肽、蛋白質(zhì)和核酸等生物分子通常難以通過被動擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜。然而，細(xì)胞穿透肽(CPPs)、細(xì)菌蛋白毒素、某些真核蛋白、病毒以及許多合成藥物遞送載體能夠以不同的效率進(jìn)入真核細(xì)胞，它們通常采用一種或多種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞并初步定位于內(nèi)體中。但是它們?nèi)绾未┻^內(nèi)體膜進(jìn)入細(xì)胞漿(內(nèi)體逃逸)卻依然沒有清晰的研究結(jié)果，這也一直是高效藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)的主要瓶頸所在。此外，許多細(xì)菌和真核蛋白分別通過雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(TAT)和非常規(guī)蛋白分泌(UPS)系統(tǒng)在其自然狀態(tài)下穿過質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)/胞外空間。同樣，這些蛋白質(zhì)輸出系統(tǒng)的運(yùn)作機(jī)制尚不清楚。
2022年1月，美國俄亥俄州立大學(xué)裴德華教授在Accounts of Chemical Research上發(fā)表文章，介紹了一種之前尚未提出的、基本的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制——囊泡萌出和破裂機(jī)制(Vesicle Budding-and-Collapse,VBC)，并通過實驗驗證了相關(guān)結(jié)論。VBC可能是細(xì)菌TAT和真核UPS系統(tǒng)的驅(qū)動機(jī)制，將來可能為高效的藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計提供原則性指導(dǎo)。
細(xì)胞膜是一種高效的生物屏障，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)物質(zhì)包含其中，同時把外來物質(zhì)阻擋在外。分子量小于500且疏水性達(dá)到合理平衡的小分子能以被動擴(kuò)散的方式穿過細(xì)胞膜，而肽、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子則通常不能。然而，一些生物分子能夠自主進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，如細(xì)胞穿透肽(CPPs)、非肽類細(xì)胞穿透分子(CPMs)、細(xì)菌蛋白毒素、某些哺乳動物蛋白、病毒以及合成藥物遞送系統(tǒng)(圖1)，它們中的大多數(shù)能夠通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并定位于內(nèi)體中。為了成功進(jìn)入胞漿，其中一些實體隨后需要轉(zhuǎn)運(yùn)穿過內(nèi)體膜進(jìn)入胞漿，這一過程稱為內(nèi)體逃逸。
研究表明，其他實體可直接跨越細(xì)胞膜或進(jìn)一步進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并逆行轉(zhuǎn)運(yùn)穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入胞漿。折疊的蛋白質(zhì)也可以反方向穿過質(zhì)膜，從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)/胞外空間，這一過程被稱為真核細(xì)胞的非常規(guī)蛋白分泌系統(tǒng)(UPS)和細(xì)菌及細(xì)胞器的雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(TAT)。所有這些情況下，生物分子/實體必須穿過脂質(zhì)雙層膜。生物分子如何自主轉(zhuǎn)運(yùn)穿過脂質(zhì)雙層膜在許多領(lǐng)域一直是個謎團(tuán)，而對轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制認(rèn)識的缺乏極大地阻礙細(xì)胞滲透性生物制劑作為下一代治療藥物的發(fā)展。
