［摘要］ 目的 以新型冠狀病毒（SARS⁃CoV⁃2）刺突蛋白（S1蛋白）為靶點(diǎn)，篩選抗新冠病毒的多肽類藥物。方法以S1蛋白為靶蛋白，利用噬菌體展示技術(shù)，從噬菌體隨機(jī)12肽庫中篩選親和多肽，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）驗(yàn)證篩選多肽與靶蛋白的親和性，并對(duì)篩選出的親和多肽進(jìn)行細(xì)胞水平驗(yàn)證。結(jié)果 多肽p27與S1蛋白具有較強(qiáng)親和性，并有阻止SARS⁃CoV⁃2假病毒進(jìn)入細(xì)胞的作用，IC50為73 μmol/L。結(jié)論 多肽p27可能有抗SARS⁃CoV⁃2活性，具有開發(fā)成抗新冠病毒多肽類藥物的潛力。
新型冠狀病毒（SARS⁃CoV⁃2）的出現(xiàn)和迅速蔓延嚴(yán)重?fù)p害了人類健康并正在破壞全球經(jīng)濟(jì)。SARS⁃CoV⁃2迄今已感染一億多人，造成300多萬人死亡［1］，世界大部分地區(qū)采取封控模式來阻止病毒的傳播，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［2，3］。
文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）是新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體［4］。病毒表面的刺突蛋白（spike protein，S 蛋白）在膜滲透和感染機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。S 蛋白由 S1 和 S2 兩部分構(gòu)成，S1 是與受體 ACE2 結(jié)合部分［5，6］，是新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞導(dǎo)致病毒感染和發(fā)病的重要決定因素。
噬菌體展示技術(shù)（phage display technique，PDT），是一種隨機(jī)篩選技術(shù)［7，8］，它使大量的隨機(jī)多肽與其DNA 編碼序列建立直接聯(lián)系［9］，在噬菌體顆粒表面快速生成數(shù)十億個(gè)極高多樣性肽，可針對(duì)靶分子進(jìn)行迭代篩選［10］。該技術(shù)在多肽藥物研究領(lǐng)域有巨大應(yīng)用前景。
為獲得抗新冠病毒的多肽類藥物，本研究以新冠病毒S1蛋白為靶蛋白，利用PDT，經(jīng)過3輪篩選和富集，獲得與靶蛋白具有親和性的候選結(jié)合肽，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）驗(yàn)證多肽與靶蛋白親和性，并在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證其阻止 SARS⁃CoV⁃2假病毒進(jìn)入細(xì)胞的效果，從而得到與新冠病毒S1蛋白有較高親和性并有可能抗SARS⁃CoV⁃2活性的多肽，為以S1蛋白為作用靶點(diǎn)的抗新冠藥物研究提供新的方向，并發(fā)現(xiàn)具有抗 SARS ⁃CoV ⁃2 的多肽類藥物的先導(dǎo)化合物。
1 材料與方法
噬 菌 體 隨 機(jī) 表 面 展 示 12 肽 庫（美 國 NEWENGLAND BioLabs公司）；SARS ⁃CoV ⁃2 Spike S1⁃HisRecombiant Protein（40591⁃V08H）、M13 BacteriophageAntibody（HRP）（11973 ⁃ MM05T ⁃ H）、SARS ⁃ CoV ⁃ 2Spike antibody（40150⁃D001）（均北京義翹神州科技有限公司）；異丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃beta ⁃D ⁃thiogalactopyranoside，IPTG，1122GR005）、5⁃溴⁃4⁃氯⁃3⁃吲哚⁃ β⁃D⁃半乳糖苷（5⁃bromo⁃4⁃chloro⁃3⁃indolyl β⁃D⁃galactopyranoside，XGal，1100GR001）（均廣州賽國生物科技有限公司）；3，3′，5，5′⁃四甲基聯(lián)苯胺顯色液（3，3′，5，5′⁃tetramethylbenzidine，TMB，P0209，碧 云 天 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司）；HEK ⁃ 293TACE2 過表達(dá)細(xì)胞株（41107ES03）、COVID⁃19⁃SpikeProtein Pseudovirus（11906ES70）、螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)劑盒（1140ES80）（均翌圣生物科技有限公司）；細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit⁃8，CCK⁃8，CK04，日本同仁化學(xué)研究所）。
1.2 方法
