摘要 線粒體(mitochondrion)是真核生物細胞中的一種非常重要的細胞器,含有獨立于細胞核染色體外的遺傳物質,通過氧化磷酸化產生 ATP,是細胞的能量工廠,與細胞分化、信號轉導、代謝穩(wěn)態(tài)等過程密切聯(lián)系。線粒體功能的紊亂與癌癥、神經退行性疾病、糖尿病等許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療息息相關。線粒體在細胞命運中扮演的關鍵角色,使對線粒體這一特殊細胞器的探索成為生命科學研究熱點之一。人線粒體 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是一相對保守且僅 16 kb 的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子,只含 37 個基因,但這些基因都是維持線粒體功能穩(wěn)定必不可少的部分。隨著對線粒體功能認識的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn) mtDNA 突變,會導致活性氧自由基過量產生,從而引起細胞衰老,甚至引發(fā)諸多疾病,例如遺傳性視神經病變、線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征等。但是,目前針對這些線粒體基因疾病尚無非常有效的治療手段。為了進一步了解這一關鍵細胞器,研究人員開發(fā)了一些有效的方法來突破線粒體的復雜屏障。本文將重點介紹并討論近幾年靶向 mtDNA 的研究進展,主要從藥物修飾、材料遞送、基因編輯等方面進行了總結,希望能為推動線粒體的研究提供一些新的思路。
1 線粒體及線粒體 DNA
線粒體是一種廣泛存在于大多數(shù)真核細胞內的細胞器,通過氧化磷酸化產生 ATP,是細胞中的能量工廠。線粒體參與細胞分化、細胞信號傳遞和細胞凋亡等過程,擁有調控細胞生長和細胞周期的能力,在鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)、三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸代謝、氧化還原信號傳導等許多細胞活動中發(fā)揮重要作用[1-2]。這種獨特的細胞器由兩層膜組成:多孔的外膜及高度內皺的內膜。外膜較光滑,發(fā)揮細胞器界膜的作用;內膜由高密度飽和磷脂組成,相比細胞膜及線粒體外膜的蛋白質脂肪比(1 ∶1),線粒體內膜具有更高的比例(3 ∶1)[3]。并且,線粒體具有的高膜電位(Δψm 約為-180 mV),是線粒體功能狀態(tài)的重要參數(shù)之一。線粒體膜電位降低是細胞凋亡的早期預警。雙層膜結構及膜電位等這些線粒體生理特性,使物質穿透這兩層膜需要不同的轉運載體。有效排除大部分離子和分子的滲透,正是這種高度排他性保證了氧化還原所需質子梯度的穩(wěn)態(tài)環(huán)境[4]。
線粒體是一種半自主細胞器,擁有獨立于核基因存在的遺傳物質線粒體 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。一般每個線粒體中含有多組 mtDNA,不同物種的線粒體基因組大小不一。人 mtDNA 為長約 16 kb 的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子,編碼了 22 種 tRNA、2 種 rRNA 和 13 種線粒體氧化磷酸化相關的蛋白質(多肽),有重鏈(H)和輕鏈(L)之分,其中重鏈富含嘌呤, 輕鏈則以嘧啶為主[5]。與核基因組相比,mtDNA 分子量小,游離在高氧化還原的線粒體基質環(huán)境中,易因活性氧( reactive oxygen species,ROS)而受到損傷,又缺乏組蛋白的保護,因而,mtDNA 的突變率比核 DNA 高 10 ~ 20 倍[6,7]。mtDNA 具有高效復制性,主要通過堿基切除途徑修復,且自身修復系統(tǒng)相對單一低效,mtDNA 的準確復制和修復對細胞存活和繁殖至關重要[8,9]。
線粒體功能紊亂與神經退行性疾病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、肥胖和癌癥等都有著密不可分的聯(lián)系[10, 11]。相較于正常細胞,許多癌細胞的線粒體膜電位更高,活性氧濃度異常增加,這些差異為選擇性靶向癌細胞提供了基礎。同時,許多導致細胞凋亡的信號通路都聚集在線粒體中,通過改變線粒體的功能,可達到破壞這一能量工廠的效果。mtDNA 具有的裸露開放性和低效修復性,使其更易與抗癌藥物結合,導致 mtDNA 損傷,影響線粒體的功能,從而改變細胞的生存狀態(tài)。因此,將現(xiàn)有藥物進行線粒體靶向性修飾,以期通過損傷線體這一重要細胞器來誘發(fā)細胞死亡成為了近年來炙手可熱的研究方向[12]。
本文將著重討論幾種針對線粒體 DNA 的化學修飾藥物方法、藥物遞送材料以及基因編輯等手段的研究現(xiàn)狀。
2 線粒體靶向策略
線粒體的雙層膜結構使許多分子難以進入該細胞器。為了突破這道屏障,蛋白質與核基因編碼的線粒體靶向多肽序列 ( mitochondrial targeting sequence, MTS)連接,通過 TIM / TOM 復合物等膜通道定向轉運進入線粒體[4]。這段可切割的線粒體靶向信號多肽一般位于蛋白質 N 段,由 20 ~ 40 個帶正電荷的疏水氨基酸組成。目前,利用這一轉運機器,可將許多蛋白質遞送到線粒體并進行研究,例如限制性核酸內切酶、超氧化物歧化酶和凋亡誘導蛋白質等。但該方法仍難以克服例如因MTS 的疏水性導致的蛋白質異常折疊問題、轉運機制缺陷等問題。
