［摘要］ 目的 以新型冠狀病毒（SARS⁃CoV⁃2）刺突蛋白（S1蛋白）為靶點，篩選抗新冠病毒的多肽類藥物。方法以S1蛋白為靶蛋白，利用噬菌體展示技術，從噬菌體隨機12肽庫中篩選親和多肽，通過酶聯免疫吸附實驗（ELISA）驗證篩選多肽與靶蛋白的親和性，并對篩選出的親和多肽進行細胞水平驗證。結果 多肽p27與S1蛋白具有較強親和性，并有阻止SARS⁃CoV⁃2假病毒進入細胞的作用，IC50為73 μmol/L。結論 多肽p27可能有抗SARS⁃CoV⁃2活性，具有開發(fā)成抗新冠病毒多肽類藥物的潛力。
新型冠狀病毒（SARS⁃CoV⁃2）的出現和迅速蔓延嚴重損害了人類健康并正在破壞全球經濟。SARS⁃CoV⁃2迄今已感染一億多人，造成300多萬人死亡［1］，世界大部分地區(qū)采取封控模式來阻止病毒的傳播，造成了巨大經濟損失［2，3］。
文獻報道，血管緊張素轉換酶 2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）是新冠病毒進入細胞的受體［4］。病毒表面的刺突蛋白（spike protein，S 蛋白）在膜滲透和感染機制中起到關鍵作用。S 蛋白由 S1 和 S2 兩部分構成，S1 是與受體 ACE2 結合部分［5，6］，是新冠病毒進入宿主細胞導致病毒感染和發(fā)病的重要決定因素。
噬菌體展示技術（phage display technique，PDT），是一種隨機篩選技術［7，8］，它使大量的隨機多肽與其DNA 編碼序列建立直接聯系［9］，在噬菌體顆粒表面快速生成數十億個極高多樣性肽，可針對靶分子進行迭代篩選［10］。該技術在多肽藥物研究領域有巨大應用前景。
為獲得抗新冠病毒的多肽類藥物，本研究以新冠病毒S1蛋白為靶蛋白，利用PDT，經過3輪篩選和富集，獲得與靶蛋白具有親和性的候選結合肽，應用酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）驗證多肽與靶蛋白親和性，并在細胞水平上進一步驗證其阻止 SARS⁃CoV⁃2假病毒進入細胞的效果，從而得到與新冠病毒S1蛋白有較高親和性并有可能抗SARS⁃CoV⁃2活性的多肽，為以S1蛋白為作用靶點的抗新冠藥物研究提供新的方向，并發(fā)現具有抗 SARS ⁃CoV ⁃2 的多肽類藥物的先導化合物。
1 材料與方法
噬 菌 體 隨 機 表 面 展 示 12 肽 庫（美 國 NEWENGLAND BioLabs公司）；SARS ⁃CoV ⁃2 Spike S1⁃HisRecombiant Protein（40591⁃V08H）、M13 BacteriophageAntibody（HRP）（11973 ⁃ MM05T ⁃ H）、SARS ⁃ CoV ⁃ 2Spike antibody（40150⁃D001）（均北京義翹神州科技有限公司）；異丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃beta ⁃D ⁃thiogalactopyranoside，IPTG，1122GR005）、5⁃溴⁃4⁃氯⁃3⁃吲哚⁃ β⁃D⁃半乳糖苷（5⁃bromo⁃4⁃chloro⁃3⁃indolyl β⁃D⁃galactopyranoside，XGal，1100GR001）（均廣州賽國生物科技有限公司）；3，3′，5，5′⁃四甲基聯苯胺顯色液（3，3′，5，5′⁃tetramethylbenzidine，TMB，P0209，碧 云 天 生 物 技 術 有 限 公 司）；HEK ⁃ 293TACE2 過表達細胞株（41107ES03）、COVID⁃19⁃SpikeProtein Pseudovirus（11906ES70）、螢火蟲熒光素酶報告基因檢測劑盒（1140ES80）（均翌圣生物科技有限公司）；細胞增殖毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit⁃8，CCK⁃8，CK04，日本同仁化學研究所）。
1.2 方法
1.2.1 噬菌體隨機 12 肽庫篩選親和性多肽 以SARS⁃CoV⁃2 S1 蛋白為靶蛋白，利用噬菌體隨機 12肽庫篩選親和性多肽，將 S1 蛋白用包被液稀釋至100 μg/ml，包被于 ELISA 板上，4℃濕盒孵育過夜。棄包被液，加 5 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉 1 h。用 Tris 鹽酸緩沖液+吐溫⁃20（TrisBuffered Saline with Tween⁃20，TBST）洗滌后，加噬菌體原庫 1×1011 PFU，室溫搖育 1 h。用 TBST 洗滌后加非特異性洗脫緩沖液（甘氨酸⁃鹽酸），用 pH 9.1Tris⁃HCl 中和，收集洗脫液。取 5 μl 洗脫液測定滴度，剩余擴增、純化，用于下一輪篩選，共進行 3 輪篩選。
