摘要:目的 評(píng)價(jià)基于噬菌體展示技術(shù)的羥基磷灰石結(jié)合肽的解吸附特征。方法采用成品羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)作為結(jié)合底物,通過(guò)X射線衍射(X-raydiffraction,XRD)對(duì)其進(jìn)行物相鑒定,提取噬菌體 DNA 測(cè)序讀取展示肽 的 序 列,擴(kuò)增制備目標(biāo)序列YSLHWGE(YSL)的 單 克 隆 儲(chǔ) 液,以肽庫(kù)中隨機(jī)挑選的序列 VTDSKPK(VTD)為陰性對(duì)照;滴度測(cè)試測(cè)定投入回收比,免疫熒光法驗(yàn)證目標(biāo)序列的標(biāo)靶親和力。參照標(biāo)準(zhǔn)淘選方案,在不同pH 值(7.5、6.5、5.5、4.5)緩沖洗脫液中分析目標(biāo)序列的解吸附特征。結(jié)果 YSL和 VTD 的單克隆儲(chǔ)液擴(kuò)增后滴度均達(dá)到1011pfu/10μL,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。測(cè)序結(jié)果得到目標(biāo)序列和隨機(jī)序列分別為 YSL和 VTD。通過(guò)重復(fù)3次滴度測(cè)試計(jì)算投入回收比發(fā)現(xiàn),目標(biāo)序列 YSL與 HAP的親和度較高,投入回收比為隨機(jī)肽 VTD投入回收比的17.5倍。這種結(jié)合親和力也通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證,結(jié)果顯示 YSL組羥基磷灰石粉末被熒光點(diǎn)亮的面積比例和平均吸光度分別為(71.98±2.30)% 和 (0.10090±0.00544),均 顯 著 高 于 VTD 組 的 (49.95±2.28)% (P<0.01)和 (0.04637±0.00117)(P<0.01);發(fā)現(xiàn)在不同pH 值環(huán)境中,YSL解吸附釋放的噬菌體數(shù)量占原吸附總量的比例均高于隨機(jī)肽 VTD解吸附的比例(P<0.01)。結(jié)論 羥基磷灰石結(jié)合肽序列 YSLHWGE 對(duì)結(jié)合底物羥基磷灰石有較好的親和力且具有一定的隨環(huán)境pH 值變化的緩釋能力。
羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)是人類骨組織和牙齒等天然硬組織組成部分中最穩(wěn)定的磷酸鈣,其具有優(yōu)異的理化、生物性能,能與有機(jī)成分特異性結(jié)合[1]。而羥基磷灰石結(jié)合肽(hydroxyapatitebindingpeptides,HABPs)是 指 能 識(shí) 別 并 結(jié) 合 于HAP表面的生物活性肽。不少研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)鑒定 HABPs,并研究其體外結(jié)合親和力[2-3]。眾所周知,HAP主要由Ca2+ 、PO43- 組成,具有兩性離子的特征,靜電引力是導(dǎo)致 HAP 與蛋白質(zhì)之間發(fā)生吸附最主要的一種作用力,而蛋白質(zhì)分子往往帶有一定量的電荷,所以 pH 值是一項(xiàng)重要的生理環(huán)境參數(shù),對(duì)蛋白質(zhì)在 HAP 表面的吸附具有重要影響[4]。我們前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)淘選目標(biāo)HABPs時(shí)獲得了一系列理想的 HAP結(jié)合序列,因體外合成成品 HABPs成本高、周期長(zhǎng),我們嘗試?yán)?M13噬菌體作為載體以噬菌體展示狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本文報(bào)道了其中一條與 HAP特異性結(jié)合力較好且解 吸 附 特 征 對(duì) 外 界 環(huán) 境 pH 值 改 變 敏 感 的HABPs序列 YSLHWGE(YSL),利用這種特質(zhì)可結(jié)合抗菌藥物制備口腔植入物的表面涂層,其可隨著口腔唾液pH 值改變釋放抗菌藥物,起到控制牙菌斑的效果,具有一定的臨床應(yīng)用前景。
1 材料與方法
羥基磷灰石生物陶瓷 HAP(四川大學(xué)生物材料工程研究中心);X 射線衍射儀(德國(guó) BrukerAXS,D8-Focus);倒 置 熒 光 顯 微 鏡 (OLYMPUS,TH4-200,日本 TOKYO);搖床(天呈,T-100C);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏,DNP-9082);生物安全柜(蘇州智凈,BHC1300 ⅡA/B2型);數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華,HH-4);超聲波清洗機(jī)(新芝生物科技股份有限 公 司,SB-3200DTD );pH 計(jì) (奧 豪 斯,STARTER3100)。