最近，Pei等發(fā)現(xiàn)CPPs和CPMs能夠通過全新的VBC機(jī)制實現(xiàn)內(nèi)體逃逸(圖2)。VBC機(jī)制是一種全新的機(jī)制，上述許多(可能所有)生物分子可通過VBC機(jī)制自主地跨脂質(zhì)雙層膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
通過VBC機(jī)制實現(xiàn)內(nèi)體逃逸
目前，科學(xué)家已提出多種內(nèi)體逃逸機(jī)制，包括質(zhì)子海綿效應(yīng)誘導(dǎo)的滲透裂解、膜融合、形成孔洞、局部膜破裂和VBC。其中VBC是唯一經(jīng)過實驗驗證的機(jī)制，適用于以上描述的所有情況，而其他假設(shè)通常只涉及某種情況，并且難以解釋許多實驗觀察結(jié)果。
圖2是環(huán)狀CPPs的細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸機(jī)制。環(huán)狀CPPs直接與質(zhì)膜磷脂(以及潛在的其他膜成分)結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞形成早期內(nèi)體，隨著早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體，其內(nèi)部逐漸酸化，CPPs與內(nèi)體膜的親和力增強(qiáng)。因為CPPs的精氨酸側(cè)鏈在內(nèi)體酸化過程中(pH6.5-4.5)不會進(jìn)一步質(zhì)子化，因此，質(zhì)子化可能發(fā)生在磷脂上(如頭部磷酸基團(tuán))。精氨酸的胍基能夠同時與兩個相鄰的磷酸形成雙齒氫鍵(圖3a)。這種獨特的能力加上多個精氨酸殘基的存在，CPP能夠?qū)⒘字宦?lián)到富含CPP的脂質(zhì)域。磷酸的部分質(zhì)子化將通過減少靜電排斥進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)聚集，脂質(zhì)域的形成在脂質(zhì)域和其周圍膜之間產(chǎn)生線張力，進(jìn)而驅(qū)動脂質(zhì)域萌出形成囊泡。在囊泡萌出過程中，萌出頸部(過渡態(tài))呈負(fù)高斯曲率(如在正交方向上同時具有正和負(fù)曲率)，并且相對于萌出事件前后的基態(tài)具有較高的勢能(圖3b)。
為了促進(jìn)萌出事件，CPPs應(yīng)該選擇性結(jié)合到萌出頸部并降低能壘。具有較高內(nèi)體逃逸效率的CPPs和CPMs通常呈兩親性且構(gòu)象受限。剛性構(gòu)象增加了CPPs/CPMs與內(nèi)體膜的親和力，而兩親性則有利于在萌出頸部產(chǎn)生負(fù)高斯曲率。在磷脂分子之間插入疏水基團(tuán)會產(chǎn)生正膜曲率(圖3c)，而精氨酸殘基可以與磷脂的頭部磷酸基團(tuán)通過氫鍵結(jié)合并聚集誘導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)曲率(圖3a)。內(nèi)體膜萌出過程或萌出后，小囊泡自發(fā)地迅速解體成肽/脂質(zhì)聚合體，并逐漸溶解到細(xì)胞液中。盡管小囊泡(直徑約為100nm)可能由于高的膜曲率和/或高濃度的CPPs的存在而本質(zhì)上不穩(wěn)定，但囊泡破裂的驅(qū)動力尚不清楚。VBC機(jī)制的獨特之處在于，生物分子在拓?fù)鋵W(xué)意義上跨越膜，而非物理上穿過膜，并且每次內(nèi)體逃逸事件之前、期間和之后，內(nèi)體都保持完整。相反，所有其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制都涉及實體物理上穿過細(xì)胞膜，因此需要部分或全部破壞細(xì)胞膜。對于不同的生物分子，進(jìn)入細(xì)胞的具體細(xì)節(jié)可能有所不同。
