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水通道蛋白亞型3在膿毒癥肺血管通透性中的作用及SS-31對(duì)其的影響
瀏覽量:803 | 2024/5/11 15:40:06



[摘要] 目的 探討水通道蛋白亞型3(aquaporin 3,Aqp3)在膿毒癥肺血管通透性中的作用及SS-31 對(duì)其的影響。方法 采用SD大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型。在整體動(dòng)物水平上分為假手術(shù)組,膿毒癥6、12 h組,在離體細(xì)胞水平分為空白對(duì)照組,LPS刺激6、12 h組,分別觀察膿毒癥和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激6、12 h后肺靜脈Aqp3的表達(dá)和血管通透性的變化,以及干擾Aqp3后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化。進(jìn)一步觀察抗氧化劑SS-31對(duì)Aqp3的表達(dá)與血管通透性的作用。 結(jié)果 膿毒癥和LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后Aqp3表達(dá)和肺血管通透性均明顯增加,與假手術(shù)組和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用RNAi抑制Aqp3的表達(dá),可明顯拮抗由LPS刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,與LPS刺激組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(P<0.05)。在整體動(dòng)物和離體細(xì)胞水平應(yīng)用抗氧化劑SS-31均可降低由膿毒癥和LPS刺激引起的Aqp3表達(dá)和血管通透性的增加,與膿毒癥和LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Aqp3參與了膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié),抗氧化措施可降低膿毒癥肺血管通透性及下調(diào)Aqp3的表達(dá)。


膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,可導(dǎo)致組織和器官發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷,死亡率很高。研究證實(shí)膿毒癥后血管通透性顯著增加[1],是導(dǎo)致膿毒癥器官功能損傷的重要因素之一。水通道蛋白(aquaporins,Aqps)是一組與水通透性有關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。迄今在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有12種Aqps。多種Aqps的表達(dá)及功能異常在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用。Aqp3在血管組織中有大量表達(dá),前期研究顯示膿毒癥后肺血管Aqp3表達(dá)明顯升高,其是否參與膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)尚不清楚。氧化應(yīng)激是膿毒癥重要的病理生理過程,Szeto-Schiller-31 (SS-31,H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)是一種新型的抗氧化肽,對(duì)多種疾病具有保護(hù)作用。SS-31能否通過Aqp3改善膿毒癥肺血管通透性未見相關(guān)研究。因此,本研究從整體動(dòng)物和離體細(xì)胞水平探討Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中的作用及SS-31對(duì)其的影響,為臨床膿毒癥血管通透性的治療提供全新的思路。


1 材料與方法


1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

成年SPF級(jí)SD大鼠,12周齡,雌雄各半,體質(zhì)量180~220 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2012-0005,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(渝)2012-0010。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM-F12購(gòu)自HyClone公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自Science-cell公司;FITC標(biāo)記牛血清白蛋白(FITC-BSA)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;Aqp3多克隆兔抗大鼠抗體購(gòu)自Abcam公司;β-actin山羊抗大鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Life technologies公司;Transwell 6孔板購(gòu)自美國(guó)Costar公司。


1.2 方法


1.2.1 膿毒癥模型制備

參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)復(fù)制膿毒癥模型。SD大鼠以30 mg/kg戊苯巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉。開腹,暴露盲腸,排除盲端氣泡,距盲端3 cm處結(jié)扎,用棱形針穿孔,穿孔大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,使糞便自由流入腹腔,引起感染。假手術(shù)組僅進(jìn)行開腹及關(guān)腹,不進(jìn)行處理盲腸。模型成功率85%以上[2]。


1.2.2 肺靜脈原代內(nèi)皮細(xì)胞準(zhǔn)備

3%戊巴比妥鈉麻醉、固定大鼠后,暴露肺臟,取肺左右側(cè)肺靜脈,切成小塊,均勻鋪于培養(yǎng)瓶中,3 d后去組織培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞用Ⅷ和CD31鑒定,陽性率90%以上。培養(yǎng)至3~5代用于實(shí)驗(yàn)。


1.2.3 膿毒癥肺血管通透性和Aqp3表達(dá)的變化
SD大鼠48只,分為3組(每組16只):假手術(shù)組、膿毒癥6 h組、膿毒癥12 h組。其中24只大鼠(每組8只)用于檢測(cè)肺血管通透性,24只大鼠(每組8只)用于提取肺靜脈組織蛋白檢測(cè)Aqp3的蛋白變化。采用CLP復(fù)制膿毒癥模型,在CLP后6、12 h麻醉固定大鼠,經(jīng)頸靜脈注射熒光白蛋白(9 mg/kg),0.5 h后沖洗肺部,取左肺上葉,稱量,記錄肺干質(zhì)量,剪碎,勻漿后離心取上清液,使用500 nm波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。以上清液熒光強(qiáng)度/肺干質(zhì)量代表肺血管通透性。同時(shí)取相應(yīng)各時(shí)相點(diǎn)大鼠肺靜脈,采用Western blot檢測(cè)Aqp3的蛋白表達(dá),分析Aqp3表達(dá)與肺血管通透性之間的關(guān)系。


1.2.4 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對(duì)肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性和Aqp3表達(dá)的影響及Aqp3干擾后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化


