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抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用及在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用
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摘 要: 目的 探究抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用, 并進(jìn)一步分析抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用。方法 以蠟樣芽胞桿菌為研究對(duì)象, 通過測(cè)定抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone, DIZ)、最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)評(píng)價(jià)抗菌肽cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果。通過分析生長曲線、細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、膜電位、內(nèi)容物滲出和細(xì)胞形態(tài)的變化, 來揭示可能的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上, 并探究抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳貯藏中的應(yīng)用。結(jié)果 當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度為 10 μg/mL 時(shí), 其對(duì)蠟樣芽胞桿菌的 DIZ 為(16.19±1.29) mm; 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的 MIC、MBC 分別為 4 μg/mL 和 8 μg/mL; 當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度為 2 MIC 時(shí), 蠟樣芽胞桿菌幾乎不生長; 抗菌肽 cp1 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) ATP 含量降低, 細(xì)胞膜超極化, 細(xì)胞液(包括核酸和蛋白質(zhì))漏出, 細(xì)胞形態(tài)破壞; 在巴氏殺菌乳中添加 1 MIC 抗菌肽 cp1 對(duì)乳感官均無顯著影響, 且 4℃條件下抗菌肽cp1 可有效抑制蠟樣芽孢桿菌的生長, 將其保質(zhì)期至少延長到 12 d。結(jié)論 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果, 具有延長巴氏殺菌乳貨架期的潛力。


巴氏殺菌乳因其滅菌溫度低能更好地保留營養(yǎng)物質(zhì), 具有保健功能而受到世界各國的普遍關(guān)注[1]。然而, 在加工、生產(chǎn)和儲(chǔ)存階段容易受到微生物污染, 特別是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。2022 年, 美國乳制品科學(xué)協(xié)會(huì)報(bào)道了因原料奶中細(xì)菌孢子在巴氏滅菌過程中并未殺滅, 導(dǎo)致了一半的液態(tài)奶變質(zhì)[2]。ZHAO 等[3]從中國 500 份乳制品中分離出 54 株蠟樣芽孢桿菌, 經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方奶粉占比 14%、原料奶占比 26%、巴氏殺菌奶占比 24%、超高溫奶占比 16%、奶酪占比 20%。前人研究表明, 受蠟樣芽胞桿菌污染的乳制品中產(chǎn)生了熱不穩(wěn)定的腹瀉流變性毒素和熱穩(wěn)定的嘔吐毒素, 這些毒素會(huì)引起腹瀉和嘔吐的綜合癥[4‒6]。同時(shí), 蠟樣芽胞桿菌分泌的蛋白酶和脂肪酶分解乳制品中營養(yǎng)物質(zhì), 導(dǎo)致食物腐敗進(jìn)而縮短貨架期[7]。因此, 減少牛奶和相關(guān)產(chǎn)品被病原微生物尤其是蠟樣芽胞桿菌污染, 是保障乳制品食品安全的迫切需要。


