149）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：11011-8611）；胰蛋白酶（美國 Amresco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）為本課題組自配，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。
鼠源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6細(xì)胞）、鼠源腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3細(xì)胞）均來源于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。
2 方法
本 課 題 組 先 以 APO 包 載 模 型 藥 物 VCR（即 得VCR-APO納米粒），再采用雙功能基團(tuán)SCM-PEG3500-MAL為連接橋梁，以—MAL基團(tuán)與T7肽中的巰基反應(yīng)生 成 穩(wěn) 定 的 硫 醚 鍵（即 得 功 能 性 化 合 物 SCMPEG3500-T7），然后以—SCM 基團(tuán)與 APO 中的伯胺反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而使T7肽與VCR-APO相連接，即制得 T7-PEG3500-VCR-APO 納米粒（簡稱“T7-VCRAPO納米粒”）。
2.1.1 VCR-APO 納米粒的制備 采用解離-重組法。首先取適量APO納米粒膠體溶液于小燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌（350 r/min，下同）；滴加 0.1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié) pH 至 2.0，攪拌 10 min；然后滴加 1 mg/mL VCR 水溶液0.2 mL，攪拌1 h；再滴加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5左右，攪拌20 min；繼續(xù)滴加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.4，攪拌 10 min。采用透析袋（截留分子量：300 kDa）透析24 h除去游離的VCR，即得包載VCR的APO納米粒膠體溶液（簡稱VCR-APO納米粒）。
2.1.2 功能性化合物的制備 稱取 SCM-PEG3500-MAL適量，以PBS制成溶液；加入T7肽適量，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24 h。透析（截留分子量：3 500Da）24 h除去游離的T7肽，即得SCM-PEG3500-T7。
2.1.3 T7-VCR-APO 納米粒的制備 取“2.1.1”“2.1.2”項下制備的 VCR-APO納米粒與功能性化合物各適量，避光室溫孵育24 h，透析（截留分子量：300 kDa）24 h除去游離的SCM-PEG3500-T7，即得T7-VCR-APO納米粒。
靶向制劑的靶頭連接率的大小很大程度上決定著制劑透過細(xì)胞膜的效率，因此需考察功能性化合物SCM-PEG3500-T7中的靶頭（即T7肽）的連接效率。本課題組采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）質(zhì)譜分析表征靶頭連接情況；同時，考慮到T7肽與APO載體分子量差異較大，故采用超濾離心法和紫外-分光光度法測定靶頭連接率。
2.2.1 靶頭熒光標(biāo)記 精密稱取熒光探針 CFDA 適量溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，依次加入適量的 DCC、NHS，室溫避光攪拌24 h，4 000 r/min離心15 min。取上清液，加入適量的SCM-PEG3500-T7和三乙胺，室溫避光反 應(yīng) 24 h 后 透 析（截 留 分 子 量 ：3 500 Da），即 得SCM-PEG3500-T7-CFDA（即熒光探針標(biāo)記的功能性化合物）。
2.2.2 靶頭連接情況表征 采用MALDI-TOF質(zhì)譜分析進(jìn)行靶頭連接情況表征。將“2.2.1”項下制得的 SCMPEG3500-T7-CFDA送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器分析中心進(jìn)行質(zhì)譜分析，以判斷CFDA標(biāo)記的T7肽靶頭是否與納米粒成功連接。
