摘 要 目的：制備T7肽修飾的硫酸長春新堿（VCR）-脫鐵鐵蛋白（APO）納米粒，并研究其對膠質(zhì)瘤細胞的體外靶向性。方法：采用解離-重組法制備VCR-APO納米粒，以靶頭（T7肽）修飾后制成T7-VCR-APO納米粒。采用質(zhì)譜分析和紫外-可見分光光度法評價靶頭連接效率，并對所制納米粒進行形態(tài)、粒徑、Zeta 電位、包封率等進行表征。以膠質(zhì)瘤 C6 細胞為模型，考察T7-VCR-APO納米粒對C6細胞及腫瘤球的靶向作用，并以低溫條件和4種細胞內(nèi)吞抑制劑考察C6細胞對T7-VCR-APO納米粒的攝取機制。結(jié)果：經(jīng)質(zhì)譜檢測證明T7肽已連接在納米粒上，連接率為68.39％；所制得的T7-VCR-APO納米粒形態(tài)圓整、均一，粒徑為（31.14±1.26）nm，Zeta電位為（－23.30±0.42）mV，包封率為（39.49±2.84）％。體外靶向性研究顯示，T7-VCR-APO納米�？捎行У乇籆6細胞及腫瘤球攝取，并可到達腫瘤球核心位置；C6細胞對納米粒的攝取是多通路共同作用的結(jié)果，主要是通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞并伴隨巨胞飲途徑。結(jié)論：本研究成功制得T7-VCR-APO納米粒，其能夠?qū)δz質(zhì)瘤C6細胞實現(xiàn)體外靶向遞送藥物，入胞效率大大提高。
腦膠質(zhì)瘤是最富于血管的人體腫瘤之一，其具有惡性化程度高、生長速度快、患者生存期短等特點[1]。腦膠質(zhì)瘤極易侵入周圍正常組織間隙從而與正常腦組織分界不清，導(dǎo)致手術(shù)幾乎不可能完全切除，如果采用單純的手術(shù)切除反而會刺激腫瘤，加快其增殖速度、加重其惡變程度[2-3]。因此，在腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)后常常需要輔以放療、化療，以延緩腫瘤復(fù)發(fā)、延長患者生存期[4]。然而由于腦膠質(zhì)瘤增長迅速，腫瘤部位因缺氧而對放療不敏感，而化療藥物又大多具有嚴重的副作用或難以透過血腦屏障（BBB），給術(shù)后治療帶來了許多困難。基于此，探尋新的、安全有效的治療方法是目前腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域的研究重點，其中藥物治療在腦膠質(zhì)瘤綜合治療策略中具有重要地位。
硫酸長春新堿（VCR）為臨床常用的一線抗癌藥物，但其對BBB的透過率不高、生物利用率較低，長期使用極易引起腫瘤細胞對藥物的耐受[5]。為了解決以上問題，本課題組選用 VCR 為模型藥物，以脫鐵鐵蛋白（Apoferritin，APO）納米粒為載體包載 VCR，并以 T7 肽對納米粒進行修飾，制備T7-VCR-APO納米粒。其中，APO源于人體天然蛋白，相對于其他人工合成的材料具有生物相容性良好、毒性低、半衰期較長等優(yōu)點，是優(yōu)良的納米級藥物載體[6]；T7 肽作為小分子多肽，具有可化學(xué)合成、穩(wěn)定性好、靶頭基團空間位阻小等優(yōu)點，與在BBB和膠質(zhì)瘤細胞的表面均高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）受體親和性強，能夠協(xié)助載藥納米遞釋系統(tǒng)透過BBB并向膠質(zhì)瘤細胞濃集，直接作用于病灶部位，從而提高藥物的生物利用度和治療效果[7]。同時，本課題組還考察了T7-VCR-APO納米粒對膠質(zhì)瘤細胞的體外靶向性，以期為開發(fā)一種能有效治療腦膠質(zhì)瘤的新型藥物遞釋系統(tǒng)提供參考。
1 材料
BT25S 型電子分析天平、PB-10 型 pH 計[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DF-101S型磁力攪拌器（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；Heal Force型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；3K-15型臺式高速冷凍離心機（美國 Sigma-Aldrich 公司）；UV-1800型紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司）；JEM1230型透射電鏡（日本電子株式會社）；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度儀（英國Malvern公司）；1200型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。