這些小分子靶向定位基團的發(fā)現(xiàn),極大地推動了線粒體靶向藥物的研究。然而,目前報道的大部分線粒體定位基團聚焦在線粒體內膜中。開發(fā)新的線粒體定位基團,使其靶向線粒體其他部位有助于對線粒體更進一步的了解。
3 藥物修飾
破壞癌細胞核內基因是化療藥物的作用機制之一。然而,癌細胞分裂增殖速度比正常細胞快,且極易產生藥物抗性,導致藥物失效。線粒體,類似于細胞核,同樣擁有自身的遺傳物質。因此,研究人員逐漸將目標轉向帶有 DNA 的線粒體,通過靶向修飾將藥物富集于線粒體,破壞 mtDNA,從而導致癌細胞的快速凋亡。將藥物與線粒體定位基團綴合形成復合物,將抗癌化合物遞送到線粒體基質。在線粒體中,藥物濃度迅速達 100 ~ 500 倍,從而有效作用于mtDNA,是現(xiàn)有最普遍并實用的方法。
4 納米材料遞送
目前,除了 PLGA,已經開發(fā)了許多應用于靶向線粒體藥物遞送的納米載體,包括石墨烯和納米膠束等。主要原理是藥物通過吸附或共價連接到載體上,載體表面進行線粒體靶向修飾,實現(xiàn)將藥物直接靶向至線粒體,并發(fā)揮更好的療效。然而,很多納米遞送材料的生物安全性、生物相容性和生物降解性仍有待優(yōu)化[27-29]。
新加坡國立大學 Yao SQ 課題組設計合成了一種可降解的硅納米粒子。納米粒子由含有二硫鍵單體構建,可在胞內谷胱甘肽的作用下發(fā)生斷裂降解,從而釋放粒子內包裹的生物大分子。該方法有效遞送抗體、蛋白質、siRNA 等生物大分子,為線粒體藥物的開發(fā)提供新策略[32, 33]。
5 基因編輯
目前,基因編輯技術已從最初細胞自然發(fā)生的同源重組,發(fā)展到幾乎可在任意位點進行靶向切割,為治療 mtDNA 突變引起的線粒體疾病帶來了曙光。2013 年,美國邁阿密大學的 Carlos T. Moraes 及其同仁,將轉錄激活因子樣效應物核酸酶 TALEN(mitochondrial-targeted TALEN, MitoTALEN) 編輯工具引入到線粒體定位靶向序列,使其在翻譯后定位轉運到線粒體,對 m.5024C>T 突變位點靶向結合并切割,使得突變的 mtDNA 斷裂降解[36]。以這種方式處理后,注射到攜帶突變小鼠中。6 個月后,小鼠肌肉組織 mtDNA 突變率下降 50%,大部分突變基因被清除。同時,英國劍橋大學 M. Minczuk 課題組,同樣利用腺相關病毒(AAV9. 45) 將含有線粒體定位的鋅 指 核 酸 酶 ( mitochondrially targeted zinc-fingernuclease, mtZFN,另一種基因編輯方式)轉運入線粒體,并成功將心,血管組織中的 mtDNA 突變率降低了約 40%[37]。最近,CRISPR 基因編輯技術對細胞核 DNA 編輯方面取得了快速進展。該技術的易設計、便操作、高效率等優(yōu)點使它成功運用在許多生物學領域。然而,線粒體的雙層膜結構使得高負電性的向導 RNA( gRNA)難以進入線粒體基質,同時線粒體內部 DNA 修復機制并不成熟,阻礙了 CRISPR基因編輯技術在 mtDNA 中的應用[38-40]。近期,中國科學院重慶綠色智能技術研究院裴得勝課題組,利用 CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)將雙鏈 DNA 插入了斑馬魚線粒體基因組,實現(xiàn)了插入后的線粒體基因的 F0 到F1 的傳遞,這也為針對 mtDNA 的基因編輯帶來了曙光[41]。近期,Broad 研究所 David Liu 團隊和華盛頓大學 Mougous 團隊,開發(fā)利用了伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cenocepacia)產生的酶,衍生了不依賴于 CRISPR 系統(tǒng)的線粒體堿基編輯器,顯著減少了攜帶 mtDNA 突變的比例[42]。雖然基因編輯技術距離臨床應用仍有很長的路,但為開發(fā)針對 mtDNA 疾病的基因療法提供了非常有潛力的工具。
此外,RNA 干擾技術,例如小型干擾 RNA、小發(fā)夾 shRNA 等,通過阻礙特定基因的轉錄或翻譯抑制基因的表達,目前已有 10 個 RNA 藥物批準上市,且有超過 50 個 RNA 藥物處于臨床試驗中,這種技術已然成為研究基因功能的強大工具[43,44]。2020 年,加州大學圣地亞哥分校付向東及中國科學院生物物理研究所張曉榮課題組,共同報道了利用體外 RNA導入,Clickin 技術將 siRNA 導入線粒體中,系統(tǒng)地研究了該技術對 13 個 mtRNA 編碼蛋白質轉錄影響,初 步 證 實 了 線 粒 體 內 部 RNAi 干 擾 的 可 能性[45]。同時,也有研究表明,線粒體中存在一些小RNA 和 RNA 的修飾,這也為疾病的療法提供了新的手段和靶點[46, 47]。
6 問題與展望
線粒體是細胞內獨特的細胞器,參與細胞能量代謝、凋亡等許多重要的生命活動。線粒體由于自身含有遺傳物質 mtDNA,將核 DNA 藥物遞送至線粒體,并通過結合 mtDNA,這一過程具有強大應用潛力。目前,線粒體靶向藥物研究領域取得了一定的進展,但由于線粒體 mtDNA 的特性,對線粒體疾病的基因治療要比核基因更復雜,更具有挑戰(zhàn)性。相信隨著交叉研究的不斷深入,對線粒體的功能了解必定會拓寬生命健康領域的發(fā)展,為病癥開發(fā)提供更有效、更安全的治療方法[48-50]。
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