2.2.3 靶頭連接率測定 （1）建立 CFDA 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取CFDA適量，以PBS制成系列質(zhì)量濃度（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μg/mL）的溶液，采用用紫外-可見分光光度計于493 nm波長處測定吸光度（A）；以A對質(zhì)量濃度（c，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A＝0.195 0c+0.007 1（R2＝0.999 3）。（2）測定熒光探針標(biāo)記的功能性化合物中CFDA 的含量，以間接反映所連接的 T7 肽含量。取“2.2.1”項下制備的SCM-PEG3500-T7-CFDA 適量[需適當(dāng)稀釋一定倍數(shù)（D），以使吸光度符合儀器測定要求]，按“2.2.3（1）”項下方法測得A，代入回歸方程計算，即得T7肽的總含量C 總（以CFDA含量測定結(jié)果作為T7肽的含量）；再采用超濾離心管對樣品溶液進(jìn)行10 000 r/min離心（截留分子量：30 kDa）15 min，收集下層液體，同法測定計算，即得游離T7肽的含量C 游離。（3）按公式計算靶頭連接率[連接率（％）＝（C 總×D 總－C 游離×D 游離）/（C 總×D 總）×100％]。
2.3 T7-VCR-APO納米粒的表征
2.3.1 形態(tài) 取T7-VCR-APO納米粒適量，以水適當(dāng)稀釋后滴加在銅網(wǎng)上，稍等片刻再滴加磷鎢酸染色，于透射電鏡下觀察T7-VCR-APO納米粒的形態(tài)。
2.3.2 粒徑分布 取T7-VCR-APO納米粒適量，滴入已加水的比色皿中，采用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑分布。
2.3.3 Zeta電位 取T7-VCR-APO納米粒適量，以水適當(dāng)稀釋后加入樣品池中，采用馬爾文激光粒度儀測定其Zeta電位。
2.3.4 包封率 由于本研究是在載體APO包載VCR完成后再連接的T7肽，因此不考慮T7肽對藥物包載的影響，采用超濾
離心法測定VCR-APO納米粒包封率。取“2.1.1”項下制備的 VCR-APO 納米粒 1 mL，加入 0.1mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH至2.0，加水定容至2 mL，采用高效液相色譜法檢測[色譜柱：ZORBAX SB-C8（250 mm×4.6mm，5 µm），流動相：甲醇-1.5％二乙胺水溶液（70 ∶ 30，V/V），柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，檢測波長：297 nm，進(jìn)樣量：20 µL]，測得 W 總（即 VCR 加入總量）；另取VCR-APO 納米粒 1 mL，10 000 r/min離心10 min，取下層液體，同法測得W 游離（即游離的VCR量）；計算VCR的包封率[包封率（％）＝（W 總－W 游離）/W 總×100％]。
2.4 T7-VCR-APO 納米粒對腫瘤細(xì)胞的體外靶向性研究
2.4.1 單層 C6 細(xì)胞及 bEnd.3 細(xì)胞攝取實驗 由于bEnd.3細(xì)胞是BBB的主要組成部分，而納米粒到達(dá)腦部病灶的關(guān)鍵是要先透過bEnd.3細(xì)胞從而進(jìn)入BBB，然后才能到達(dá)腦內(nèi)腫瘤細(xì)胞，因此考察了兩種細(xì)胞的攝取行為。（1）C6、bEnd.3 細(xì)胞培養(yǎng)。于 37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，以含10％胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基（簡稱“培養(yǎng)液”）培養(yǎng) C6、bEnd.3 細(xì)胞，每 2 天換 1 次培養(yǎng)液。（2）cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液的制備。取“2.1”項 下 制 備 的 VCR-APO、T7-VCR-APO 溶 液 各 2mL，分別加入 2.5 mg/mL 熒光染料 cy5.5 溶液 0.08 mL（以 DMSO 為溶劑），在磁力攪拌器上避光攪拌反應(yīng) 24h，避光透析（截留分子量：300 kDa）24 h，所得透析液即為熒光標(biāo)記的 cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液。（3）C6、bEnd.3細(xì)胞對不同藥物的攝取行為考察。①將C6、bEnd.3細(xì)胞以1×105個/孔分別接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿中，每皿 2 mL，平行接種 3 個小皿，于 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 24 h，使細(xì)胞貼壁。②待細(xì)胞貼壁后，用PBS漂洗2次，每皿加入培養(yǎng)液1.8 mL，在兩種細(xì)胞的各3個小皿中分別加入游離cy5.5、cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液各 0.2 mL，于 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4 h。③培養(yǎng)完畢后吸棄培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS 漂洗 2 次，加入 4％多聚甲醛固定、二苯甲亞胺（Hoechst 33258）染料進(jìn)行細(xì)胞核染色，以 50％甘油封片，4 ℃避光預(yù)冷。④在激光共聚焦顯微鏡下觀察游離cy5.5、cy5.5-VCR- APO、cy5.5-T7-VCR-APO溶液的細(xì)胞攝取情況。