1.2.2 ELISA 驗證篩選噬菌體單克隆與 S1 蛋白結合的親和性 將篩選到的噬菌體上清梯度稀釋，采用雙層瓊脂法，平鋪于 IPTG/Xgal 固體培養(yǎng)基上，從接近 100個噬菌斑的平板上挑取 80個噬菌體藍斑，分別擴增；擴增后噬菌體上清一半用于無水乙醇法快速提取 DNA，送公司測序；剩余測定滴度用于ELISA驗證。樣品孔包被S1蛋白，BSA為空白孔，置4℃濕盒中過夜。次日，棄包被液，加 BSA 稀釋液37℃封閉1 h，拍掉閉液，加相同濃度噬菌體上清，室溫搖育 1 h，棄噬菌體，用 TBST 洗板 6 次后，加抗M13 抗體稀釋液，搖育 1 h，TBST 洗板 6 次，加 TMB顯色液，室溫 20 min，加終止液，酶標儀檢測 450 nm處光密度（D450）值。
1.2.3 篩選親和多肽的合成 測序得到 DNA 序列后推導出氨基酸序列，根據多肽的氨基酸序列，合成帶有生物素標記的多肽。
1.2.4 ELISA 驗證篩選多肽與 S1 蛋白結合特異性 用包被液稀釋鏈霉親和素 10 μg/ml，包被于ELISA 板上，4℃濕盒中孵育過夜。拍掉包被液，加5 mg/ml BSA，0.1 μg/ml鏈霉親和素封閉液，4℃封閉1 h；加篩選結合肽，室溫搖育 1 h；用 TBST 洗滌后，加S1蛋白，作用1 h；用TBST洗滌后，加抗S1蛋白小鼠源抗體，室溫搖育 1 h，TBST 洗滌后，加入 HRP 標記的抗小鼠抗體，室溫作用 1 h；TBST 洗滌后，加入TMB 顯色液，室溫反應 15 min，加終止液，酶標儀檢測450 nm處光密度（D450）值。
1.2.6 細胞毒性實驗 取對數生長期 HEK⁃293T⁃ACE2細胞，以1×104細胞/孔密度鋪于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng) 18 h。將梯度稀釋多肽 p27 加入細胞中，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，加 CCK⁃8 試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)40 min，酶標儀測D450值。
采用 GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以xˉ±s 描述，計算出IC50值，采用t檢驗以及單因素方差分析，Dunnett⁃t進行兩兩比較，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結果
3 討論
SARS⁃CoV⁃2 S1蛋白可通過與靶細胞受體ACE2結合介導病毒侵入過程，是病毒治療藥物和疫苗研究的關鍵靶點。本研究以 S1 蛋白為靶蛋白，通過PDT，篩選與靶蛋白具有親和性的結合肽，通過ELISA驗證結合肽與S1蛋白的親和性［11，12］，發(fā)現p27、p5和p45 與 S1 蛋白有較強的親和性。SARS⁃CoV⁃2 假病毒是將慢病毒載體中的包膜糖蛋白用新冠病毒 S蛋白替代，可形成模擬新冠病毒感染的假病毒［13］。假病毒通過表面 S 蛋白感染 HEK⁃239T⁃ACE2 細胞并表達報告熒光素酶基因。結果顯示，p27 可阻止新冠病毒S蛋白假病毒進入HEK⁃239T⁃ACE2細胞，提示結合肽p27可能會阻斷S1蛋白與ACE2受體的結合，但尚不能確定其在阻止 S1 蛋白與 ACE2 受體結合中的作用如何。后續(xù)將深入探究p27能否阻止S1 蛋白與 ACE2 受體的結合，并對其作用機制及體內外抗SARS⁃CoV⁃2的活性進行研究。同時，以p27作為先導化合物，對其進一步修飾優(yōu)化，以提高抗病毒活性。后續(xù)可探索 p27 對 SARS⁃CoV⁃2 病毒的抑制作用，研發(fā)抗新冠病毒的多肽類藥物。另外，對于篩選的p45、p5結合肽可作為靶向性載體，遞送其他具有抗 SARS⁃CoV⁃2 的藥物，提高藥物靶向性及生物利用度。
免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者及原雜志所有，如有侵權，可聯系刪除。文章標注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻，可閱讀原雜志
