[摘要] 目的 探討水通道蛋白亞型3(aquaporin 3，Aqp3)在膿毒癥肺血管通透性中的作用及SS-31 對其的影響。方法 采用SD大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型。在整體動物水平上分為假手術(shù)組，膿毒癥6、12 h組，在離體細(xì)胞水平分為空白對照組，LPS刺激6、12 h組,分別觀察膿毒癥和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激6、12 h后肺靜脈Aqp3的表達(dá)和血管通透性的變化，以及干擾Aqp3后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化。進(jìn)一步觀察抗氧化劑SS-31對Aqp3的表達(dá)與血管通透性的作用。 結(jié)果 膿毒癥和LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后Aqp3表達(dá)和肺血管通透性均明顯增加，與假手術(shù)組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用RNAi抑制Aqp3的表達(dá)，可明顯拮抗由LPS刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，與LPS刺激組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(P＜0.05)。在整體動物和離體細(xì)胞水平應(yīng)用抗氧化劑SS-31均可降低由膿毒癥和LPS刺激引起的Aqp3表達(dá)和血管通透性的增加，與膿毒癥和LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 Aqp3參與了膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)，抗氧化措施可降低膿毒癥肺血管通透性及下調(diào)Aqp3的表達(dá)。
膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致組織和器官發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，死亡率很高。研究證實(shí)膿毒癥后血管通透性顯著增加[1]，是導(dǎo)致膿毒癥器官功能損傷的重要因素之一。水通道蛋白(aquaporins，Aqps)是一組與水通透性有關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。迄今在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有12種Aqps。多種Aqps的表達(dá)及功能異常在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用。Aqp3在血管組織中有大量表達(dá)，前期研究顯示膿毒癥后肺血管Aqp3表達(dá)明顯升高，其是否參與膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)尚不清楚。氧化應(yīng)激是膿毒癥重要的病理生理過程，Szeto-Schiller-31 (SS-31，H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)是一種新型的抗氧化肽，對多種疾病具有保護(hù)作用。SS-31能否通過Aqp3改善膿毒癥肺血管通透性未見相關(guān)研究。因此，本研究從整體動物和離體細(xì)胞水平探討Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中的作用及SS-31對其的影響，為臨床膿毒癥血管通透性的治療提供全新的思路。
1 材料與方法
成年SPF級SD大鼠，12周齡，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0010。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM-F12購自HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自Science-cell公司；FITC標(biāo)記牛血清白蛋白(FITC-BSA)購自Sigma-Aldrich公司；Aqp3多克隆兔抗大鼠抗體購自Abcam公司；β-actin山羊抗大鼠抗體購自美國Life technologies公司；Transwell 6孔板購自美國Costar公司。
1.2 方法
參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)復(fù)制膿毒癥模型。SD大鼠以30 mg/kg戊苯巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉。開腹，暴露盲腸，排除盲端氣泡，距盲端3 cm處結(jié)扎，用棱形針穿孔，穿孔大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，使糞便自由流入腹腔，引起感染。假手術(shù)組僅進(jìn)行開腹及關(guān)腹，不進(jìn)行處理盲腸。模型成功率85%以上[2]。
3%戊巴比妥鈉麻醉、固定大鼠后，暴露肺臟，取肺左右側(cè)肺靜脈，切成小塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶中，3 d后去組織培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞用Ⅷ和CD31鑒定，陽性率90%以上。培養(yǎng)至3～5代用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.4 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性和Aqp3表達(dá)的影響及Aqp3干擾后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化
實(shí)驗(yàn)分3組：取肺靜脈原代內(nèi)皮細(xì)胞，用1 μg/mL濃度的LPS刺激細(xì)胞6、12 h為LPS刺激6、12 h組，以未經(jīng)LPS刺激的正常細(xì)胞作為空白對照組。取1×105/孔細(xì)胞接種于Transwell，培養(yǎng)48 h后，上腔加入10 μL 2 mg/mL FITC-BSA，4 h后從下室取200 μL培養(yǎng)基至96孔板測熒光量，將下腔實(shí)際透過的熒光量占10 μL熒光白蛋白總熒光量比率作為 FITC-BSA透過率，以反映肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[3]。同時(shí)提取LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后的相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞總蛋白，用Western blot檢測Aqp3蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證Aqp3對肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，在RNA水平上用PCR檢測3個(gè)RNAi片段(RNAi 1~3)處理Aqp3，選擇有效的RNAi片段(LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染 siRNA，50 nmol/L)，24 h后觀察其對通透性的影響。
復(fù)制膿毒癥模型時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射0.5、1、3 mg/kg SS-31，觀察CLP 12 h后大鼠肺血管通透性和Aqp3表達(dá)的變化。離體細(xì)胞水平以0.1 μg/mL SS-31預(yù)處理后，觀察LPS刺激后Aqp3和內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化。
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組比較采用方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
3 討論
本研究通過在整體動物水平和離體細(xì)胞水平觀察膿毒癥和LPS刺激不同時(shí)相點(diǎn)肺血管通透性和Aqp3的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)隨著膿毒癥肺血管通透性的增加，Aqp3的表達(dá)明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在離體細(xì)胞水平干擾Aqp3后，可明顯拮抗LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。說明Aqp3參與了膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)。
Aqps是一組調(diào)控水迅速進(jìn)出細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要介導(dǎo)自由水被動跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對保持細(xì)胞內(nèi)外水平衡起重要作用[4]。Aqps參與了細(xì)胞的遷移、分化等功能的調(diào)節(jié)，對腦缺血缺氧再灌注損傷[5]，腫瘤的發(fā)生、侵襲[6-7],視網(wǎng)膜及神經(jīng)脫髓鞘性疾病[8]等多種疾病有影響[9-12]。以往研究發(fā)現(xiàn)Aqp1、Aqp4、Aqp5等在多種因素引起的腦和肺等器官通透性增加中發(fā)揮作用[13-15]。有關(guān)Aqp3是否參與疾病后血管通透性調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。本研究證實(shí)Aqp3在膿毒癥后肺血管通透性中發(fā)揮作用，但Aqp3是否參與膿毒癥后其他器官通透性的調(diào)節(jié)以及在其他疾病引起的通透性變化中起作用和其他Aqp亞型是否參與膿毒癥血管通透性的調(diào)節(jié)等均需進(jìn)一步證實(shí)。
氧化應(yīng)激是膿毒癥重要的病理生理過程。SS-31是一種新型抗氧化肽，其抗氧化作用主要針對線粒體，能減少活性氧的產(chǎn)生[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整體水平和離體水平應(yīng)用SS-31能顯著降低膿毒癥肺血管的通透性，同時(shí)降低Aqp3的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)SS-31可改善膿毒癥肺血管通透性，未來可作為一種治療膿毒癥的有效藥物，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。SS-31能下調(diào)Aqp3的表達(dá)，但SS-31是否通過下調(diào)Aqp3來降低肺血管通透性，我們下一步將繼續(xù)研究。
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