巴氏殺菌對(duì)芽孢菌的殺滅率低, 國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在市售的巴氏殺菌乳中仍有未滅活的蠟樣芽胞桿菌, 所產(chǎn)生的毒力因子威脅人類健康[8‒11]。目前, 奶制品普遍采用熱殺菌技術(shù), 但過高的溫度會(huì)破壞牛奶中熱敏性營養(yǎng)成分, 因此在溫和殺菌方式下, 結(jié)合良好的生物防腐劑來延長牛奶貨架期是液態(tài)奶加工新技術(shù)的重心[12]。相關(guān)研究表明, 抗菌肽因廣譜抗菌性強(qiáng)、作用靶點(diǎn)準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高且不易殘留等特點(diǎn), 被醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)和食品加工業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域所關(guān)注[13]。其中, 乳酸鏈球菌素(nisin)作為一種典型的抗菌肽代表, 因其抑制腐敗細(xì)菌和致病菌的效果突出, 且不會(huì)對(duì)產(chǎn)品物理化學(xué)特性造成顯著的影響而被廣泛應(yīng)用于原料乳和巴氏殺菌乳中[14‒15]。抗菌肽可以預(yù)防多種致病菌感染, 目前已有大量報(bào)道表明抗菌肽對(duì)蠟樣芽胞桿菌有明顯的抑菌效果[16‒17]。LEE 等[18]在 1989 年首次從豬小腸的寄生蟲中分離得到抗菌肽 cp1, 該肽的氨基酸序列為SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAQGGPR, 分子質(zhì)量為3339 Da。李倫鋒[19]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽 cp1 對(duì)食源性病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、沙門氏菌)均具有較強(qiáng)的抑菌效果, 且具有低毒性, 并應(yīng)用于鮮牛奶保鮮中, 但并未對(duì)抑菌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。目前關(guān)于抗菌肽cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制作用鮮有報(bào)道。基于此, 本研究以蠟樣芽孢桿菌為指示菌, 探討抗菌肽 cp1 對(duì)其抑菌作用機(jī)制, 并研究抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的實(shí)際抑菌效果, 為抗菌肽 cp1 在液態(tài)奶中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。


1 材料與方法


1.1 材料與試劑
抗菌肽 cp1 ; 蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus ATCC 14579)購自 ATCC 美國典型生物資源保藏中心。

營養(yǎng)肉湯(luria-bertani, LB)、瓊脂(生物試劑, 青島海博生物科技有限公司); 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所); 雙 1,3-二巴比妥酸-三次甲基氧烯洛爾[bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol, BiBAC4(3)](上海懋康生物科技有限公司); 二甲基亞砜(分析純, 湖南九典化工科技有限公司); 無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS, 北京索萊寶科技有限公司); 考馬斯亮藍(lán) R250(分析純, 伊默克化工有限公司); 戊二醛(分析純, 安徽金粵冠新材料科技有限公司); 無水乙醇(分析純, 南通恒軒化工有限公司)。


1.2 儀器與設(shè)備

BKQ-B50II 高壓蒸汽滅菌鍋(山東博科消毒設(shè)備有限公司); GZP-450Y 生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); 5418R 高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司); SynergyHTX 多功能酶標(biāo)儀(美國 BioTek 公司); FDU-2110冷凍干燥機(jī)(日本東京理化器械株式會(huì)社); VEGA3 掃描電子顯微鏡(上海泰斯肯貿(mào)易有限公司)。


1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 蠟樣芽胞桿菌菌懸液制備
取活化好的菌液 1 mL 接種到 100 mL 的 LB 液體培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng) 8 h, 得到對(duì)數(shù)期原菌液備用。將原菌液在4℃、5000 r/min 條件下離心 10 min, 收集菌泥用無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)調(diào)整菌液, 通過平板計(jì)數(shù)法得到具體菌落總數(shù), 在 600 nm 下測(cè)定吸光度, 使得菌懸液的吸光度 OD600 nm為 0.45(約 106 CFU/mL)。
1.3.2 抑菌圈直徑的測(cè)定

根據(jù)CHANG等[20]的方法, 利用牛津杯法測(cè)量抗菌肽cp1對(duì)蠟樣芽胞桿菌抑菌圈。取 100 μL 蠟樣芽胞桿菌(106 CFU/mL)均勻涂布到 LB 培養(yǎng)基上, 并在每個(gè)平板中用消過毒的鑷子放置 3 個(gè)滅好菌的牛津杯(外徑 8 mm、內(nèi)徑 6 mm、高10 mm), 再輕輕按壓。然后將 100 μL 抗菌肽 cp1 水溶液(10 μg/mL)加入每個(gè)牛津杯中, 37℃下培養(yǎng) 24 h。最后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone, DIZ)。


