摘 要: 目的 探究抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用, 并進(jìn)一步分析抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用。方法 以蠟樣芽胞桿菌為研究對(duì)象, 通過測(cè)定抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone, DIZ)、最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)評(píng)價(jià)抗菌肽cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果。通過分析生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、膜電位、內(nèi)容物滲出和細(xì)胞形態(tài)的變化, 來(lái)揭示可能的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上, 并探究抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳貯藏中的應(yīng)用。結(jié)果 當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度為 10 μg/mL 時(shí), 其對(duì)蠟樣芽胞桿菌的 DIZ 為(16.19±1.29) mm; 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的 MIC、MBC 分別為 4 μg/mL 和 8 μg/mL; 當(dāng)抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度為 2 MIC 時(shí), 蠟樣芽胞桿菌幾乎不生長(zhǎng); 抗菌肽 cp1 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) ATP 含量降低, 細(xì)胞膜超極化, 細(xì)胞液(包括核酸和蛋白質(zhì))漏出, 細(xì)胞形態(tài)破壞; 在巴氏殺菌乳中添加 1 MIC 抗菌肽 cp1 對(duì)乳感官均無(wú)顯著影響, 且 4℃條件下抗菌肽cp1 可有效抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng), 將其保質(zhì)期至少延長(zhǎng)到 12 d。結(jié)論 抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果, 具有延長(zhǎng)巴氏殺菌乳貨架期的潛力。
巴氏殺菌乳因其滅菌溫度低能更好地保留營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 具有保健功能而受到世界各國(guó)的普遍關(guān)注[1]。然而, 在加工、生產(chǎn)和儲(chǔ)存階段容易受到微生物污染, 特別是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。2022 年, 美國(guó)乳制品科學(xué)協(xié)會(huì)報(bào)道了因原料奶中細(xì)菌孢子在巴氏滅菌過程中并未殺滅, 導(dǎo)致了一半的液態(tài)奶變質(zhì)[2]。ZHAO 等[3]從中國(guó) 500 份乳制品中分離出 54 株蠟樣芽孢桿菌, 經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方奶粉占比 14%、原料奶占比 26%、巴氏殺菌奶占比 24%、超高溫奶占比 16%、奶酪占比 20%。前人研究表明, 受蠟樣芽胞桿菌污染的乳制品中產(chǎn)生了熱不穩(wěn)定的腹瀉流變性毒素和熱穩(wěn)定的嘔吐毒素, 這些毒素會(huì)引起腹瀉和嘔吐的綜合癥[4‒6]。同時(shí), 蠟樣芽胞桿菌分泌的蛋白酶和脂肪酶分解乳制品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 導(dǎo)致食物腐敗進(jìn)而縮短貨架期[7]。因此, 減少牛奶和相關(guān)產(chǎn)品被病原微生物尤其是蠟樣芽胞桿菌污染, 是保障乳制品食品安全的迫切需要。
巴氏殺菌對(duì)芽孢菌的殺滅率低, 國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在市售的巴氏殺菌乳中仍有未滅活的蠟樣芽胞桿菌, 所產(chǎn)生的毒力因子威脅人類健康[8‒11]。目前, 奶制品普遍采用熱殺菌技術(shù), 但過高的溫度會(huì)破壞牛奶中熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分, 因此在溫和殺菌方式下, 結(jié)合良好的生物防腐劑來(lái)延長(zhǎng)牛奶貨架期是液態(tài)奶加工新技術(shù)的重心[12]。相關(guān)研究表明, 抗菌肽因廣譜抗菌性強(qiáng)、作用靶點(diǎn)準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高且不易殘留等特點(diǎn), 被醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)和食品加工業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域所關(guān)注[13]。其中, 乳酸鏈球菌素(nisin)作為一種典型的抗菌肽代表, 因其抑制腐敗細(xì)菌和致病菌的效果突出, 且不會(huì)對(duì)產(chǎn)品物理化學(xué)特性造成顯著的影響而被廣泛應(yīng)用于原料乳和巴氏殺菌乳中[14‒15]�？咕目梢灶A(yù)防多種致病菌感染, 目前已有大量報(bào)道表明抗菌肽對(duì)蠟樣芽胞桿菌有明顯的抑菌效果[16‒17]。LEE 等[18]在 1989 年首次從豬小腸的寄生蟲中分離得到抗菌肽 cp1, 該肽的氨基酸序列為SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAQGGPR, 分子質(zhì)量為3339 Da。