1.3 單克隆噬菌體儲(chǔ)液的制備及其展示肽序列的測(cè)定
利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì) HAP 進(jìn)行篩選,經(jīng)多輪生物淘選和選擇、噬菌體擴(kuò)增獲得多組具有不同底物親和力的多肽序列,其中 YSLHWGE(YSL)通過(guò)滴定測(cè)量回收后的噬菌體數(shù)量顯示對(duì) HAP的結(jié)合親和力較高用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取目標(biāo)序列(YSL)和隨機(jī)序列 VTDSKPK(VTD)甘油存樣各1μL,梯度稀釋到合適的倍數(shù),于IPTG/Xgal藍(lán)白篩選平板上培養(yǎng)。取單個(gè)藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)試擴(kuò)增液滴度并提取噬菌體 DNA 測(cè)序 (QIAprepSpin M13,NewEnglandBiolabs,USA)以確定產(chǎn)物序列的準(zhǔn)確性。
將載有目標(biāo)序列 YSL 或隨機(jī)序列 VTD 的單克隆噬菌體分別與 HAP 結(jié)合,通過(guò)滴定測(cè)量回收后的噬菌體數(shù)量,計(jì)算最初投入的噬菌體與回收液的噬菌體之間的比值以評(píng)價(jià)這2個(gè)結(jié)合肽序列對(duì)HAP的結(jié)合親和力。隨著噬菌體與底物結(jié)合親和力的提高,噬菌體的投入回收比值變大。
1.4.1 載有 YSL或 VTD的單克隆噬菌體與 HAP結(jié)合 配制pH=8.5的 TBST 緩沖液[含0.15(V/V)吐溫20]用于本實(shí)驗(yàn)。依照常規(guī)洗脫方案,將底物 HAP依次使用去離子水、無(wú)水乙醇、去離子水超聲振蕩5min后高溫高壓滅菌40min,再置于90℃10%氫氧化鈉溶液中浸泡1h后使用大量去離子水清洗 HAP 至 中 性,加 入 10 mL TBST 緩 沖 液 中37℃溫 和 搖 床 過(guò) 夜,吸 取 過(guò) 夜 液 體 加 入 封 閉 液 1mL,37℃ 溫 和 搖 床 封 閉 1h,吸 取 封 閉 液 后 使 用TBST 緩沖液清洗 HAP 數(shù)次,分別于管中投入等量1.2×1011pfu的目標(biāo)肽序列 YSL 及隨機(jī)肽序列VTD單克隆噬菌體,37℃溫和搖床進(jìn)行孵育1h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體,然后用10mL新鮮配置的 TBST 緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體,加入非特異性緩沖液1mL37℃溫和搖床10min后加入150μLTris-HCl緩沖液。通過(guò)滴度測(cè)試測(cè)得目標(biāo)肽序列 YSL 和隨機(jī)肽序列 VTD 用非特異性洗脫液洗脫的滴度結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.4.2 單克隆噬菌體滴定測(cè)試 挑選目標(biāo)序列和隨機(jī)序列的 LB/Tet培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)的宿主菌 ER2738的單克隆菌斑,于含10μL 四環(huán)素的10mLLB培養(yǎng)液中37℃劇烈振蕩6~8h培養(yǎng)至感染狀態(tài)備用。同期微波融化頂層瓊脂后分裝于新鮮滅菌的離心管中,48℃溫浴備用。將待滴度測(cè)試的噬菌體用 LB培養(yǎng)液做適當(dāng)?shù)南♂尯蠹尤刖嚎焖倩靹虻谷胄迈r配置的 LB/IPTG/Xgal平板,室溫靜置3min后倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)37℃過(guò)夜培養(yǎng)。外膜蛋白上含有展示肽噬菌體能在 LB/IPTG/Xgal平板上形成藍(lán)色的噬菌斑。
計(jì)算大約含有100個(gè)噬菌體計(jì)數(shù)平板上藍(lán)色噬菌體的數(shù)量,按照下列公式計(jì)算噬菌體的滴度:噬菌體的滴度(pfu/10μL)=藍(lán)色噬菌斑數(shù)量×稀釋因子