VBC機(jī)制中，內(nèi)體逃逸需要內(nèi)體中具有一個最小數(shù)量的生物分子，且內(nèi)體逃逸效率具有濃度依賴性。最近研究發(fā)現(xiàn)，一種名為Tat的線性CPP在濃度為0.2、10、20μM濃度時的的內(nèi)體逃逸效率分別為0.08%、0.38%、0.66%。這一發(fā)現(xiàn)解釋了為什么CPPs的胞內(nèi)攝取效率對CPP濃度高度敏感，且隨著CPP濃度的增加而呈非線性增加，因為，胞內(nèi)攝取也具有CPP濃度依賴性。Pei認(rèn)為誘導(dǎo)一次VBC的最小生物分子數(shù)量為每個內(nèi)體80-360個分子，相應(yīng)的內(nèi)體內(nèi)濃度是2-9μM(假設(shè)內(nèi)體平均直徑為0.5μM)，但是這個數(shù)字可能會因為生物分子的性質(zhì)而略微有所不同。
細(xì)胞穿透肽(CPPs）
通常認(rèn)為，低濃度時，CPPs主要通過一種或多種能量依賴性的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后發(fā)生內(nèi)體逃逸，而高濃度時，一些CPPs也能以非能量依賴性的方式直接轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜。VBC的早期線索來自作者對環(huán)狀CPP12和模擬內(nèi)體膜成分的大單層囊泡(GUVs)的體外研究，染料標(biāo)記的CPP12能結(jié)合到GUVs的外側(cè)且最初均勻分布在GUV膜上。隨著時間推移，CPP12分子聚集成強(qiáng)烈的熒光區(qū)域，大概是脂質(zhì)域，隨后這些區(qū)域以小泡的形式萌出(或者少部分進(jìn)入GUV腔內(nèi))(圖4a)。在萌出之前，CPP12集中在萌出頸部(圖4b)，然后，萌出的小泡瓦解成形狀不規(guī)則、熒光強(qiáng)烈的聚集體，這一過程要么與萌出過程同時發(fā)生，要么在萌出完成后不久發(fā)生。
為了觀察活細(xì)胞中的VBC事件，作者用一種pH敏感的染料(pHAb)標(biāo)記CPP12，這種染料在內(nèi)體/溶酶體的酸性環(huán)境中發(fā)出熒光，而在中性胞漿或細(xì)胞外空間中不發(fā)出熒光。用CPP12pHAb(紅色)和膜標(biāo)記物(TopFluor標(biāo)記的磷脂酰絲氨酸(PSTopFluor))處理HeLa細(xì)胞，并用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡實時成像。內(nèi)體逃逸始于內(nèi)體膜上的一個小囊泡的萌發(fā)；這個階段，萌出的囊泡和剩余的內(nèi)體均發(fā)出紅色(CPP12pHAb)和綠色熒光(PSTopFluor)(圖4c)。紅色熒光(CPP12pHAb)的突然消失和綠色熒光(PSTopFluor)的保留證明了隨后小囊泡的瓦解(殘體暴露于胞漿pH)，而完整的內(nèi)體保留了紅色和綠色熒光。每次內(nèi)體逃逸事件發(fā)生非常迅速，通常持續(xù)時間<60秒。
接下來，作者用激酶抑制劑YM201636預(yù)處理HeLa細(xì)胞，以擴(kuò)大內(nèi)體(平均直徑從0.5μm增加到∼2μm)，然后添加四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記的CPP12(CPP12TMR)和內(nèi)體標(biāo)記物(AlexaFluor488標(biāo)記的葡聚糖(DextranAlexa))，以通過延時活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)體在經(jīng)歷VBC過程中的結(jié)構(gòu)變化(圖4d)。明顯，活細(xì)胞中捕獲的VBC中間體與早期GUV研究中觀察到的非常相似(圖4a,b)。此外，同步輻射小角X射線散射研究表明，環(huán)狀CPP在人工膜上產(chǎn)生負(fù)高斯曲率是非常高效的。為了評估VBC機(jī)制的普遍性，作者監(jiān)測了Tat(典型的線性CPP，具有低內(nèi)體逃逸效率，≤0.66%)和CPM3(幾乎能定量內(nèi)體逃逸)在HeLa細(xì)胞中的逃逸情況。CPM3從內(nèi)體中誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的VBC事件，并產(chǎn)生類似于CPP12的VBC中間體，而Tat介導(dǎo)的VBC事件發(fā)生的頻率要低得多(也很難觀察到)。這些結(jié)果表明，內(nèi)體逃逸效率主要取決于生物分子在內(nèi)體膜誘導(dǎo)VBC的效率(頻率)。