1.3.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

參照 FEI 等[21]的方法利用肉湯微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC), 向無菌的 24 孔板中加入滅菌后 LB 培養(yǎng)基, 并添加抗菌肽使其質(zhì)量濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL。取 2 μL的 106 CFU/mL蠟樣芽胞桿菌菌懸液至已凝固的 24孔板中, 37℃培養(yǎng) 24 h, 將肉眼下觀察不到蠟樣芽胞桿菌生長的最低的抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度作為 MIC 值。將 100 μL 的蠟樣芽胞桿菌菌懸液(106 CFU/mL)分別用 4、8、16 μg/mL 的抗菌肽cp1處理0.5 h后均勻涂布于 LB平板上, 37℃培養(yǎng)24 h, 將蠟樣芽胞桿菌菌落無法在培養(yǎng)基中生長的最低抗菌肽cp1 質(zhì)量濃度記為 MBC 值。


1.3.4 生長曲線

參照穆可云等[22]方法并稍作修改, 將蠟樣芽胞桿菌菌懸液(106 CFU/mL)接種到 LB 培養(yǎng)基中, 37℃、250 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng) 2 h 至對(duì)數(shù)生長期。隨后, 以等體積的無菌水作為對(duì)照組, 試驗(yàn)組加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別為0.5、1、1.5、2 MIC, 在 37℃條件下連續(xù)培養(yǎng) 12 h。每 2 h取樣, 在 600 nm 波長處測(cè)定其吸光值。


1.3.5 細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷濃度的測(cè)量

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法取 2 mL 蠟樣芽胞桿菌菌懸浮液(106 CFU/mL), 加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別達(dá)到 1 MIC和 2 MIC, 0 MIC 作為對(duì)照組。在 37℃處理 1 h 后, 使用 ATP發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒從細(xì)胞中提取 ATP, 然后使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。


1.3.6 膜電位的測(cè)定

參照 SHI 等[24]的描述測(cè)定抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌膜電位的影響。將 5 mg 的 BiBAC4(3)用 0.96 mL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)充分溶解備用。向裝有125 μL 蠟樣芽胞桿菌菌懸浮液(106 CFU/mL)的黑色不透明96 孔板中加入 0.5 μL 的 BiBAC4(3)熒光探針, 37℃平衡40 min后, 加入抗菌肽 cp1至終濃度分別達(dá)到0、1和 2 MIC,處理 5 min 后, 設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為 492 nm 和515 nm, 使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。


1.3.7 核酸和蛋白質(zhì)外排的測(cè)定

參照盧彩會(huì)等[25]的方法, 用 PBS (0.1 mol/L pH 7.0)將已離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)的蠟樣芽胞桿菌體懸液(106 CFU/mL)連續(xù)漂洗 3 次, 重懸后加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別為 0、1、2 MIC, 37℃下孵育 12 h, 每 3 h 取出 2 mL, 離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)取上清液, 測(cè)定 260 nm 波長下的吸光值。計(jì)算核酸在菌液中的含量。每 3 h 取離心后的上清液 0.5 mL, 加入 5 mL 的考馬斯亮藍(lán) R250 試劑, 反應(yīng)5 min, 測(cè)定 595 nm 波長下的吸光值, 再計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。


1.3.8 掃描電子顯微鏡分析

根據(jù) FEI 等[26]方法, 將 106 CFU/mL 的蠟樣芽胞桿菌菌懸液加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別達(dá)到 1 MIC 和 2 MIC, 未處理蠟樣芽胞桿菌菌懸液作為對(duì)照組, 37℃處理 3 h 后離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)。向所得的菌泥中加入 1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.5%戊二醛溶液, 在 4℃下固定 2 h。分別用體積分?jǐn)?shù) 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫固定細(xì)胞, 每次 10 min, 隨后冷凍真空干燥, 真空鍍金, 最后使用掃描電子顯微鏡觀察蠟樣芽孢桿菌形態(tài)。