通過(guò)免 疫 熒 光 技 術(shù) 再 次 驗(yàn) 證 2 種 結(jié) 合 肽 與HAP的親和力。取等量 HAP 粉高壓滅菌消毒備用。用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothioc)標(biāo) 記 的 抗 M13 單 克 隆 抗 體 (RLyanate,ph2,sc-53005FITC)對(duì)結(jié)合于 HAP 表面的噬菌體進(jìn)行標(biāo)定,對(duì) M13噬菌體-HABPs的親和力進(jìn)行半定量分析[5]。實(shí)驗(yàn)組分別為投入等量的目標(biāo)肽序列和隨機(jī)肽序列,以不加任何肽序列作為空白對(duì)照組,同時(shí)暴露于1mLPBST 緩沖液2h,溫和搖床。吸走目標(biāo)序列組和隨機(jī)肽序列組未結(jié)合的噬菌體后,3組樣本同時(shí)加入200μLFITC 標(biāo)記的抗噬菌體外殼蛋白pVⅢ的抗 M13單克隆抗體避光溫育1h,最后用新鮮配置的 PBST 緩沖液洗滌5次。依次將等量粉末懸浮液轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上,使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,使用ImageJ軟件大致計(jì)算噬菌體顆粒表面被熒光覆蓋面積,將熒光圖像中噬菌體的覆蓋面積與白光下圖像中粉末的近似表面積進(jìn)行比較[6],得到粉末被熒光點(diǎn)亮的面積比值(熒光視野下的噬菌體覆蓋面積/白光視野下的粉末面積)和其平均吸光度(A)值。
1.6 環(huán)境pH 值變化對(duì) HABPs解吸附行為的影響
為了測(cè)定目標(biāo)肽序列 YSL與隨機(jī)肽序列 VTD在不同pH 值 TBST 緩沖液浸泡洗脫1h后的解吸附性能,配制 pH 值為8.5、7.5、6.5、5.5和4.5的TBST 緩沖液(含0.15[V/V]吐溫20),依照常規(guī)洗脫方案,將底物 HAP 依次使用去離子水、無(wú)水乙醇、去離子 水 超 聲 振 蕩 5 min 后 高 溫 高 壓 滅 菌 40min,再置于90℃ 10%氫氧化鈉溶液中浸泡1h后使用大量去離子水清洗 HAP 至中性,加入10mLpH=8.5TBST 緩沖液中37℃溫和搖床過(guò)夜,吸取過(guò)夜液體加入封閉液1mL,37℃溫和搖床封閉1h,吸取封 閉 液 后 使 用 pH=8.5 TBST 緩 沖 液 清 洗HAP數(shù)次,分別于管中投入等量2×1010pfu的目標(biāo)肽序列 YSL及隨機(jī)肽序列 VTD 單克隆噬菌體,37℃溫和搖床進(jìn)行孵育1h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體,然后用10mL新鮮配置的pH=8.5TBST 緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體,再換新鮮配置的1150μLpH=7.5TBST 緩沖液浸泡1h后回收全部液體,再依次換用新鮮配置的1150μLpH 為6.5、5.5、4.5的 TBST 緩沖液重復(fù)上述操作回收浸泡液,最后再用1150μL 非特異性洗脫液洗脫并回收終末洗脫液。通過(guò)滴度測(cè)試測(cè)得目標(biāo)肽序列 YSL和隨機(jī)肽序列 VTD 在這4組pH 值(7.5、6.5、5.5、4.5)TBST 緩沖液浸泡洗脫1h后回收液及終末非特異性洗脫液的滴度結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)分析均使用 GraphPadPrism6.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)的非配對(duì)雙側(cè)檢驗(yàn)分析均值之間的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
從 HAP的 XRD 圖結(jié)果可得其與羥基磷灰石的(002)、(112)、(300)和(202)晶面的特征吸收峰匹配良好,表明粉末主要物相為羥基磷灰石。
YSL 和 VTD 噬 菌 體 投 入 回 收 比 結(jié) 果 顯 示,YSL噬菌體回收率為 VTD 噬菌體回收率的 17.5倍,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0027),表明 YSL對(duì)底物 HAP具有較強(qiáng)結(jié)合力。