VCR（海南長春花藥業(yè)有限公司，批號：20150902，純度：≥98％）；APO納米粒膠體溶液（北京成志科為生物科技有限公司，批號：A36101）；琥珀酰亞胺酯-聚乙二醇3500-馬來酰亞胺（SCM-PEG3500-MAL，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號：22268p082）；T7肽；5（6）-羥基二乙酸熒光素（CFDA，批號：21877-1G-F）、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，批號：D80002-25G）、N- 羥 基 琥 珀 酰 亞 胺 酯（NHS，批 號 ：130672-5G）均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；熒光染料Cyanine 5.5 NHS ester（cy5.5，廣州市銳博生物科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（賽默飛世爾儀器有限公司，批號：8117149）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：11011-8611）；胰蛋白酶（美國 Amresco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）為本課題組自配，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。
鼠源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（C6細胞）、鼠源腦微血管內(nèi)皮細胞（bEnd.3細胞）均來源于北京協(xié)和細胞資源中心。
2 方法
本 課 題 組 先 以 APO 包 載 模 型 藥 物 VCR（即 得VCR-APO納米粒），再采用雙功能基團SCM-PEG3500-MAL為連接橋梁，以—MAL基團與T7肽中的巰基反應(yīng)生 成 穩(wěn) 定 的 硫 醚 鍵（即 得 功 能 性 化 合 物 SCMPEG3500-T7），然后以—SCM 基團與 APO 中的伯胺反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而使T7肽與VCR-APO相連接，即制得 T7-PEG3500-VCR-APO 納米粒（簡稱“T7-VCRAPO納米粒”）。
2.1.1 VCR-APO 納米粒的制備 采用解離-重組法。首先取適量APO納米粒膠體溶液于小燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌（350 r/min，下同）；滴加 0.1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié) pH 至 2.0，攪拌 10 min；然后滴加 1 mg/mL VCR 水溶液0.2 mL，攪拌1 h；再滴加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5左右，攪拌20 min；繼續(xù)滴加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.4，攪拌 10 min。采用透析袋（截留分子量：300 kDa）透析24 h除去游離的VCR，即得包載VCR的APO納米粒膠體溶液（簡稱VCR-APO納米粒）。
2.1.2 功能性化合物的制備 稱取 SCM-PEG3500-MAL適量，以PBS制成溶液；加入T7肽適量，室溫下于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24 h。透析（截留分子量：3 500Da）24 h除去游離的T7肽，即得SCM-PEG3500-T7。
2.1.3 T7-VCR-APO 納米粒的制備 取“2.1.1”“2.1.2”項下制備的 VCR-APO納米粒與功能性化合物各適量，避光室溫孵育24 h，透析（截留分子量：300 kDa）24 h除去游離的SCM-PEG3500-T7，即得T7-VCR-APO納米粒。
靶向制劑的靶頭連接率的大小很大程度上決定著制劑透過細胞膜的效率，因此需考察功能性化合物SCM-PEG3500-T7中的靶頭（即T7肽）的連接效率。本課題組采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）質(zhì)譜分析表征靶頭連接情況；同時，考慮到T7肽與APO載體分子量差異較大，故采用超濾離心法和紫外-分光光度法測定靶頭連接率。
2.2.1 靶頭熒光標(biāo)記 精密稱取熒光探針 CFDA 適量溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，依次加入適量的 DCC、NHS，室溫避光攪拌24 h，4 000 r/min離心15 min。取上清液，加入適量的SCM-PEG3500-T7和三乙胺，室溫避光反 應(yīng) 24 h 后 透 析（截 留 分 子 量 ：3 500 Da），即 得SCM-PEG3500-T7-CFDA（即熒光探針標(biāo)記的功能性化合物）。