一項CPP文獻(xiàn)調(diào)研表明，其他CPPs也能在內(nèi)體和/或細(xì)胞膜上誘導(dǎo)VBC。例如，在YM201636處理的Saos-2細(xì)胞中，一種細(xì)胞滲透性的微型蛋白ZF5.3使內(nèi)體(和溶酶體)形成與CPP12和CPM3誘導(dǎo)的VBC中間體非常相似的膜結(jié)構(gòu)。滲透素、九聚精氨酸(R9)等線性富含精氨酸的CPPs和RW9能夠通過誘導(dǎo)膜內(nèi)陷和形成無定形的肽/脂聚集體而自主進(jìn)入人工囊泡(如GUV和質(zhì)膜球(PMSs))。同步輻射小角度X射線散射研究證實了線性CPPs也能在人工膜上產(chǎn)生負(fù)高斯曲率。
先前令人困惑的結(jié)果現(xiàn)在可以合理化，并為VBC機(jī)制提供額外的支持：(1)CPPs能夠運(yùn)送不同大小(從小分子到大蛋白質(zhì))和理化性質(zhì)的貨物，這些貨物與CPP通過共價連接或非共價結(jié)合；(2)CPPs促進(jìn)無關(guān)聯(lián)大分子貨物(如環(huán)糊精和抗體)的內(nèi)體釋放；(3)融合性脂質(zhì)和多肽促進(jìn)CPPs的內(nèi)體釋放；(4)提高了環(huán)狀和其他構(gòu)象受限的CPPs和CPM的胞內(nèi)攝取效率。然而，是否所有的CPPs/CPMs都通過VBC機(jī)制離開內(nèi)體或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)仍有待確定。
細(xì)菌毒素
細(xì)菌蛋白毒素的結(jié)構(gòu)和其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制均具有多樣性。一些毒素可直接通過質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；另一些毒素則與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用和內(nèi)體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中；還有一些毒素被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后逆行轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。然而，不管采用哪種方式進(jìn)入細(xì)胞，毒素在到達(dá)胞漿之前必須在拓?fù)鋵W(xué)意義上穿過脂質(zhì)雙層膜。白喉毒素(DT)等AB類細(xì)菌毒素通常由兩個功能單元組成：一個酶部分(A，是實際的毒素)和一個非酶部分(B，是遞送載體)，非酶部分能介導(dǎo)受體結(jié)合(R-結(jié)構(gòu)域)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)(T-結(jié)構(gòu)域)。細(xì)胞攝取始于R結(jié)構(gòu)域識別宿主細(xì)胞的表面受體，導(dǎo)致受體−毒素復(fù)合物的內(nèi)吞；內(nèi)體的酸化使毒素從受體上解離，并誘導(dǎo)T結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，然后T結(jié)構(gòu)域插入內(nèi)體膜形成離子傳導(dǎo)孔/通道。通常認(rèn)為，A部分展開并穿過T結(jié)構(gòu)域形成的狹窄通道到達(dá)細(xì)胞質(zhì)。然而，多年來，孔/通道假說受到了許多實驗觀察結(jié)果的挑戰(zhàn)。例如，DT可以將超穩(wěn)定的貨物蛋白以及非共價結(jié)合的核酸運(yùn)送到胞質(zhì)中，表明DT能夠轉(zhuǎn)運(yùn)折疊狀態(tài)的貨物。研究發(fā)現(xiàn)，A部分突變可以消除DT的離子通道活性，但對A部分的轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎沒有影響，而其他突變可以阻止轉(zhuǎn)運(yùn)，但不會影響通道活性。DT的內(nèi)體逃逸呈現(xiàn)“量子”動力學(xué)，即每個內(nèi)體逃逸事件同時向胞漿中釋放∼80個DT分子，且與細(xì)胞外DT的濃度無關(guān)，而通過孔道的DT釋放是連續(xù)的(即一次釋放一個DT分子)。