1.2.1 噬菌體隨機(jī) 12 肽庫篩選親和性多肽 以SARS⁃CoV⁃2 S1 蛋白為靶蛋白，利用噬菌體隨機(jī) 12肽庫篩選親和性多肽，將 S1 蛋白用包被液稀釋至100 μg/ml，包被于 ELISA 板上，4℃濕盒孵育過夜。棄包被液，加 5 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉 1 h。用 Tris 鹽酸緩沖液+吐溫⁃20（TrisBuffered Saline with Tween⁃20，TBST）洗滌后，加噬菌體原庫 1×1011 PFU，室溫?fù)u育 1 h。用 TBST 洗滌后加非特異性洗脫緩沖液（甘氨酸⁃鹽酸），用 pH 9.1Tris⁃HCl 中和，收集洗脫液。取 5 μl 洗脫液測(cè)定滴度，剩余擴(kuò)增、純化，用于下一輪篩選，共進(jìn)行 3 輪篩選。
1.2.2 ELISA 驗(yàn)證篩選噬菌體單克隆與 S1 蛋白結(jié)合的親和性 將篩選到的噬菌體上清梯度稀釋，采用雙層瓊脂法，平鋪于 IPTG/Xgal 固體培養(yǎng)基上，從接近 100個(gè)噬菌斑的平板上挑取 80個(gè)噬菌體藍(lán)斑，分別擴(kuò)增；擴(kuò)增后噬菌體上清一半用于無水乙醇法快速提取 DNA，送公司測(cè)序；剩余測(cè)定滴度用于ELISA驗(yàn)證。樣品孔包被S1蛋白，BSA為空白孔，置4℃濕盒中過夜。次日，棄包被液，加 BSA 稀釋液37℃封閉1 h，拍掉閉液，加相同濃度噬菌體上清，室溫?fù)u育 1 h，棄噬菌體，用 TBST 洗板 6 次后，加抗M13 抗體稀釋液，搖育 1 h，TBST 洗板 6 次，加 TMB顯色液，室溫 20 min，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處光密度（D450）值。
1.2.3 篩選親和多肽的合成 測(cè)序得到 DNA 序列后推導(dǎo)出氨基酸序列，根據(jù)多肽的氨基酸序列，合成帶有生物素標(biāo)記的多肽。
1.2.4 ELISA 驗(yàn)證篩選多肽與 S1 蛋白結(jié)合特異性 用包被液稀釋鏈霉親和素 10 μg/ml，包被于ELISA 板上，4℃濕盒中孵育過夜。拍掉包被液，加5 mg/ml BSA，0.1 μg/ml鏈霉親和素封閉液，4℃封閉1 h；加篩選結(jié)合肽，室溫?fù)u育 1 h；用 TBST 洗滌后，加S1蛋白，作用1 h；用TBST洗滌后，加抗S1蛋白小鼠源抗體，室溫?fù)u育 1 h，TBST 洗滌后，加入 HRP 標(biāo)記的抗小鼠抗體，室溫作用 1 h；TBST 洗滌后，加入TMB 顯色液，室溫反應(yīng) 15 min，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（D450）值。
1.2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期 HEK⁃293T⁃ACE2細(xì)胞，以1×104細(xì)胞/孔密度鋪于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng) 18 h。將梯度稀釋多肽 p27 加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，加 CCK⁃8 試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)40 min，酶標(biāo)儀測(cè)D450值。
采用 GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s 描述，計(jì)算出IC50值，采用t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，Dunnett⁃t進(jìn)行兩兩比較，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
3 討論
SARS⁃CoV⁃2 S1蛋白可通過與靶細(xì)胞受體ACE2結(jié)合介導(dǎo)病毒侵入過程，是病毒治療藥物和疫苗研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究以 S1 蛋白為靶蛋白，通過PDT，篩選與靶蛋白具有親和性的結(jié)合肽，通過ELISA驗(yàn)證結(jié)合肽與S1蛋白的親和性［11，12］，發(fā)現(xiàn)p27、p5和p45 與 S1 蛋白有較強(qiáng)的親和性。SARS⁃CoV⁃2 假病毒是將慢病毒載體中的包膜糖蛋白用新冠病毒 S蛋白替代，可形成模擬新冠病毒感染的假病毒［13］。假病毒通過表面 S 蛋白感染 HEK⁃239T⁃ACE2 細(xì)胞并表達(dá)報(bào)告熒光素酶基因。結(jié)果顯示，p27 可阻止新冠病毒S蛋白假病毒進(jìn)入HEK⁃239T⁃ACE2細(xì)胞，提示結(jié)合肽p27可能會(huì)阻斷S1蛋白與ACE2受體的結(jié)合，但尚不能確定其在阻止 S1 蛋白與 ACE2 受體結(jié)合中的作用如何。后續(xù)將深入探究p27能否阻止S1 蛋白與 ACE2 受體的結(jié)合，并對(duì)其作用機(jī)制及體內(nèi)外抗SARS⁃CoV⁃2的活性進(jìn)行研究。同時(shí)，以p27作為先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)一步修飾優(yōu)化，以提高抗病毒活性。后續(xù)可探索 p27 對(duì) SARS⁃CoV⁃2 病毒的抑制作用，研發(fā)抗新冠病毒的多肽類藥物。另外，對(duì)于篩選的p45、p5結(jié)合肽可作為靶向性載體，遞送其他具有抗 SARS⁃CoV⁃2 的藥物，提高藥物靶向性及生物利用度。
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