實(shí)驗(yàn)分3組:取肺靜脈原代內(nèi)皮細(xì)胞,用1 μg/mL濃度的LPS刺激細(xì)胞6、12 h為L(zhǎng)PS刺激6、12 h組,以未經(jīng)LPS刺激的正常細(xì)胞作為空白對(duì)照組。取1×105/孔細(xì)胞接種于Transwell,培養(yǎng)48 h后,上腔加入10 μL 2 mg/mL FITC-BSA,4 h后從下室取200 μL培養(yǎng)基至96孔板測(cè)熒光量,將下腔實(shí)際透過的熒光量占10 μL熒光白蛋白總熒光量比率作為 FITC-BSA透過率,以反映肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[3]。同時(shí)提取LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后的相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞總蛋白,用Western blot檢測(cè)Aqp3蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證Aqp3對(duì)肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響,在RNA水平上用PCR檢測(cè)3個(gè)RNAi片段(RNAi 1~3)處理Aqp3,選擇有效的RNAi片段(LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染 siRNA,50 nmol/L),24 h后觀察其對(duì)通透性的影響。


1.2.5 SS-31對(duì)膿毒癥肺血管通透性和Aqp3的影響

復(fù)制膿毒癥模型時(shí),經(jīng)尾靜脈注射0.5、1、3 mg/kg SS-31,觀察CLP 12 h后大鼠肺血管通透性和Aqp3表達(dá)的變化。離體細(xì)胞水平以0.1 μg/mL SS-31預(yù)處理后,觀察LPS刺激后Aqp3和內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化。


1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以x±s表示,多組比較采用方差分析,兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。


2 結(jié)果


2.1 膿毒癥肺血管通透性和Aqp3表達(dá)的變化
與假手術(shù)組相比,CLP后不同時(shí)相點(diǎn)的肺血管通透性均有明顯升高(P<0.05),膿毒癥6、12 h組的肺血管通透性分別增加28.61%、78.14%(圖 1A)。同時(shí),Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示膿毒癥6、12 h大鼠肺血管中Aqp3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,圖 1B、C)。表明Aqp3表達(dá)和肺血管通透性有關(guān)。

2.2 LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后通透性和Aqp3的變化以及Aqp3干擾后內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響
與空白對(duì)照組相比,LPS刺激6、12 h組肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的通透性均有升高(P<0.05,圖 2A)。同時(shí)LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后Aqp3蛋白水平也明顯升高(P<0.05,圖 2B、C)。為進(jìn)一步驗(yàn)證Aqp3對(duì)通透性的作用,采用RNAi處理Aqp3,干擾片段1、2效果明顯(圖 2D、E)。選用片段2干擾Aqp3可明顯拮抗由LPS刺激引起的單層內(nèi)皮細(xì)胞FITC-BSA透過率的增加(P<0.05,圖 2F)。

2.3 SS-31對(duì)膿毒癥肺血管通透性和Aqp3的影響
膿毒癥模型經(jīng)尾靜脈注射SS-31 0.5、1、3 mg/kg后,膿毒癥肺血管的通透性降低。與膿毒癥組相比,各組分別降低14.08%(0.5 mg/kg)、19.01%(1 mg/kg)、41.25%(3 mg/kg),見圖 3A。同時(shí)發(fā)現(xiàn)給藥后大鼠肺靜脈Aqp3的蛋白表達(dá)較膿毒癥大鼠明顯下降(P<0.05,圖 3B、C)。

2.4 SS-31對(duì)LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性和Aqp3的影響
在LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)予以SS-31處理后,肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的通透性降低(圖 4A);與LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比,SS-31處理的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Aqp3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,圖 4B、C)。

3 討論


本研究通過在整體動(dòng)物水平和離體細(xì)胞水平觀察膿毒癥和LPS刺激不同時(shí)相點(diǎn)肺血管通透性和Aqp3的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)隨著膿毒癥肺血管通透性的增加,Aqp3的表達(dá)明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在離體細(xì)胞水平干擾Aqp3后,可明顯拮抗LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。說明Aqp3參與了膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)。


Aqps是一組調(diào)控水迅速進(jìn)出細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要介導(dǎo)自由水被動(dòng)跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)保持細(xì)胞內(nèi)外水平衡起重要作用[4]。Aqps參與了細(xì)胞的遷移、分化等功能的調(diào)節(jié),對(duì)腦缺血缺氧再灌注損傷[5],腫瘤的發(fā)生、侵襲[6-7],視網(wǎng)膜及神經(jīng)脫髓鞘性疾病[8]等多種疾病有影響[9-12]。以往研究發(fā)現(xiàn)Aqp1、Aqp4、Aqp5等在多種因素引起的腦和肺等器官通透性增加中發(fā)揮作用[13-15]。有關(guān)Aqp3是否參與疾病后血管通透性調(diào)節(jié),目前尚不清楚。本研究證實(shí)Aqp3在膿毒癥后肺血管通透性中發(fā)揮作用,但Aqp3是否參與膿毒癥后其他器官通透性的調(diào)節(jié)以及在其他疾病引起的通透性變化中起作用和其他Aqp亞型是否參與膿毒癥血管通透性的調(diào)節(jié)等均需進(jìn)一步證實(shí)。


氧化應(yīng)激是膿毒癥重要的病理生理過程。SS-31是一種新型抗氧化肽,其抗氧化作用主要針對(duì)線粒體,能減少活性氧的產(chǎn)生[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整體水平和離體水平應(yīng)用SS-31能顯著降低膿毒癥肺血管的通透性,同時(shí)降低Aqp3的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)SS-31可改善膿毒癥肺血管通透性,未來可作為一種治療膿毒癥的有效藥物,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。SS-31能下調(diào)Aqp3的表達(dá),但SS-31是否通過下調(diào)Aqp3來降低肺血管通透性,我們下一步將繼續(xù)研究。


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