最近，Pei等發(fā)現(xiàn)DT通過VBC機(jī)制逃離內(nèi)體。作者用pHAb或四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記DT，并通過活細(xì)胞共聚焦顯微鏡監(jiān)測DT的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。DT在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的VBC并產(chǎn)生與CPPs/CPMs相同的內(nèi)體膜結(jié)構(gòu)(圖5a,b,c)。例如，DTTMR定位于內(nèi)體膜上，最初均勻分布于膜上，隨后聚集成富含DT的脂質(zhì)域，這些脂質(zhì)域隨后以小泡的形式萌出并瓦解(圖5c)。有趣的是，一種由腸出血性和致病性大腸桿菌產(chǎn)生的金屬蛋白酶NleC也通過VBC逃離內(nèi)體。與AB類細(xì)菌毒素不同，NleC由包含330個殘基的單一催化結(jié)構(gòu)域組成，以其天然結(jié)構(gòu)進(jìn)入宿主細(xì)胞。NleC的其結(jié)構(gòu)含有兩個多堿基序列，這可能是其進(jìn)入細(xì)胞的原因。然而，分離的每個多堿基序列都不能作為CPP發(fā)揮作用，這與細(xì)胞攝取需要完整的3D結(jié)構(gòu)是一致的。這些結(jié)果表明，蛋白質(zhì)跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)既不需要酸誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，也不需要膜插入。因此，存在一個問題：T結(jié)構(gòu)域的膜插入和離子傳導(dǎo)通道在內(nèi)體逃逸過程中發(fā)揮什么作用？作者認(rèn)為，T結(jié)構(gòu)域的膜插入增加了毒素對內(nèi)體膜的結(jié)合親和力，確保內(nèi)體中80-360個毒素分子中的大多數(shù)與內(nèi)體膜結(jié)合，以促進(jìn)VBC。這一特征對于在極低濃度下(如pM)發(fā)揮其病理生理作用的毒素可能是至關(guān)重要的。離子傳導(dǎo)通道可能是T結(jié)構(gòu)域插入的一個分支，且可能沒有任何生物學(xué)功能。
當(dāng)細(xì)胞外毒素濃度在pM范圍時，80-360個毒素分子是如何聚集在單個內(nèi)體中達(dá)到2-9μM濃度的呢？受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用使毒素從細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)入內(nèi)體達(dá)到有意義的濃度，進(jìn)一步的濃縮可能通過內(nèi)體融合來完成。一個典型的哺乳動物細(xì)胞有數(shù)百個內(nèi)體，這些內(nèi)體通過不斷的囊泡融合和裂變相互連接。雖然單個內(nèi)體最初可能不包含誘導(dǎo)VBC的最小數(shù)量分子，但內(nèi)體的橫向融合，加上毒素聚集到脂質(zhì)域，會逐漸將毒素分子聚集成更少、更大的內(nèi)體，最終達(dá)到VBC的“量子”級。這一情況可能解釋了之前觀察到的內(nèi)體酸化和DT釋放到細(xì)胞質(zhì)之間濃度依賴性的時間延遲(即在較低的DT濃度下有較長的延遲)。這也可能解釋為什么在沒有任何細(xì)胞蛋白的情況下(盡管在相對高濃度的5−20μM)，CPPs本身就能誘導(dǎo)GUVs產(chǎn)生強(qiáng)烈的VBC，但在囊泡交聯(lián)和融合中發(fā)揮作用的HOPS復(fù)合體對于CPPs在體內(nèi)的內(nèi)體逃逸是至關(guān)重要的。
其他膜穿透蛋白