為分析 YSL和 VTD于不同pH 值緩沖液中在HAP表面的解吸附行為,我們對(duì)比兩者在新鮮配置的pH=7.5、6.5、5.5、4.5TBST 緩沖液中依次浸泡1h 后 各 回 收 液 的 滴 度 測(cè) 試 結(jié) 果 (圖 2),發(fā) 現(xiàn)YSL在各pH 值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量占原吸附總量的比例均明顯高于 VTD(均P<0.05),表明在相同pH 值緩沖液中 YSL較 VTD有明顯的解吸附行為。同時(shí)我們還注意到,YSL 在不同 pH 值緩沖液洗 脫 下 釋 放 的 噬 菌 體 數(shù) 量 也 有 差 異 (P<0.05),表明其對(duì)生理環(huán)境pH 值的改變反應(yīng)敏感且明顯。在pH=6.5緩沖液洗脫下釋放的噬菌體數(shù)量最多,而后隨著緩沖液pH 值降低,回收液中的噬菌體數(shù)量逐漸減少。而 VTD 在不同 pH 值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量無(wú)明顯差別。
3 討論
HAP作為一種重要的生物醫(yī)學(xué)材料,在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,因其自身的復(fù)雜性使得其與多肽之間的作用機(jī)制一直都是該領(lǐng)域的研究難點(diǎn)。隨著以噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)與展示技術(shù)為代表的生物文庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn),這一高通量的篩選與平臺(tái)技術(shù)為研究 HAP等生物材料與多肽相互作用的機(jī)制提供了可能和便利條件[7]。大部分研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得理想的肽序列之后往往會(huì)通過(guò)體外合成成品 HABPs進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),但人工合成 HABPs往往存在成本高、周期長(zhǎng)的問(wèn)題,而噬菌體展示狀態(tài)下的肽序列因噬菌體自身可增殖的生物特征可通過(guò)擴(kuò)增的方法不斷重復(fù)獲得,具有成本低且周期短的優(yōu)勢(shì)。本研究直接使用通過(guò)噬菌體展示技術(shù)分離得到的一條對(duì) HAP表面有較強(qiáng)親和力的新七肽序列YSLHWGE(即 HABPs),通過(guò)噬菌體滴度測(cè)試和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定出該序列較隨機(jī)肽序列與 HAP底物有更強(qiáng)的結(jié)合力。再利用不同pH 值的 TBST緩沖液(pH=7.5、6.5、5.5、4.5)作為洗脫液依次浸泡1h,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列 YSL 較隨機(jī)肽序列 VTD 更容易受環(huán)境pH 值變化發(fā)生解吸附行為,具有一定的緩釋能力。基于這一系列結(jié)果我們嘗試探討該結(jié)合肽序列有較高親和力且具有敏感解吸附特征的原因,以期為深入理解蛋白在 HAP 表面的吸附行為提供參考。
HAP的表面很復(fù)雜,目前我們得知 HAP等電點(diǎn)在pH=7左右,整體上偏中性,同時(shí)表面帶有電荷[8]。而蛋白 質(zhì) 的 HAP 界 面 吸 附 是 一 個(gè) 十 分 普遍、非常復(fù)雜而又極其重要的現(xiàn)象,受材料和蛋白質(zhì)的自身性質(zhì)以及溶液環(huán)境等內(nèi)外因素綜合影響,其主要驅(qū)動(dòng)力包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力等。除了蛋白質(zhì)多肽鏈段上的自由氨基和羧基基團(tuán)被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)界面吸附的主要因素外,蛋白質(zhì)多肽鏈段的氨基酸組分和序列也被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)的界面吸附有主導(dǎo)作用[9]。同時(shí)有研究表明,吸附體系中 pH 值的改變能夠調(diào)節(jié) HAP 的表面電荷量,進(jìn)而改變 HAP 與蛋白質(zhì)分子之間靜電作用的類型和強(qiáng)度[10]。