2.4.2 腫瘤球攝取實驗 細(xì)胞腫瘤球模型與單層細(xì)胞模型相比，能更好地模擬體內(nèi)實體腫瘤生理環(huán)境，因此本課題組采用C6細(xì)胞構(gòu)建腫瘤球模型，以此考察實體腫瘤對T7-VCR-APO納米粒的攝取能力。
將 C6 細(xì)胞以 1×107個/mL 接種于 6 孔板中，置于37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞完全連成片后吸棄培養(yǎng)液，加入少量胰蛋白酶消化細(xì)胞。待細(xì)胞完全脫落后終止消化，小心將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已鋪滿瓊脂的6孔板上，培養(yǎng)3～4 d即成腫瘤球。吸取腫瘤球細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到已鋪滿瓊脂的24孔板上，待腫瘤球沉降后，吸棄上層培養(yǎng)液，使每孔剩余培養(yǎng)液約50 µL，并保證每孔均有大量腫瘤球。每孔加入適量的 cy5.5-T7-VCR-APO 溶液和培養(yǎng)液，在37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4 h，再按照“2.4.1”項下方法將腫瘤球固定、染核、封片，4 ℃避光預(yù)冷后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行自上而下的層切拍照。
2.4.3 細(xì)胞攝取機(jī)制考察 考慮到腫瘤細(xì)胞對納米粒的攝取可能是通過細(xì)胞內(nèi)吞作用實現(xiàn)的，而細(xì)胞內(nèi)吞具有能量依賴性特點(diǎn)，在較低的溫度條件下會受到抑制[8]，因此本課題組分別考察了在低溫條件和內(nèi)吞抑制劑作用下腫瘤細(xì)胞對納米粒的攝取效果，以期闡明納米粒對腫瘤細(xì)胞的體外靶向機(jī)制。（1）將C6細(xì)胞以1×105個/孔接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿中，在37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 24 h，使細(xì)胞貼壁，分為兩組。（2）一組培養(yǎng)小皿用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（簡稱“無血清培養(yǎng)液”）換液培養(yǎng)，于 4 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 30 min；加4 ℃預(yù)冷的 PBS漂洗2次，再加入 4 ℃預(yù)冷的以無血清培養(yǎng)液稀釋的cy5.5-T7-VCR-APO溶液 2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以此考察低溫對細(xì)胞攝取納米粒效果的影響。（3）另一組培養(yǎng)小皿用PBS漂洗2次，分別加入含有4種內(nèi)吞抑制劑的無血清培養(yǎng)液（20 µmol/L 鹽酸氯丙嗪、100µmol/L 磷酸氯喹、25 µmol/L 制霉菌素、50 µmol/L 阿米洛利）適量，在 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 30 min；加入cy5.5-T7-VCR-APO 溶液 200 µL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，以此考察內(nèi)吞抑制劑對細(xì)胞攝取納米粒效果的影響。（4）培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄小皿培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，加入0.25％胰蛋白酶（含1 mmol/L乙二胺四乙酸）消化并吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗3次并重懸細(xì)胞；細(xì)胞懸液過300目細(xì)胞篩，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
3 結(jié)果
3.1.2 靶頭連接率測定結(jié)果 由紫外-可見分光光度法測得A 總、A 游離分別為0.797、0.632，代入回歸方程計算得C 總、C 游離分別為4.05、3.20 μg/mL。由于測定C 總、C 游離時分別將樣品稀釋了10、4倍，因此按公式計算得靶頭連接率為68.39％。
3.2.2 粒徑 經(jīng)檢測，T7-VCR-APO 納米粒的粒徑為（31.14±1.26）nm。