李倫鋒[19]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽 cp1 對(duì)食源性病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、沙門氏菌)均具有較強(qiáng)的抑菌效果, 且具有低毒性, 并應(yīng)用于鮮牛奶保鮮中, 但并未對(duì)抑菌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。目前關(guān)于抗菌肽cp1 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制作用鮮有報(bào)道�；诖�, 本研究以蠟樣芽孢桿菌為指示菌, 探討抗菌肽 cp1 對(duì)其抑菌作用機(jī)制, 并研究抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的實(shí)際抑菌效果, 為抗菌肽 cp1 在液態(tài)奶中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
營(yíng)養(yǎng)肉湯(luria-bertani, LB)、瓊脂(生物試劑, 青島海博生物科技有限公司); 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所); 雙 1,3-二巴比妥酸-三次甲基氧烯洛爾[bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol, BiBAC4(3)](上海懋康生物科技有限公司); 二甲基亞砜(分析純, 湖南九典化工科技有限公司); 無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS, 北京索萊寶科技有限公司); 考馬斯亮藍(lán) R250(分析純, 伊默克化工有限公司); 戊二醛(分析純, 安徽金粵冠新材料科技有限公司); 無(wú)水乙醇(分析純, 南通恒軒化工有限公司)。
BKQ-B50II 高壓蒸汽滅菌鍋(山東博科消毒設(shè)備有限公司); GZP-450Y 生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); 5418R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司); SynergyHTX 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) BioTek 公司); FDU-2110冷凍干燥機(jī)(日本東京理化器械株式會(huì)社); VEGA3 掃描電子顯微鏡(上海泰斯肯貿(mào)易有限公司)。
根據(jù)CHANG等[20]的方法, 利用牛津杯法測(cè)量抗菌肽cp1對(duì)蠟樣芽胞桿菌抑菌圈。取 100 μL 蠟樣芽胞桿菌(106 CFU/mL)均勻涂布到 LB 培養(yǎng)基上, 并在每個(gè)平板中用消過毒的鑷子放置 3 個(gè)滅好菌的牛津杯(外徑 8 mm、內(nèi)徑 6 mm、高10 mm), 再輕輕按壓。然后將 100 μL 抗菌肽 cp1 水溶液(10 μg/mL)加入每個(gè)牛津杯中, 37℃下培養(yǎng) 24 h。最后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone, DIZ)。
參照 FEI 等[21]的方法利用肉湯微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC), 向無(wú)菌的 24 孔板中加入滅菌后 LB 培養(yǎng)基, 并添加抗菌肽使其質(zhì)量濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL。取 2 μL的 106 CFU/mL蠟樣芽胞桿菌菌懸液至已凝固的 24孔板中, 37℃培養(yǎng) 24 h, 將肉眼下觀察不到蠟樣芽胞桿菌生長(zhǎng)的最低的抗菌肽 cp1 質(zhì)量濃度作為 MIC 值。將 100 μL 的蠟樣芽胞桿菌菌懸液(106 CFU/mL)分別用 4、8、16 μg/mL 的抗菌肽cp1處理0.5 h后均勻涂布于 LB平板上, 37℃培養(yǎng)24 h, 將蠟樣芽胞桿菌菌落無(wú)法在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最低抗菌肽cp1 質(zhì)量濃度記為 MBC 值。
參照穆可云等[22]方法并稍作修改, 將蠟樣芽胞桿菌菌懸液(106 CFU/mL)接種到 LB 培養(yǎng)基中, 37℃、250 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng) 2 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后, 以等體積的無(wú)菌水作為對(duì)照組, 試驗(yàn)組加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別為0.5、1、1.5、2 MIC, 在 37℃條件下連續(xù)培養(yǎng) 12 h。每 2 h取樣, 在 600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。
根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法取 2 mL 蠟樣芽胞桿菌菌懸浮液(106 CFU/mL), 加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別達(dá)到 1 MIC和 2 MIC, 0 MIC 作為對(duì)照組。在 37℃處理 1 h 后, 使用 ATP發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒從細(xì)胞中提取 ATP, 然后使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。