1.3.9 抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用
(1)抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳中蠟樣芽胞桿菌增長的影響
通過離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)收集對(duì)數(shù)生長期的菌體, 用無菌的 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0)洗滌, 并重懸于含有抗菌肽 cp1(最終質(zhì)量濃度分別為 1 MIC和 2 MIC)的新鮮巴氏殺菌乳中, 至菌體濃度約 103 CFU/mL, 并將上述樣品在 4℃培養(yǎng)。未用抗菌肽 cp1 處理的新鮮巴氏殺菌乳作對(duì)照。分別于 0、4、8、12 d 對(duì) LB 平板上生長的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。


(2)抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳感官評(píng)定的影響 

向巴氏殺菌乳中分別添加 0 MIC 和 1 MIC 的抗菌肽cp1, 于 4℃下儲(chǔ)存 12 d, 并且每 4 d 取樣。由 20 個(gè)具備相關(guān)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)的的個(gè)人使用 100 分的評(píng)分系統(tǒng), 對(duì)巴氏殺菌乳的感官屬性進(jìn)行評(píng)估, 包括味道、氣味、色澤、組織狀態(tài)和煮沸狀態(tài)[27]。具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表 1。

(3)抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳菌落總數(shù)的影響 

參照 GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》嚴(yán)格進(jìn)行測(cè)定, 測(cè)定在 4℃貯藏條件下 4、8 和 12 d 巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)。


1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次, 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 使用 SPSS 20.0 軟件通過方差分析和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 并檢驗(yàn)其顯著性, P<0.05 為不同組之間差異顯著, 利用 Origin 2019 軟件作圖。


2 結(jié)果與分析


2.1 DIZ、MIC 和 MBC 的測(cè)定結(jié)果
通過 DIZ、MIC 和 MBC, 能夠初步評(píng)價(jià)抗菌肽 cp1 的抑菌效果。由表 2 可知, 當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度為 10 μg/mL 時(shí), 其對(duì)蠟樣芽胞桿菌的 DIZ 為(16.19±1.29) mm; 當(dāng)抗菌肽cp1 質(zhì)量濃度為 4.0 μg/mL 時(shí), 蠟樣芽胞桿菌在培養(yǎng)基中幾乎不生長, 由此推斷抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的 MIC 值為 4 μg/mL; 同時(shí), 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的 MBC 值為 8 μg/mL。

2.2 生長曲線
如圖 1 所示, 研究了不同濃度抗菌肽 cp1 處理對(duì)蠟樣芽胞桿菌吸光值(optical density, OD)的影響。與對(duì)照組相比, 抗菌肽 cp1 處理的蠟樣芽胞桿菌的生長有明顯的抑制作用, 且隨著抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度的增加, 抑制作用越明顯。低質(zhì)量濃度抗菌肽 cp1 不能完全抑制蠟樣芽胞桿菌生長。當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度達(dá)到 2 MIC 時(shí), 蠟樣芽胞桿菌在整個(gè)生長期幾乎不生長。該結(jié)果表明, 不同質(zhì)量濃度的抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的生長均有抑制作用, 且抑菌能力與濃度呈正相關(guān)。

2.3 蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞膜 ATP 活性變化
ATP 可以為微生物的正常生理活動(dòng)和增殖提供必需的能量, 因此細(xì)胞內(nèi) ATP 含量的降低將直接導(dǎo)致微生物生長的停滯[28]。由圖 2 可知, 與對(duì)照組(0 MIC)相比, 經(jīng)抗菌肽 cp1 處理后的蠟樣芽胞桿菌胞內(nèi) ATP 含量顯著降低(P<0.05), 且隨抗菌肽 cp1 濃度的增加而降低。這可能與抗菌肽 cp1 作用于細(xì)菌后導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷有關(guān), 導(dǎo)致菌體細(xì)胞內(nèi) ATP 含量的下降[29]。