2.2.2 靶頭連接情況表征 采用MALDI-TOF質(zhì)譜分析進行靶頭連接情況表征。將“2.2.1”項下制得的 SCMPEG3500-T7-CFDA送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器分析中心進行質(zhì)譜分析，以判斷CFDA標(biāo)記的T7肽靶頭是否與納米粒成功連接。
2.2.3 靶頭連接率測定 （1）建立 CFDA 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取CFDA適量，以PBS制成系列質(zhì)量濃度（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μg/mL）的溶液，采用用紫外-可見分光光度計于493 nm波長處測定吸光度（A）；以A對質(zhì)量濃度（c，μg/mL）進行線性回歸，得回歸方程 A＝0.195 0c+0.007 1（R2＝0.999 3）。（2）測定熒光探針標(biāo)記的功能性化合物中CFDA 的含量，以間接反映所連接的 T7 肽含量。取“2.2.1”項下制備的SCM-PEG3500-T7-CFDA 適量[需適當(dāng)稀釋一定倍數(shù)（D），以使吸光度符合儀器測定要求]，按“2.2.3（1）”項下方法測得A，代入回歸方程計算，即得T7肽的總含量C 總（以CFDA含量測定結(jié)果作為T7肽的含量）；再采用超濾離心管對樣品溶液進行10 000 r/min離心（截留分子量：30 kDa）15 min，收集下層液體，同法測定計算，即得游離T7肽的含量C 游離。（3）按公式計算靶頭連接率[連接率（％）＝（C 總×D 總－C 游離×D 游離）/（C 總×D 總）×100％]。
2.3 T7-VCR-APO納米粒的表征
2.3.1 形態(tài) 取T7-VCR-APO納米粒適量，以水適當(dāng)稀釋后滴加在銅網(wǎng)上，稍等片刻再滴加磷鎢酸染色，于透射電鏡下觀察T7-VCR-APO納米粒的形態(tài)。
2.3.2 粒徑分布 取T7-VCR-APO納米粒適量，滴入已加水的比色皿中，采用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑分布。
2.3.3 Zeta電位 取T7-VCR-APO納米粒適量，以水適當(dāng)稀釋后加入樣品池中，采用馬爾文激光粒度儀測定其Zeta電位。
2.3.4 包封率 由于本研究是在載體APO包載VCR完成后再連接的T7肽，因此不考慮T7肽對藥物包載的影響，采用超濾
離心法測定VCR-APO納米粒包封率。取“2.1.1”項下制備的 VCR-APO 納米粒 1 mL，加入 0.1mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH至2.0，加水定容至2 mL，采用高效液相色譜法檢測[色譜柱：ZORBAX SB-C8（250 mm×4.6mm，5 µm），流動相：甲醇-1.5％二乙胺水溶液（70 ∶ 30，V/V），柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，檢測波長：297 nm，進樣量：20 µL]，測得 W 總（即 VCR 加入總量）；另取VCR-APO 納米粒 1 mL，10 000 r/min離心10 min，取下層液體，同法測得W 游離（即游離的VCR量）；計算VCR的包封率[包封率（％）＝（W 總－W 游離）/W 總×100％]。
2.4 T7-VCR-APO 納米粒對腫瘤細胞的體外靶向性研究
2.4.1 單層 C6 細胞及 bEnd.3 細胞攝取實驗 由于bEnd.3細胞是BBB的主要組成部分，而納米粒到達腦部病灶的關(guān)鍵是要先透過bEnd.3細胞從而進入BBB，然后才能到達腦內(nèi)腫瘤細胞，因此考察了兩種細胞的攝取行為。（1）C6、bEnd.3 細胞培養(yǎng)。于 37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，以含10％胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基（簡稱“培養(yǎng)液”）培養(yǎng) C6、bEnd.3 細胞，每 2 天換 1 次培養(yǎng)液。（2）cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液的制備。取“2.1”項 下 制 備 的 VCR-APO、T7-VCR-APO 溶 液 各 2mL，分別加入 2.5 mg/mL 熒光染料 cy5.5 溶液 0.08 mL（以 DMSO 為溶劑），在磁力攪拌器上避光攪拌反應(yīng) 24h，避光透析（截留分子量：300 kDa）24 h，所得透析液即為熒光標(biāo)記的 cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液。