3.2.3 Zeta 電位 經(jīng)檢測，T7-VCR-APO 納米粒的 Zeta電位為（－23.30±0.42）mV。所測得電位的絕對值越大則體系越穩(wěn)定，納米粒子電位絕對值大于15 mV即可達(dá)到穩(wěn)定性要求[9]。以上結(jié)果表明所制得的納米粒體系較穩(wěn)定。
3.2.4 包封率 經(jīng)檢測，VCR-APO 納米粒的包封率為（39.49±2.84）％。
3.3 T7-VCR-APO 納米粒對 C6 細(xì)胞及 bEnd.3 細(xì)胞的體外靶向性研究結(jié)果
4 討論
APO具有獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)和解離重組性質(zhì)，它作為一個生物尺寸可控的生物載體已被廣泛地應(yīng)用于納米載體新劑型的開發(fā)領(lǐng)域[11]。而將藥物包裹在納米籠中也有兩種方法：一種是解離-重組法，其原理是APO在不同pH條件下發(fā)生解離-重組時，能將藥物包裹在其中；另一種是擴(kuò)散法，其原理是利用APO的通道性[12]。本課題組采用解離-重組法制備VCR-APO納米粒。
BBB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表面均高表達(dá) Tf 受體，以往研究常采用Tf對納米載藥系統(tǒng)進(jìn)行修飾，但機(jī)體內(nèi)源性的 Tf 濃度高，會競爭性抑制 Tf 修飾的載藥系統(tǒng)的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。T7 肽對 Tf 受體的親和性與 Tf 相當(dāng)，能實現(xiàn)對BBB 與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的雙級靶向傳遞作用，但其在 Tf受體上的結(jié)合位點(diǎn)與 Tf 不同，因此不會受到內(nèi)源性 Tf的競爭性抑制，相反內(nèi)源性 Tf 與 Tf 受體的結(jié)合還會提高T7肽的入胞效率[10]。為提高納米粒對腫瘤的靶向性，本課題組將T7肽修飾在了APO納米粒載體表面。經(jīng)制劑相關(guān)表征顯示，所得納米粒各項指標(biāo)均符合設(shè)計要求，且制備方法方便易行；靶頭連接效率評價結(jié)果顯示，T7肽成功連接到載體表面，連接率達(dá)到68.39％，能滿足靶向制劑的要求。
對納米載體給藥系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞穿透性能評價最有效的方法是體外細(xì)胞吞噬實驗[7]。本課題組采用在膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的C6細(xì)胞為模型，進(jìn)行單層腫瘤細(xì)胞和腫瘤球的攝取行為考察，結(jié)果顯示經(jīng)靶頭修飾制得的T7-VCR-APO納米粒較之于未經(jīng)修飾的納米粒，能更有效地穿透C6細(xì)胞及腫瘤球，并且可以到達(dá)腫瘤球的核心處，入胞效率大大提高。同時，本課題組采用低溫條件和鹽酸氯丙嗪、磷酸氯喹、制霉菌素、阿米洛利等4種細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑（分別對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、內(nèi)涵體酸化、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲途徑起作用[10]）考察納米粒穿透 C6 細(xì)胞的機(jī)制。結(jié)果證明，T7-VCR-APO納米粒對C6細(xì)胞的穿透作用是通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用實現(xiàn)的，而且是多個通路共同作用的結(jié)果，主要是通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞并伴隨巨胞飲途徑。
綜上所述，納米粒連接 T7 肽后其穿透膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向效果明顯增強(qiáng)，因此T7肽修飾的APO納米粒靶向給藥系統(tǒng)是一個很有潛力的抗腫瘤藥物載體，其能通過與在 BBB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面均高表達(dá)的 Tf 受體結(jié)合，實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的腦腫瘤靶向作用。本研究證實了T7肽作為靶向配體用于抗腦膠質(zhì)瘤治療藥物研發(fā)的意義，并為今后相關(guān)新型制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)，期望能為腦膠質(zhì)瘤的臨床藥物治療提供新的選擇。
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