除了細(xì)菌毒素外，許多其他的細(xì)菌和真核蛋白可以向質(zhì)膜或內(nèi)體膜的任意方向轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，α-synuclein的細(xì)胞間傳遞與帕金森病的進(jìn)展有關(guān)，而PTEN-long磷酸酶的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的PI3K信號。Pei等最近發(fā)現(xiàn)，將一個短的CPP序列(如RRRRWWW)接到哺乳動物蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B和嘌呤核苷磷酸化酶)的表面環(huán)中使后者具有細(xì)胞滲透性。在相反的方向上，許多細(xì)菌和哺乳動物的蛋白質(zhì)在其天然狀態(tài)下通過非規(guī)范的分泌機(jī)制從胞漿運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)或胞外空間。
在原核生物、葉綠體和一些線粒體中發(fā)現(xiàn)的TAT系統(tǒng)允許折疊的蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。TAT系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)通常含有復(fù)雜的輔因子(如離子-硫簇)或者是多蛋白復(fù)合物的組成部分，可能是一種避免需要在胞質(zhì)外重新組裝復(fù)雜結(jié)構(gòu)的方式，并且這種轉(zhuǎn)運(yùn)沒有明顯的離子泄漏。真核細(xì)胞的UPS系統(tǒng)通過質(zhì)膜輸出大量的無領(lǐng)導(dǎo)蛋白，如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)家族的細(xì)胞因子。細(xì)菌似乎也有類似的UPS系統(tǒng)。TAT和UPS系統(tǒng)(通過標(biāo)準(zhǔn)的Sec途徑)的一個優(yōu)點是，蛋白質(zhì)可以以一種受調(diào)控的方式快速跨膜運(yùn)輸，這對參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子至關(guān)重要。這些蛋白質(zhì)是如何穿過細(xì)胞膜的問題一直是一個謎團(tuán)。
上述蛋白質(zhì)通過VBC轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜有兩個原因。首先，除了VBC外，對于任何機(jī)制來說，將不同大小和理化性質(zhì)的折疊蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜而不引起大量離子泄漏是無法想象的；其次，上述大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有能夠誘導(dǎo)VBC的多堿基和疏水基序。細(xì)胞滲透性抗體(如TMab4)在其VL結(jié)構(gòu)域的 CDR3 環(huán)中含有疏水基序WYW(或類似序列)，已被確定為“內(nèi)體逃逸基序”。對其序列檢測結(jié)果表明，抗體在VL結(jié)構(gòu)域的CDR1和CDR2環(huán)中也含有多堿基序列。IL-1β的成熟和分泌需要caspase-1的加工，而caspase-1又受炎癥小體的調(diào)節(jié)。Pro-IL-1β的等電點為4.6，Caspase-1去除高酸性N-末端117位殘基后，成熟IL-1β的等電點增加為8.8。此外，蛋白水解加工暴露了一個C-末端多堿基序列，這被證明是IL-1β分泌所必需的。
細(xì)菌TAT機(jī)制由三種蛋白質(zhì)組成：TatA、TatB和TatC。最關(guān)鍵的成分TatA是一種小分子膜蛋白，由疏水性α-螺旋和兩親性(多堿基)α-螺旋組成。疏水螺旋可插入質(zhì)膜，兩親性螺旋平行于質(zhì)膜內(nèi)葉，與質(zhì)膜相互作用。TatBC通過底物中高度保守的雙精氨酸基序(SRRxFLK)識別底物蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)需要TatA的寡聚作用。TatA通過促進(jìn)VBC介導(dǎo)底物蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，可能是在TatBC和底物的雙精氨酸基序的幫助下進(jìn)行的，現(xiàn)有文獻(xiàn)與這一假設(shè)是一致的。例如，TatA插入脂質(zhì)雙分子層會導(dǎo)致大的單層囊泡中的鈣黃綠素(一種熒光染料)“量化”、局部和暫時的泄漏。每次增加蛋白質(zhì)后，熒光都會達(dá)到一個新的平臺，直到增加更多的蛋白質(zhì)后才會進(jìn)一步增強(qiáng)。在沒有底物的情況下，TatABC均勻分布在質(zhì)膜上；當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合時，TatABC聚集成單個區(qū)域，與在CPP12(圖4)和DT誘導(dǎo)(圖5c)的VBC中觀察到的類似。