（3）C6、bEnd.3細胞對不同藥物的攝取行為考察。①將C6、bEnd.3細胞以1×105個/孔分別接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿中，每皿 2 mL，平行接種 3 個小皿，于 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 24 h，使細胞貼壁。②待細胞貼壁后，用PBS漂洗2次，每皿加入培養(yǎng)液1.8 mL，在兩種細胞的各3個小皿中分別加入游離cy5.5、cy5.5-VCR-APO、cy5.5-T7-VCR-APO 溶液各 0.2 mL，于 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4 h。③培養(yǎng)完畢后吸棄培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS 漂洗 2 次，加入 4％多聚甲醛固定、二苯甲亞胺（Hoechst 33258）染料進行細胞核染色，以 50％甘油封片，4 ℃避光預(yù)冷。④在激光共聚焦顯微鏡下觀察游離cy5.5、cy5.5-VCR- APO、cy5.5-T7-VCR-APO溶液的細胞攝取情況。
2.4.2 腫瘤球攝取實驗 細胞腫瘤球模型與單層細胞模型相比，能更好地模擬體內(nèi)實體腫瘤生理環(huán)境，因此本課題組采用C6細胞構(gòu)建腫瘤球模型，以此考察實體腫瘤對T7-VCR-APO納米粒的攝取能力。
將 C6 細胞以 1×107個/mL 接種于 6 孔板中，置于37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，待細胞完全連成片后吸棄培養(yǎng)液，加入少量胰蛋白酶消化細胞。待細胞完全脫落后終止消化，小心將細胞轉(zhuǎn)移到已鋪滿瓊脂的6孔板上，培養(yǎng)3～4 d即成腫瘤球。吸取腫瘤球細胞團轉(zhuǎn)移到已鋪滿瓊脂的24孔板上，待腫瘤球沉降后，吸棄上層培養(yǎng)液，使每孔剩余培養(yǎng)液約50 µL，并保證每孔均有大量腫瘤球。每孔加入適量的 cy5.5-T7-VCR-APO 溶液和培養(yǎng)液，在37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4 h，再按照“2.4.1”項下方法將腫瘤球固定、染核、封片，4 ℃避光預(yù)冷后在激光共聚焦顯微鏡下進行自上而下的層切拍照。
2.4.3 細胞攝取機制考察 考慮到腫瘤細胞對納米粒的攝取可能是通過細胞內(nèi)吞作用實現(xiàn)的，而細胞內(nèi)吞具有能量依賴性特點，在較低的溫度條件下會受到抑制[8]，因此本課題組分別考察了在低溫條件和內(nèi)吞抑制劑作用下腫瘤細胞對納米粒的攝取效果，以期闡明納米粒對腫瘤細胞的體外靶向機制。（1）將C6細胞以1×105個/孔接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿中，在37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 24 h，使細胞貼壁，分為兩組。（2）一組培養(yǎng)小皿用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（簡稱“無血清培養(yǎng)液”）換液培養(yǎng)，于 4 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 30 min；加4 ℃預(yù)冷的 PBS漂洗2次，再加入 4 ℃預(yù)冷的以無血清培養(yǎng)液稀釋的cy5.5-T7-VCR-APO溶液 2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以此考察低溫對細胞攝取納米粒效果的影響。（3）另一組培養(yǎng)小皿用PBS漂洗2次，分別加入含有4種內(nèi)吞抑制劑的無血清培養(yǎng)液（20 µmol/L 鹽酸氯丙嗪、100µmol/L 磷酸氯喹、25 µmol/L 制霉菌素、50 µmol/L 阿米洛利）適量，在 37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng) 30 min；加入cy5.5-T7-VCR-APO 溶液 200 µL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，以此考察內(nèi)吞抑制劑對細胞攝取納米粒效果的影響。（4）培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄小皿培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，加入0.25％胰蛋白酶（含1 mmol/L乙二胺四乙酸）消化并吹打成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗3次并重懸細胞；細胞懸液過300目細胞篩，采用流式細胞儀進行檢測。