2.4 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌膜電位的影響
膜電位是反映細(xì)胞活力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo), 本研究利用 DiBAC4(3)熒光染料與細(xì)菌胞中蛋白質(zhì)結(jié)合后發(fā)出的熒光強(qiáng)度的特點(diǎn), 分析細(xì)胞膜電位的變化。由圖 3 可知, 與0 MIC 對(duì)照組相比, 經(jīng)抗菌肽處理后的蠟樣芽胞桿菌的熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05), 表明蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞膜電位出現(xiàn)超極化現(xiàn)象, 且 2 MIC 抗菌肽處理后的膜電位較 1 MIC 處理后下降更為明顯, 但兩種處理的熒光強(qiáng)度無顯著差異。這與 YEN 等[16]的研究結(jié)果類似, 驗(yàn)證了抗菌肽 cp1造成了蠟樣芽胞桿菌的細(xì)胞膜超極化現(xiàn)象。

2.5 核酸和蛋白質(zhì)外排的測(cè)定
菌體細(xì)胞膜完整性可通過菌體核酸滲漏和蛋白質(zhì)滲漏有關(guān), 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和核酸是細(xì)胞膜重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)[30]。由圖4A可知, 核酸滲漏隨著抗菌肽cp1質(zhì)量濃度的增加而顯著增加(P<0.05), 同時(shí)處理時(shí)間延長, 其核酸滲漏程度也有所增加。圖 4B 顯示, 與對(duì)照組相比, 用抗菌肽 cp1 處理的蠟樣芽胞桿菌的蛋白質(zhì)滲漏也顯著增加(P<0.05), 也與處理時(shí)間正相關(guān)。此滲漏趨勢(shì)與 CHANG 等[23]研究結(jié)果一致。這些結(jié)果表明, 經(jīng)過抗菌肽 cp1 處理后蠟樣芽胞桿菌的細(xì)胞膜被破壞, 導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡, 至使核酸和蛋白質(zhì)從胞內(nèi)滲漏。

2.6 掃描電子顯微鏡分析
在抑菌效果的基礎(chǔ)上, 利用掃描電鏡觀察了抗菌肽cp1 處理對(duì)蠟樣芽胞桿菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。如圖所示 5, 對(duì)照組完整、表面光滑無皺紋。在用抗菌肽 cp1 處理后, 在蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞中觀察到孔, 表明細(xì)胞壁損傷, 包括不同程度的細(xì)胞變形、胞內(nèi)物質(zhì)泄露及質(zhì)壁分離, 并且表面表現(xiàn)出破碎的皺紋。并且, 隨著抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度的增大, 蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷越顯著。這一結(jié)果與SANGDEE 等[31]關(guān)于胡蘆巴素對(duì)蠟樣芽孢桿菌的細(xì)胞膜造成損傷, 同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏。


2.7 抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用

2.7.1 抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳中蠟樣芽胞桿菌增長的影響
巴氏殺菌乳是一種營養(yǎng)豐富的食品, 但在其生產(chǎn)和加工過程中, 易受蠟樣芽孢桿菌的污染, 導(dǎo)致食品腐敗和中毒。在本研究中, 新鮮的巴氏殺菌乳作為一個(gè)模型系統(tǒng), 探究抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑制作用。由圖 6 可知, 未經(jīng)抗菌肽 cp1 處理的巴氏殺菌乳中蠟樣芽胞桿菌在貯藏期內(nèi)數(shù)量不斷增加, 而在第 4、8、12 d 時(shí), 添加了 1 MIC和 2 MIC 的抗菌肽 cp1 可以顯著抑制蠟樣芽胞桿菌在巴氏殺菌乳中的生長(P<0.05)。尤其在 4℃條件下貯藏的第 8 d時(shí), 抗菌肽 cp1 的質(zhì)量濃度為 2 MIC 時(shí)蠟樣芽胞桿菌的活菌計(jì)數(shù)降低至1.8 logCFU/mL, 表明抗菌肽cp1的添加抑制了巴氏殺菌乳中蠟樣芽胞桿菌的生長, 延長了巴氏殺菌乳的保質(zhì)期。