病毒
對病毒進(jìn)入細(xì)胞的研究同樣有助于對生物分子胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的新見解。有包膜的病毒通過其膜與內(nèi)體膜融合而逃離內(nèi)體，但對無包膜病毒逃離內(nèi)體的機(jī)制了解甚少。一般認(rèn)為，非包膜病毒必須破壞內(nèi)體膜才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三類主要的“膜溶解”病毒因子:兩性α螺旋結(jié)構(gòu)域(如腺病毒蛋白VI)、肉豆蔻酰化蛋白(如呼腸病毒N-肉豆蔻�；職さ鞍爪�1)和膜重構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域(如細(xì)小病毒VP1的磷脂酶A2結(jié)構(gòu)域)。目前還不清楚這些結(jié)構(gòu)不同的病毒因子是如何完成同樣的任務(wù)的：將直徑可能為∼100 nm且基本完整的病毒粒子從內(nèi)體釋放到胞漿中。作者認(rèn)為這三種病毒因子都通過誘導(dǎo)VBC促進(jìn)病毒的內(nèi)體逃逸。
對腺病毒來說，衣殼蛋白VI是病毒內(nèi)體逃逸的主要原因。Wiethoff等進(jìn)一步確定，蛋白VI的N端有一個20個氨基酸的兩親性α-螺旋，它在腺病毒物種中高度保守，是導(dǎo)致內(nèi)體逃逸的原因。這個肽以高親和力(表觀KD≈3μM)結(jié)合到GUVs的內(nèi)體膜成分上，誘導(dǎo)囊泡彎曲，并使GUV碎裂成更小的囊泡、管狀結(jié)構(gòu)和肽/脂質(zhì)聚集體，這些特征與CPP12類似。腺病毒進(jìn)入內(nèi)體后，會釋放多達(dá)360份拷貝的蛋白VI，這些蛋白與內(nèi)體膜結(jié)合，并誘導(dǎo)裝載病毒的囊泡萌出和瓦解。N-肉豆蔻�；職さ鞍爪�1負(fù)責(zé)呼腸孤病毒的內(nèi)體逃逸。該蛋白的N端41個氨基酸片段μ1N足以引起40 kDa的右旋糖酐從紅細(xì)胞中釋放出來。首先，通過插入到內(nèi)體膜，肉豆蔻酰基將病毒蛋白靶向到內(nèi)體膜上，并增加其與膜的結(jié)合親和力。其次，短的�；�(肉豆蔻�；幸粋�14碳鏈)插入腔內(nèi)膜產(chǎn)生正膜曲率(圖3c)，這是萌出頸部所需要的。μ1N的余下部分與內(nèi)體膜的相互作用可能引起膜的負(fù)曲率。
病毒PLA2是如何誘發(fā)VBC的呢？早期內(nèi)體的腔內(nèi)膜含有豐富的磷脂酰膽堿(PC)，其成分與質(zhì)膜外葉相似。PC的固有脂質(zhì)曲率為∼0，有利于層狀膜的形成。PC被PLA2水解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LPC)和脂肪酸。LPC有一個大的極性頭基和一個單一的碳?xì)滏湥?dāng)它插入到脂質(zhì)雙層中時，它促進(jìn)了膜正曲率(圖3c)。另一方面，脂肪酸會產(chǎn)生負(fù)曲率。因此，PLA2作用產(chǎn)生的脂質(zhì)分子，支持內(nèi)體膜上同時形成正彎曲和負(fù)彎曲，這是萌出頸部所需要的。病毒PLA2s在底物特異性上是混雜的，也能水解內(nèi)體膜上發(fā)現(xiàn)的其他磷脂。膜重塑酶的使用似乎是病毒細(xì)胞攝取和生命周期的一種常見策略，因為腺病毒利用宿主酸性鞘磷脂酶來實現(xiàn)快速的胞漿進(jìn)入。一些細(xì)菌蛋白毒素還利用磷脂酶A的活性來重塑宿主細(xì)胞的質(zhì)膜，以實現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)入。
合成藥物遞送系統(tǒng)