HAP表面有2種不同類型的結(jié)合位點(diǎn),分別為帶正電的 C位點(diǎn)(富含鈣離子)和帶負(fù)電的 P 位點(diǎn)(富含磷酸根離子),被認(rèn)為是蛋白質(zhì)在 HAP 表面的結(jié)合位點(diǎn)并提供蛋白質(zhì)吸附的主要驅(qū)動(dòng)力;其中蛋白質(zhì)的羧基基團(tuán)和氨基基團(tuán)分別結(jié)合帶正電荷的C位點(diǎn)和帶負(fù)電荷的 P位點(diǎn),C 位點(diǎn)對(duì)負(fù)電荷的親和力比 P位點(diǎn)對(duì)正電荷的親和力更強(qiáng)。除此以外,酸性氨基酸基團(tuán)能夠強(qiáng)烈地結(jié)合 HAP表面的鈣離子,這也是大多數(shù)富含 γ-羧基化谷氨酸、聚谷氨酸以及磷酸化氨基酸等酸性氨基酸基團(tuán)的非膠原類蛋白質(zhì)或多肽可參與礦化過(guò)程的原因[10]。同時(shí),除靜電力外,疏水相互作用是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表面親和力增加的另一個(gè)重要途徑。一般來(lái)說(shuō),疏水表面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用比中性荷電的親水表面強(qiáng),因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的兩親結(jié)構(gòu)中存在疏水的殘基結(jié)構(gòu),通過(guò)疏水作用使蛋白質(zhì)傾向于吸附在疏水表面[11]。因此具有疏水性的 HAP 本身對(duì)蛋 白 質(zhì) 就 有 一 定 的 吸 附 能力。而經(jīng)研究鑒定出來(lái)的目標(biāo)肽序列 YSLHWGE與隨機(jī)序列 VTD相比較含有酸性氨基酸 Glu(谷氨酸)且位于序列末端,意味著序列末端有2個(gè)羧基能與 HAP中 C位點(diǎn)的 Ca2+ 多一個(gè)相結(jié)合的位點(diǎn),同時(shí)目標(biāo)肽序列 YSL 其親水性平均系數(shù)(GRAVY)大于隨機(jī)組 VTD,意味著目標(biāo)肽序列 YSL 親水性小于隨 機(jī) 組 VTD,與 HAP 的 疏 水 作 用 更 強(qiáng)。此外,有報(bào)道表明,較大的蛋白質(zhì)有更多的結(jié)合位點(diǎn)與底物表面相互作用[11]。因此,較大的分子有可能被更多地吸附在表面上。所以從分子量對(duì)比,YSL 可能比 VTD有更多的結(jié)合位點(diǎn),以上這些都有可能是 YSL較 VTD對(duì) HAP親和力更強(qiáng)的原因。
生理環(huán) 境 是 影 響 蛋 白 質(zhì) 吸 附 的 重 要 因 素,而pH 值是影響生理環(huán)境中電學(xué)性能的重要參數(shù)。研究表明,pH 值的降低會(huì)增加酸性蛋白的吸附。之前很多研究表明在不同 pH 值環(huán)境下,HAP 表面Zeta電位均為負(fù)電位[12],同時(shí)有報(bào)道表明,HAP顆粒對(duì) BSA 的吸附能力隨 pH 值增大而減弱[10]。原因是隨著體系pH 值增大,溶液中 OH- 濃度增大,HAP表面吸附 OH- 逐漸增多;而 BSA 蛋白分子等電點(diǎn)為4.7,在 pH>pI時(shí)帶負(fù)電荷,HAP 與 BSA之間存在靜電斥力,使 BSA 分子難以擴(kuò)散到 HAP微粒表面發(fā)生吸附,導(dǎo)致 BSA 在 HAP表面的吸附量逐漸減小。我們研究的 YSL 與 BSA 情況相似,等電點(diǎn)為5.14,所以當(dāng)用pH 大于pI的 TBST 浸泡1h后,YSL因緩沖液中 OH- 濃度不同程度的增加從而帶有不等量的負(fù)電荷,與 HAP 存在靜電斥力而發(fā)生解吸附行為,導(dǎo)致釋放在浸泡回收液中噬菌體數(shù)目增多。當(dāng)用pH 值(4.5)小于pI的 TBST 緩沖液浸泡1h時(shí),YSL帶有少量正電荷,與 HAP之間發(fā)生靜電引力,因此對(duì) YSL 的吸附量逐漸增加,此時(shí)釋放到溶液中的噬菌體數(shù)量明顯減少。此外,HAP的溶解度也是影響溶液性能的重要參數(shù)。研究表明[13],HAP在緩沖液 pH 值降低過(guò)程中會(huì)伴HAP的溶解,隨著酸性加強(qiáng),H+ 增多,HAP 的溶解量隨 之 加 大,大 量 的 羥 基 發(fā) 生 脫 離 并 停 留 在HAP附近,加上 Ca2+ 的遠(yuǎn)游破壞電中性以及磷酸根基團(tuán)的脫離,使得 HAP表面 Zeta電位仍呈負(fù)電性,隨著酸性再增加,脫離的羥基、磷酸基團(tuán)和 Ca2+數(shù)量進(jìn)一步增加,則Zeta負(fù)電位絕對(duì)值又將有所增大。所以這兩方面機(jī)制使得吸附于 HAP表面帶有目標(biāo)肽序列 YSL 的噬菌體數(shù)量隨著 pH 值降低而減少。
因此,我們可以利用這種解吸附特征隨生理環(huán)境pH 值改變的 HABPs序列與某些抗菌物質(zhì)相結(jié)合用作口腔植入物的表面涂層,在口腔唾液因進(jìn)食等生理活動(dòng)變化導(dǎo)致pH 值改變時(shí)可釋放該抗菌復(fù)合物,起到控制菌斑的效果,這將具有一定的臨床應(yīng)用前景。
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