它通常由高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。
肽不僅包含正確的肽，還包含雜質(zhì)，例如生產(chǎn)中的水和有機(jī)鹽。肽純度是指相對(duì)于所有雜質(zhì)（水分除外）正確肽的數(shù)量。然而，肽含量是目標(biāo)肽相對(duì)于樣品中其他所有物質(zhì)的百分比，通常由 N 元素分析和氨基酸分析確定。因此，即使肽純度達(dá)到99%，考慮到水和有機(jī)鹽，含量仍可能為70%-80%。
最常見(jiàn)的技術(shù)是反相高效液相色譜 (RP-HPLC)。
最常見(jiàn)的流動(dòng)相是水和乙腈，三氟乙酸充當(dāng)離子對(duì)試劑。根據(jù)不同的肽段，采用合適的梯度洗脫進(jìn)行分離。
其他用于多肽分離純化的流動(dòng)相或離子對(duì)試劑包括乙酸體系、磷酸體系、鹽酸體系、七氟丁酸等，可通過(guò)調(diào)節(jié)pH達(dá)到很好的分離效果。
大多數(shù)肽可以溶解在超純水中。對(duì)于一些不溶性肽，需要先分析氨基酸序列。酸性肽可先溶于少量堿性溶液（如0.1%氨水），然后稀釋至所需濃度。作為堿性肽，可溶于少量酸性溶液（如乙酸、三氟乙酸），然后稀釋至所需濃度。對(duì)于疏水肽，可溶于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑，如DMF、甲醇、丙醇、異丙醇、DMSO等。
最常見(jiàn)的填料是 C18、C8 和 C4 反相色譜柱。
不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表現(xiàn)出很大差異。在大多數(shù)情況下，C18 色譜柱對(duì)分子量小于 4000 或親水性的肽段的分離效果最好。C4 柱適用于分子量超過(guò) 5000 或疏水末端。C8列介于C18和C4之間，其效果更類(lèi)似于C18。對(duì)于一些特殊的選擇性肽段，也可以選擇苯基柱和聚合物柱。
當(dāng)需要更高的 pH 或溫度時(shí)，具有寬 pH 范圍的聚合物 HPLC 柱可能適用于純化。它們?cè)跇O端pH條件下不會(huì)降解，因此可以使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動(dòng)相進(jìn)行分離和純化。
影響因素很多，主要包括流動(dòng)相、色譜柱類(lèi)型、柱溫、波長(zhǎng)、色譜儀性能等。這些差異可能會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。
只要不超過(guò)耐受范圍，凍干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的最簡(jiǎn)單和最有效的方法。但該方法不能滿(mǎn)足一些對(duì)TFA含量要求較高的多肽類(lèi)藥物的要求。應(yīng)與它們進(jìn)行特殊的鹽轉(zhuǎn)化和脫鹽。
大多數(shù)肽在TFA系統(tǒng)下純化，因此TFA鹽是最常見(jiàn)的形式，其次是乙酸鹽和鹽酸鹽形式，很少有肽藥物是特殊鹽形式。離子交換和 HPLC 是最常用的鹽轉(zhuǎn)化方法，而 G25（GE Healthcare 的葡聚糖凝膠）柱可用于脫鹽。
同時(shí)，TFA 可以抑制硅膠表面的硅烷醇基團(tuán)，改善堿性化合物的峰形。如果使用 0.1% TFA 有時(shí)分離效果不好，可以嘗試 0.2% TFA，但使用后需要立即沖洗色譜柱。在梯度洗脫時(shí)，由于基線(xiàn)漂移，它對(duì)制備的影響很小。