開發(fā)的許多人工系統(tǒng)能夠?qū)⑸锓肿舆f送到哺乳動物細(xì)胞中作為研究工具和治療方法。本文僅討論用于核酸遞送的多聚體、脂復(fù)合物和脂質(zhì)納米粒(LNP)。雖然其中一些遞送載體在臨床上取得了巨大成功，如用LNP遞送SARSCoV-2的mRNA疫苗，但對它們運(yùn)作機(jī)理的理解明顯滯后，這阻礙了具有高內(nèi)體逃逸效率的遞送工具的設(shè)計和開發(fā)，而這對于是治療應(yīng)用至關(guān)重要。
最近，研究人員利用先進(jìn)的活細(xì)胞共聚焦顯微鏡技術(shù)研究了多聚體、脂質(zhì)體和LNP的內(nèi)體逃逸。ur Rehman等發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)復(fù)合體和多聚體介導(dǎo)的siRNA遞送過程中，核酸和載體都是突然從內(nèi)體釋放出來，隨后核酸在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中迅速擴(kuò)散(圖6)。對于多聚體而言，從內(nèi)體觀察到核酸和載體的瞬時和完整的排出。這些觀察結(jié)果被認(rèn)為是質(zhì)子海綿效應(yīng)的直接證據(jù)。Wittrup等后來的一項研究證實了ur Rehman等的許多發(fā)現(xiàn)。然而，Wittrup等發(fā)現(xiàn)游離的siRNA，而不是完整的脂復(fù)合物或LNP被釋放到胞漿中，并且內(nèi)體逃逸是不完整的，這表明內(nèi)體并沒有完全破裂。他們進(jìn)一步觀察到，在許多情況下，siRNA的釋放與微小的胞質(zhì)Ca2+瞬變幅度一致。
Pei對ur Rehman和Wittrup的結(jié)果(以及其他文獻(xiàn)數(shù)據(jù))進(jìn)行分析，得出了另一種解釋和結(jié)論，即合成遞送系統(tǒng)通過誘導(dǎo)VBC逃離內(nèi)體。ur Rehman等人的研究表明，對于每一個破裂的囊泡，附近通常會有另一個囊泡在整個實驗過程中保持完整。事實上，圖6a中的兩個相鄰的囊泡(第3個圖片中的箭頭標(biāo)記)最初來自單個內(nèi)體(圖6a)。另一種解釋中，在實驗過程中保持完好的囊泡是萌出事件后的實際內(nèi)體，而破裂的“內(nèi)體”是萌出囊泡，隨后瓦解。Wittrup等觀察到的多步驟、部分siRNA釋放可能是來自同一內(nèi)體和/或不同內(nèi)體的多個VBC事件。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+瞬變是可以預(yù)期的，因為每次VBC事件都會導(dǎo)致小的內(nèi)體體積(包括Ca2+離子和任何不相關(guān)的貨物)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。
總結(jié)
作者通過實驗證明了線性CPP(Tat)、環(huán)狀CPP(CPP12)、非肽類CPM(CPM3)、AB類細(xì)菌蛋白毒素(DT)、單結(jié)構(gòu)域蛋白毒素(NleC)等5種結(jié)構(gòu)不同的生物分子可通過誘導(dǎo)VBC從內(nèi)體中逃逸到胞漿內(nèi)，相關(guān)文獻(xiàn)證據(jù)表明，多聚體、脂復(fù)合物和LNP也是通過相同的機(jī)制逃離內(nèi)體。
此外，其他細(xì)菌和真核蛋白以及無包膜病毒也可以通過VBC機(jī)制在細(xì)胞膜上的兩個方向轉(zhuǎn)運(yùn)。重要的是，VBC機(jī)制可以使許多以前困惑且矛盾的觀察結(jié)果得以調(diào)和而合理化�？傊�，VBC機(jī)制是一種全新且可能普遍存在的膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，其功能與已知的被動擴(kuò)散和能量依賴的分泌途徑是平行的。然而，VBC機(jī)制是否廣泛適用于不同的生物分子/系統(tǒng)還需要進(jìn)一步研究，并將確證的機(jī)制研究結(jié)果應(yīng)用于設(shè)計更有效的藥物輸送系統(tǒng)。
參考文獻(xiàn)：
DehuaPei.HowDo Biomolecules Cross the Cell Membrane? Acc. Chem. Res. 2022,55, 309-318.
