摘要：穿膜肽是一類具有特殊穿膜功能的多肽分子 ,能攜帶其它分子甚至超分子顆粒穿膜進入細(xì)胞內(nèi)部. 早期研究認(rèn)為 ,其進胞是一種無需受體、也不存在飽和狀態(tài)的非經(jīng)典胞吞行為. 近年研究表明 ,其穿膜機制可能與其含有的氨基酸種類有很大關(guān)系. 現(xiàn)在 ,穿膜肽的穿膜過程稱為巨型胞飲行為 ,它與傳統(tǒng)的胞吞形式很相似. 當(dāng)然 ,還可能存在著其它的進胞方式而沒有被證明或發(fā)現(xiàn). 關(guān)于穿膜肽的應(yīng)用也是人們最感興趣的 ,在很多領(lǐng)域的研究都在進行并不斷取得進展. 不論是生物界還是醫(yī)學(xué)界 ,穿膜肽都被認(rèn)為將是一類非常有發(fā)展?jié)摿Φ亩嚯姆肿印?/span>
Green等[3 ,4 ] 首先發(fā)現(xiàn)并證實人免疫缺陷病毒(HIV21) 的反式激活蛋白 TAT具有跨膜轉(zhuǎn)移的功能.后經(jīng)實驗證明 ,真正起跨膜轉(zhuǎn)運作用的其實是 TAT的一段被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (PTD) 的特殊氨基酸序列(49～57 位氨基酸) . 在此之后 ,很多具跨膜功能的多肽分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn). 現(xiàn)在 ,對穿膜肽的研究是生物科學(xué)和臨床醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域的熱點 ,關(guān)于它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、穿膜機制及可能存在的細(xì)胞毒性等方面都展開了細(xì)致而深入的實驗研究 ,從而使我們對其了解越來越全面.
1 穿膜肽的特點及分類
2 穿膜肽的內(nèi)化機制
堿性氨基酸的存在被認(rèn)為是穿膜肽的一個標(biāo)志. 通常大量電荷的存在排除了穿膜肽通過被動運輸通過脂雙層的可能. 當(dāng)用其它的氨基酸殘基代替精氨酸時對穿膜肽的能力影響較大. 如利用被丙氨酸取代的多肽 retro2pVEC ,D2pVEC 和 pVEC 進行比較研究時 ,發(fā)現(xiàn) N 端第 5 位疏水性氨基酸被丙氨酸取代時其易位能力下降明顯 ,當(dāng) Arg6 ,Arg8 或 Ser17被丙氨酸取代時 ,其被細(xì)胞攝入能力增強[7 ].
Geisler 等[8 ]比較了不同長度的具 Ⅱ型多聚脯氨酸螺旋骨架的兩親穿膜肽進胞能力 ,發(fā)現(xiàn)長序列的P14LRR比較短的 P11LRR 進入 MCF27 細(xì)胞的能力高 7～12 倍 ,比 TAT 高 35 倍. 利用熒光技術(shù)及 CD(circular dichroism) 光譜學(xué)技術(shù) ,研究 2 種穿膜肽transportan 和 pAntp 及其突變體與不同電荷密度磷脂囊泡的相互作用實驗表明 ,pAntp 及其突變體引起的膜混亂程度與他們的二級結(jié)構(gòu)有關(guān). 在螺旋狀態(tài) ,多肽對膜干擾很小. 當(dāng) pAntp 及其突變體變?yōu)棣陆Y(jié)構(gòu)時 ,引起膜混亂. 定向 CD 表明 ,當(dāng) transportan 和pAntp 為螺旋狀態(tài)時 , 只存在于囊泡膜表面 , 但pAntp 的兩種突變體能進入膜內(nèi)[9 ]. 通過研究 3 種主要的兩親性穿膜肽 Pβ,Pα和 Pep21 形成孔道的能力 ,也證明孔道的形成與多肽結(jié)構(gòu)特征有很好的相關(guān)性 ,特別是它們的構(gòu)象變化[10 ].
此外 ,負(fù)載物的大小和類型也會影響穿膜肽的穿膜能力. 一般情況下 ,小分子的負(fù)載物不影響內(nèi)化(internalization) 的效率 ,但大分子負(fù)載物時 ,內(nèi)化效率明顯降低[6 ]. 對 Pep21 運輸能力的研究發(fā)現(xiàn) ,顆粒狀負(fù)載物的顆粒大小和均勻性都直接依賴于 Pep21Π負(fù)載物組成比率 ,并與生物效率直接相關(guān)[11 ]. 因此 ,不同的穿膜肽在攜帶不同分子時采取的進胞方式可能有差異 ,同時其進胞時間也會不同.