3 結(jié)果
3.1.2 靶頭連接率測定結(jié)果 由紫外-可見分光光度法測得A 總、A 游離分別為0.797、0.632，代入回歸方程計算得C 總、C 游離分別為4.05、3.20 μg/mL。由于測定C 總、C 游離時分別將樣品稀釋了10、4倍，因此按公式計算得靶頭連接率為68.39％。
3.2.2 粒徑 經(jīng)檢測，T7-VCR-APO 納米粒的粒徑為（31.14±1.26）nm。
3.2.3 Zeta 電位 經(jīng)檢測，T7-VCR-APO 納米粒的 Zeta電位為（－23.30±0.42）mV。所測得電位的絕對值越大則體系越穩(wěn)定，納米粒子電位絕對值大于15 mV即可達到穩(wěn)定性要求[9]。以上結(jié)果表明所制得的納米粒體系較穩(wěn)定。
3.2.4 包封率 經(jīng)檢測，VCR-APO 納米粒的包封率為（39.49±2.84）％。
3.3 T7-VCR-APO 納米粒對 C6 細胞及 bEnd.3 細胞的體外靶向性研究結(jié)果
4 討論
APO具有獨特的空腔結(jié)構(gòu)和解離重組性質(zhì)，它作為一個生物尺寸可控的生物載體已被廣泛地應(yīng)用于納米載體新劑型的開發(fā)領(lǐng)域[11]。而將藥物包裹在納米籠中也有兩種方法：一種是解離-重組法，其原理是APO在不同pH條件下發(fā)生解離-重組時，能將藥物包裹在其中；另一種是擴散法，其原理是利用APO的通道性[12]。本課題組采用解離-重組法制備VCR-APO納米粒。
BBB 和膠質(zhì)瘤細胞的表面均高表達 Tf 受體，以往研究常采用Tf對納米載藥系統(tǒng)進行修飾，但機體內(nèi)源性的 Tf 濃度高，會競爭性抑制 Tf 修飾的載藥系統(tǒng)的靶向轉(zhuǎn)運[6]。T7 肽對 Tf 受體的親和性與 Tf 相當(dāng)，能實現(xiàn)對BBB 與腦膠質(zhì)瘤細胞的雙級靶向傳遞作用，但其在 Tf受體上的結(jié)合位點與 Tf 不同，因此不會受到內(nèi)源性 Tf的競爭性抑制，相反內(nèi)源性 Tf 與 Tf 受體的結(jié)合還會提高T7肽的入胞效率[10]。為提高納米粒對腫瘤的靶向性，本課題組將T7肽修飾在了APO納米粒載體表面。經(jīng)制劑相關(guān)表征顯示，所得納米粒各項指標(biāo)均符合設(shè)計要求，且制備方法方便易行；靶頭連接效率評價結(jié)果顯示，T7肽成功連接到載體表面，連接率達到68.39％，能滿足靶向制劑的要求。
對納米載體給藥系統(tǒng)進行細胞穿透性能評價最有效的方法是體外細胞吞噬實驗[7]。本課題組采用在膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的C6細胞為模型，進行單層腫瘤細胞和腫瘤球的攝取行為考察，結(jié)果顯示經(jīng)靶頭修飾制得的T7-VCR-APO納米粒較之于未經(jīng)修飾的納米粒，能更有效地穿透C6細胞及腫瘤球，并且可以到達腫瘤球的核心處，入胞效率大大提高。同時，本課題組采用低溫條件和鹽酸氯丙嗪、磷酸氯喹、制霉菌素、阿米洛利等4種細胞內(nèi)吞抑制劑（分別對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、內(nèi)涵體酸化、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲途徑起作用[10]）考察納米粒穿透 C6 細胞的機制。結(jié)果證明，T7-VCR-APO納米粒對C6細胞的穿透作用是通過細胞的內(nèi)吞作用實現(xiàn)的，而且是多個通路共同作用的結(jié)果，主要是通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞并伴隨巨胞飲途徑。
綜上所述，納米粒連接 T7 肽后其穿透膠質(zhì)瘤細胞的靶向效果明顯增強，因此T7肽修飾的APO納米粒靶向給藥系統(tǒng)是一個很有潛力的抗腫瘤藥物載體，其能通過與在 BBB 和膠質(zhì)瘤細胞表面均高表達的 Tf 受體結(jié)合，實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的腦腫瘤靶向作用。本研究證實了T7肽作為靶向配體用于抗腦膠質(zhì)瘤治療藥物研發(fā)的意義，并為今后相關(guān)新型制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)，期望能為腦膠質(zhì)瘤的臨床藥物治療提供新的選擇。
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