2.7.2 抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳感官的影響 
牛奶的感官評(píng)價(jià)是一個(gè)影響牛奶品質(zhì)的重要因素, 確定抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的感官效果是十分必要的。通過對(duì)感官特性進(jìn)行評(píng)分, 包括氣味、顏色、組織狀態(tài)、滋味和煮沸狀態(tài)。結(jié)果如雷達(dá)圖 7 所示, 對(duì)照組隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加逐漸變酸和黏稠, 在煮沸后沉淀, 顏色變黃, 在儲(chǔ)存 8 d 后觀察到嚴(yán)重的腐敗(圖 7A)。然而, 在添加1 MIC 抗菌肽 cp1 組中, 添加后對(duì)牛奶中的色、味、香、煮沸狀態(tài)和組織狀態(tài)幾乎沒有影響, 說明抗菌肽 cp1 對(duì)牛奶的品質(zhì)沒有不良影響; 同時(shí), 在 8 d 時(shí)腐敗性狀不顯著, 無變酸、無沉淀、不黏稠及顏色無變化(圖 7B)。因此, 抗菌肽 cp1 可以最大限度地減少牛奶在儲(chǔ)存過程中的腐敗, 并保持其感官品質(zhì)。類似地, WANG 等[32]還發(fā)現(xiàn), 辣木籽異硫氰酸酯對(duì)羊奶中腐敗微生物具有抑制作用, 同時(shí)對(duì)其顏色、氣味、味道和總體可接受性差異不顯著。隨著消費(fèi)者對(duì)食品添加劑和食品安全的日益關(guān)注, 防腐劑在牛奶中的應(yīng)用也逐漸從原來單純的抗菌劑轉(zhuǎn)向既注重保持牛奶本身的營養(yǎng)價(jià)值, 又保護(hù)消費(fèi)者的健康。然而, 抗菌肽 cp1對(duì)牛奶風(fēng)味的影響需要更深入的研究, 特別是主要風(fēng)味物質(zhì)的組成、貯藏期間風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律、風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的相關(guān)性等。

2.7.3 抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)的影響 
由圖 8 可知, 隨貯藏時(shí)間的延長, 菌落總數(shù)呈增多趨勢(shì), 且對(duì)照組(0 MIC)增多顯著高于 1 MIC 組(P<0.05)。1 MIC 組中抗菌肽 cp1 具有抑菌活性, 通過改變細(xì)胞膜的通透性, 致使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變, 導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[19]。

3 結(jié) 論


控制牛奶中蠟樣芽胞桿菌的數(shù)量對(duì)于保障乳制品食品安全性至關(guān)重要, 但目前缺乏有效的抑制牛奶中蠟樣芽孢桿菌的食品生物防腐劑。本研究利用抗菌肽 cp1, 并通過一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn), 揭示了抗菌肽 cp1 對(duì)臘樣芽孢桿菌的抑菌作用及在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明, 抗菌肽cp1 對(duì)臘樣芽孢桿菌具有明顯的抗菌作用, 抗菌肽 cp1 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) ATP 含量降低、細(xì)胞膜超級(jí)化, 滲漏胞內(nèi)蛋白質(zhì)和 DNA, 細(xì)胞形態(tài)破壞。此外, 抗菌肽 cp1 抑制蠟樣芽胞桿菌在巴氏殺菌乳中生長的能力, 添加后對(duì)牛奶的感官均無顯著影響, 并對(duì)貯藏期間的微生物的生長繁殖具有抑制作用, 還延長保質(zhì)期 12 d。綜上, 說明抗菌肽 cp1 具有抑菌、保鮮潛力, 這些研究結(jié)果可為抗菌肽 cp1 在食品、制藥、飼料等領(lǐng)域內(nèi)作為生物防腐劑或多功能食品添加劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。


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