早期觀察發(fā)現(xiàn) ,穿膜肽的內(nèi)化過程可在 4 ℃的低溫環(huán)境下發(fā)生 ,而且無飽和狀態(tài). 因此認(rèn)為 ,該過程并非經(jīng)典的胞吞作用 (endocytosis) ,也不需受體蛋白的介導(dǎo)[12～14 ]. 但是最近的研究結(jié)果表明 ,胞吞作用在內(nèi)化過程中可能占有重要地位.
Nakase 等[15 ] 通過對 TAT 和其它富含精氨酸多肽的研究認(rèn)為 ,早期使用細(xì)胞固定化技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)及流式細(xì)胞計量技術(shù)等進行實驗時 ,含有精氨酸多肽的內(nèi)涵體膜經(jīng)固定化過程會變得非常脆弱 ,極易破裂和泄露 ,從而使穿膜肽彌散分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核處. 正是這些假象的出現(xiàn)使人們認(rèn)為 ,穿膜肽穿膜不是經(jīng)典的胞吞途徑. 實際上 ,這些多肽帶有大量陽離子并被膜強烈吸引 ,很難從高親和力的細(xì)胞表面完全離開. 在低溫下 ,用富含精氨酸多肽處理細(xì)胞時 ,并沒有內(nèi)吞作用出現(xiàn) ,但由于固定操作而輕微紊亂的質(zhì)膜會使細(xì)胞表面吸附的多肽逃脫進入胞質(zhì) ,從而出現(xiàn)了多肽內(nèi)化進入胞質(zhì)和核的假象. 利用完整的活細(xì)胞進行重新研究表明 ,在特定的情況下 ,內(nèi)吞途徑是這些多肽內(nèi)化的主要途徑. 定位于細(xì)胞膜的蛋白聚糖 ,包括硫酸乙酰肝素 ,被認(rèn)為在內(nèi)吞過程中起重要作用 ,這一特殊內(nèi)吞過程被稱為巨型胞飲(macropinocytosis) . 這個過程起始于細(xì)胞激活和質(zhì)膜的邊緣波動 ,從而吞噬大量的胞外液進入巨型胞飲泡. 在完整活細(xì)胞中 ,不進行固定化處理時 ,仍有少部分多肽進入胞質(zhì)和核周圍 ,說明可能還有一些其它的內(nèi)化機制存在.
TAT和其它蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域以巨型胞飲途徑實現(xiàn)轉(zhuǎn)運的模型是一個多階段過程 ,包括 TAT 與細(xì)胞表面結(jié)合、刺激巨型胞飲泡攝入 TAT 及其負(fù)載物、內(nèi)涵體脫離進入細(xì)胞質(zhì)中等一系列事件. 第一步中 TAT結(jié)合到細(xì)胞表面是通過細(xì)胞表面普遍存在的聚糖鏈完成的. TAT刺激巨型胞飲泡的出現(xiàn)其機制尚不知道 ,可能與細(xì)胞表面蛋白的結(jié)合有關(guān) ,也可能通過蛋白聚糖或糖脂來實現(xiàn). 通過巨型胞飲泡的攝入 ,所有的細(xì)胞都形成液態(tài)內(nèi)吞形式 ,這對于 TAT 和多聚精氨酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的. 最后一步是從巨型胞飲泡逃脫進入細(xì)胞質(zhì) ,這個過程可能依賴內(nèi)涵體中 pH 的下降 ,伴隨其它因素使內(nèi)涵體膜發(fā)生輕微紊亂 ,從而釋放 TAT及其負(fù)載物[16 ].
熱力學(xué)研究顯示 ,非兩親的和中等兩親的穿膜肽與氨基葡聚糖( GAGs) 具高親和力 ,但與真核細(xì)胞的親和力很低. 因此 ,穿膜肽應(yīng)該能與胞膜成分 ,如陰離子脂類和 GAGs 等通過靜電結(jié)合 ,在低微摩爾濃度下以直接透膜的次要途徑進胞. 這也支持了體內(nèi)實驗研究所揭示的穿膜肽低微摩爾濃度時胞吞作用是主要的攝取途徑[17 ]. 當(dāng)穿膜肽濃度達(dá) 100μmolL 以上的高濃度時 ,生物膜帶有較多的陰離子成分,在低溫時直接易位會比較明顯.