參照 SHI 等[24]的描述測(cè)定抗菌肽 cp1 對(duì)蠟樣芽胞桿菌膜電位的影響。將 5 mg 的 BiBAC4(3)用 0.96 mL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)充分溶解備用。向裝有125 μL 蠟樣芽胞桿菌菌懸浮液(106 CFU/mL)的黑色不透明96 孔板中加入 0.5 μL 的 BiBAC4(3)熒光探針, 37℃平衡40 min后, 加入抗菌肽 cp1至終濃度分別達(dá)到0、1和 2 MIC,處理 5 min 后, 設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 492 nm 和515 nm, 使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。
參照盧彩會(huì)等[25]的方法, 用 PBS (0.1 mol/L pH 7.0)將已離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)的蠟樣芽胞桿菌體懸液(106 CFU/mL)連續(xù)漂洗 3 次, 重懸后加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別為 0、1、2 MIC, 37℃下孵育 12 h, 每 3 h 取出 2 mL, 離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)取上清液, 測(cè)定 260 nm 波長(zhǎng)下的吸光值。計(jì)算核酸在菌液中的含量。每 3 h 取離心后的上清液 0.5 mL, 加入 5 mL 的考馬斯亮藍(lán) R250 試劑, 反應(yīng)5 min, 測(cè)定 595 nm 波長(zhǎng)下的吸光值, 再計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。
根據(jù) FEI 等[26]方法, 將 106 CFU/mL 的蠟樣芽胞桿菌菌懸液加入抗菌肽 cp1 至終濃度分別達(dá)到 1 MIC 和 2 MIC, 未處理蠟樣芽胞桿菌菌懸液作為對(duì)照組, 37℃處理 3 h 后離心(5000 r/min, 10 min, 4℃)。向所得的菌泥中加入 1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.5%戊二醛溶液, 在 4℃下固定 2 h。分別用體積分?jǐn)?shù) 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫固定細(xì)胞, 每次 10 min, 隨后冷凍真空干燥, 真空鍍金, 最后使用掃描電子顯微鏡觀察蠟樣芽孢桿菌形態(tài)。
(2)抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳感官評(píng)定的影響
向巴氏殺菌乳中分別添加 0 MIC 和 1 MIC 的抗菌肽cp1, 于 4℃下儲(chǔ)存 12 d, 并且每 4 d 取樣。由 20 個(gè)具備相關(guān)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)的的個(gè)人使用 100 分的評(píng)分系統(tǒng), 對(duì)巴氏殺菌乳的感官屬性進(jìn)行評(píng)估, 包括味道、氣味、色澤、組織狀態(tài)和煮沸狀態(tài)[27]。具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表 1。
參照 GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》嚴(yán)格進(jìn)行測(cè)定, 測(cè)定在 4℃貯藏條件下 4、8 和 12 d 巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)。
所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次, 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 使用 SPSS 20.0 軟件通過方差分析和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 并檢驗(yàn)其顯著性, P<0.05 為不同組之間差異顯著, 利用 Origin 2019 軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.7 抗菌肽 cp1 在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用
2.7.1 抗菌肽 cp1 對(duì)巴氏殺菌乳中蠟樣芽胞桿菌增長(zhǎng)的影響
3 結(jié) 論
控制牛奶中蠟樣芽胞桿菌的數(shù)量對(duì)于保障乳制品食品安全性至關(guān)重要, 但目前缺乏有效的抑制牛奶中蠟樣芽孢桿菌的食品生物防腐劑。本研究利用抗菌肽 cp1, 并通過一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn), 揭示了抗菌肽 cp1 對(duì)臘樣芽孢桿菌的抑菌作用及在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明, 抗菌肽cp1 對(duì)臘樣芽孢桿菌具有明顯的抗菌作用, 抗菌肽 cp1 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) ATP 含量降低、細(xì)胞膜超級(jí)化, 滲漏胞內(nèi)蛋白質(zhì)和 DNA, 細(xì)胞形態(tài)破壞。此外, 抗菌肽 cp1 抑制蠟樣芽胞桿菌在巴氏殺菌乳中生長(zhǎng)的能力, 添加后對(duì)牛奶的感官均無(wú)顯著影響, 并對(duì)貯藏期間的微生物的生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用, 還延長(zhǎng)保質(zhì)期 12 d。綜上, 說(shuō)明抗菌肽 cp1 具有抑菌、保鮮潛力, 這些研究結(jié)果可為抗菌肽 cp1 在食品、制藥、飼料等領(lǐng)域內(nèi)作為生物防腐劑或多功能食品添加劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
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