穿膜肽的進胞途徑可能有多種 ,至少包括直接易位和內(nèi)吞作用. 至于哪種機制更有效 ,易位出現(xiàn)有多快依賴于實際情況 ,如穿膜肽類型、濃度、溫度、細(xì)胞能量水平、負(fù)載的存在 ,胞膜中脂類組成等. 其中一個例子就是利用單層囊泡和鈣黃綠素?zé)晒饣鶊F研究穿膜肽 Tp10 及其突變體時發(fā)現(xiàn) ,內(nèi)化機制與是否有大的負(fù)載物有一定關(guān)系. 在缺乏大的親水性負(fù)載物時 ,多肽誘導(dǎo)膜紊亂使肽直接易位進入胞內(nèi) ;當(dāng)帶有大的親水性負(fù)載物時膜紊亂程度較低 ,內(nèi)吞作用似乎是唯一的易位機制[12 ].
3 穿膜肽對細(xì)胞的影響
要將穿膜肽用于臨床藥物的運輸工具 ,首先必須確認(rèn)肽本身不會對正常細(xì)胞造成不利影響 ,在這方面已進行了一些研究 ,但大多是體外實驗 ,體內(nèi)研究較少. 通常研究主要集中在兩部分 : ①對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的毒性影響 ; ②穿膜肽與細(xì)胞成分相互作用而造成的毒性影響[6 ].
一些模式穿膜肽 ,如 MAP ,及人為設(shè)計的穿膜肽 ,如 transportan ,它們在結(jié)構(gòu)上與抗菌肽類似 ,對細(xì)胞膜的穩(wěn)定性有較大的影響. Saar 等[19 ] 研究了 5 種穿膜多肽 pAntp (43～58) 、pTAT(48～60) 、pVEC(615～632) 和 MAP、transportan10 等對 2 種人癌細(xì)胞株K562 和 MDA2MB2231 及永久主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜毒性. 在所有細(xì)胞株中 ,pAntp (43～58) 、pTAT(48 ～ 60) 和 pVEC ( 615 ～ 632 ) 泄 露 ; 而 MAP 和transportan10 可引起明顯的細(xì)胞泄露. 當(dāng) K562 和MDA2MB2231 胞處于 10μmolΠL MAP 和 transportan10中 10 min 時 ,即可使 40 %乳酸脫氫酶泄露. 有些研究表明 ,穿膜肽的毒性是與其種類、濃度和負(fù)載物密切相關(guān)的. 當(dāng) TAT(48～57) 濃度達(dá) 100μmolΠL 以上時仍基本上對所有細(xì)胞都無害 ,而 Antp (43～58) 卻表現(xiàn)出明顯的毒性. 在不考慮負(fù)載物序列時 ,與 TAT(48～57) 和 Antp (43～58) 結(jié)合多肽濃度大于 10μmolΠL 時觸發(fā)明顯的長度依賴毒性. 進一步數(shù)據(jù)還表明 ,毒性的發(fā)生與胞內(nèi)兩個應(yīng)激信號通路的激活有關(guān). 雖然包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的 TAT 肽 (48～85) 在體外培養(yǎng)實驗中未表現(xiàn)出神經(jīng)毒性 ,但含α螺旋段(37～60) 的 TAT 肽對 HeLa 細(xì)胞的遷延照射會導(dǎo)致60 %細(xì)胞壞死. 而且 TAT 多肽 (43～60) 雖只表現(xiàn)10 %～15 %毒性 ,細(xì)胞短時間培養(yǎng)在 20～100μmolΠL的 PTD 濃度下也未表現(xiàn)任何不良作用 ,而 500μmolΠL PTD 在很短的時間內(nèi)即可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞功能改變. 提示 PTD 濃度超過 100μmolΠL 可能會導(dǎo)致毒性[21～24 ]. 由以上資料可以看出 ,要充分發(fā)揮穿膜肽獨一無二的作用 ,對其毒性影響的進一步研究是非常必要的.
4 穿膜肽的應(yīng)用前景
基于穿膜肽的特殊功能 ,關(guān)于它們應(yīng)用方面的研究正在迅速展開. 穿膜肽可以攜帶的“貨物”不只是小分子物質(zhì) ,還可以是多肽、蛋白質(zhì)、核酸 ,甚至超分子顆粒.
Morishita 等[25 ]利用多聚精氨酸成功將胰島素分子帶入了細(xì)胞. 實驗表明 ,單獨胰島素存在時觀察不到腸吸收 ,但在同時給以 D2(Arg) 6 和 L2(Arg) 6 時呈現(xiàn)劑量依賴性明顯的胰島素腸吸收. D2(Arg) 6 比 L2(Arg) 6 對胰島素吸收影響更大. 在多聚精氨酸中 D2(Arg) 8 對胰島素腸吸收表現(xiàn)出最強的影響. 而且 ,此時并不需要將多聚精氨酸與胰島素進行共價連接.可以想象如果這種方法成功 ,將為糖尿病患者的治療帶來多么深刻的影響. 其它多肽或蛋白 ,如神經(jīng)元營養(yǎng)因子 ( GDNF)[26 ] 、β2半乳糖苷酶[27 ] 、強效胃酶抑素 A(PepA)[28 ] 等都被報道可通過與穿膜肽連接而有效進入細(xì)胞內(nèi)部 ,GDNF 甚至可以通過血腦屏障.
RNA 干擾是研究基因功能、基因調(diào)控和基因治療的有效方法. 雙鏈 RNA 用以誘導(dǎo)序列特異性基因沉默. 為使特定基因沉默 ,合適的 siRNA 運輸系統(tǒng)是必需的. 含 9 個精氨酸的穿膜肽能以非共價形式與EGFPsiRNA 形成復(fù)合物 ,并將其轉(zhuǎn)運進入穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的 GC2EGFP 細(xì)胞株中. 進入后 ,siRNA出現(xiàn)在細(xì)胞的核周區(qū) ,并可最終實現(xiàn)其目標(biāo)基因egfp 的沉默[29 ]. Unnamalai 等[30 ] 也用 CPP-siRNA 包裝的運輸方式成功介導(dǎo) RNAi 進入煙草細(xì)胞. 利用設(shè)計合成的巨大分支的穿膜肽分子還能成功的將DNA 質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)染進入多種哺乳動物細(xì)胞中 ,為DNA 分子的運輸提供了新的選擇 ,且效率比傳統(tǒng)方法更高[31 ]
Sethuraman 等[32 ] 在極端 pH 敏感聚合物和穿膜TAT的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新的針對酸性實體瘤的藥物靶向運輸系統(tǒng). 運輸系統(tǒng)包括 2 個組分 : ①含有疏水核心的由多聚 L2乳酸(PLLA) 構(gòu)成的聚合膠團 ,其親水外殼包含聚乙二醇 (PEG) 連接的 TAT 微團 ; ②極度 pH 敏感的由多聚異丁烯�；前返厮餍�(PST) 和 PEG(PSD2b2PEG) 構(gòu)成的雙重共聚體. 實驗證明 ,TAT不僅易位進入細(xì)胞還可出現(xiàn)在核周圍. 說明這樣的運輸系統(tǒng)可能攜帶任何疏水藥物接近細(xì)胞核. 對此系統(tǒng)進一步的實驗正在進行中 ,它為腫瘤靶向治療帶來了希望.
利用融合肽 diINF27 共包被形成免疫脂質(zhì)體還能實現(xiàn)脂質(zhì)體蛋白的胞質(zhì)運輸. 研究表明 ,盡管利用表面被穿膜肽 TAT 修飾的脂質(zhì)體不能使脂質(zhì)體顆粒直接易位穿過細(xì)胞膜 ,但細(xì)胞通過內(nèi)吞作用對脂質(zhì)體的攝入比未修飾的脂質(zhì)體提高了[33 ].
5 結(jié)語
穿膜肽的研究是目前的一個重點和熱點 ,我國也開展了一系列關(guān)于其結(jié)構(gòu)特征、穿模機制與活性、潛在細(xì)胞毒性等的研究[34～37 ],并取得了一定的成果. 所有的研究都表明 ,穿膜肽可有效將多肽、蛋白質(zhì)及 DNA 、RNA、超分子顆粒等 , 通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式 ,導(dǎo)入多種細(xì)胞中 , 且在一定濃度范圍內(nèi)不會造成細(xì)胞損傷. 雖然對于穿膜肽進入活細(xì)胞的具體機制尚無定論 ,但可以肯定其作為生物活性分子有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運工具 ,必將在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運、臨床藥效評價以及細(xì)胞免疫學(xué)等多種研究領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用. 伴隨著研究的進行 ,尤其是對其穿膜機制研究的不斷深入 ,我們還可能人工合成更多的、穿膜能力更強而毒性很小甚至無細(xì)胞毒性的穿膜肽 , 以用于疾病治療等其它方面.
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