摘要:整合素αvβ3是一種能特異性識別RGD序列的膜受體蛋白,其與含RGD(Arg-Gly-Asp)模體的蛋白質(zhì)結(jié)合的特異性在腫瘤細(xì)胞的粘附、遷移、浸潤及腫瘤血管新生中起重要作用.由于整合素αvβ3在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)而在正常細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá),因此其成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn).腫瘤新生血管為腫瘤的生長提供營養(yǎng),因此近年來抑制腫瘤血管新生也成為腫瘤治療的重要途徑.有研究顯示,幾種RGD毒素蛋白不但以整合素αvβ3為靶點(diǎn)靶向結(jié)合到腫瘤部位從而具有直接抗腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移及浸潤功能,而且它們還具有抗腫瘤血管新生的作用,因此RGD毒素蛋白可從上述兩方面抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移.本文就整合素αvβ3為靶向的RGD配體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在腫瘤治療中的靶向治療和抗血管新生應(yīng)用及前景加以綜述.
在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面,最為廣泛高表達(dá)的整合素是αvβ3.αvβ3與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)結(jié)合的配體,通常是ECM蛋白上的RGD模體(RGDmotif).
RGD模體是某些蛋白質(zhì)分子中的3肽序列Arg-Gly-Asp,為細(xì)胞識別的最小結(jié)構(gòu)單位.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),RGD模體廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)的玻連蛋白(vitronectin,VN)、纖連蛋白(laminin,LN)及層連蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)中,是細(xì)胞表面整合素(integrins)與ECM的結(jié)合位點(diǎn).
除細(xì)胞外基質(zhì)中含有RGD模體外,RGD模體也能被病毒和細(xì)菌等病原體所利用[3-5].這些病原體通過RGD與宿主細(xì)胞的特定整合素結(jié)合,經(jīng)過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞.此外,在蛇毒、水蛭及蜱類毒腺分泌物質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了RGD模體蛋白.這些來源于動物毒腺的RGD分泌蛋白,可憑借蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上特有的RGD分子序列,成為細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)效競爭性拮抗劑,進(jìn)而通過封閉整合素的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制血小板聚集,最終達(dá)到抑制血管新生,抗腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移和浸潤等作用,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[6].模擬病原體,用人工合成產(chǎn)物研究RGD與整合素的靶向細(xì)胞識別和細(xì)胞內(nèi)攝作用,已成為診斷治療腫瘤,及其藥物研發(fā)的目標(biāo).以整合素為靶點(diǎn)的RGD配體研究,已成為腫瘤病理學(xué)和藥理學(xué)研究熱點(diǎn).
由于αvβ3是較為廣泛表達(dá)于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面,而在靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常細(xì)胞中低表達(dá)的整合素,已成為抗血管新生和抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn),針對其進(jìn)行的RGD配體研究也取得了較好的進(jìn)展,
1 腫瘤血管新生與轉(zhuǎn)移
腫瘤血管新生與生理性血管新生具有明顯不同,這包括異常的血管構(gòu)造、內(nèi)皮細(xì)胞與周圍細(xì)胞連接的改變、反常的血流、滲透性的增加、細(xì)胞成熟的延遲等.多數(shù)腫瘤的增長都起始于無血管小瘤,新血管的形成為腫瘤組織提供了必要的營養(yǎng)與氧氣,使腫瘤得以快速生長.
腫瘤細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移向全身擴(kuò)散.轉(zhuǎn)移的發(fā)生經(jīng)過幾個步驟:首先,腫瘤細(xì)胞失去E-鈣粘蛋白依賴的細(xì)胞間粘附,獲得遷移表型并從相鄰細(xì)胞中脫離,穿過基質(zhì)膜并侵入到間質(zhì)基質(zhì)中;然后,腫瘤細(xì)胞穿入血管和淋巴管從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)(這個過程叫內(nèi)滲);最后,腫瘤細(xì)胞隨血流運(yùn)行,黏附于血小板和白血球并形成栓子,停留于靶器官的微循環(huán)中,從血流中退出(這個過程叫外滲),并在靶器官組織中瘋狂生長.
2 αvβ3在腫瘤發(fā)展中的功能
能夠調(diào)節(jié)血管新生的信號分子包括生長因子受體、酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯(lián)受體及整合素,而整合素信號通路在腫瘤血管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用.整合素表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,在血管新生期間調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移與存活;而如果整合素表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面,將通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞穿過血管壁的浸潤和運(yùn)動而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移.有效的腫瘤浸潤需要對浸潤前沿處的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行部分降解,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是此過程中起主要作用的酶.αvβ3整合素能與細(xì)胞間質(zhì)成份(如:纖連蛋白、玻連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白)上的RGD序列相結(jié)合,可在血管新生期間發(fā)生顯著上調(diào),而在沉寂的內(nèi)皮細(xì)胞中卻無此反應(yīng).
整合素αvβ3在腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移中具有特異作用,是因?yàn)槠渚哂姓心己图せ頜MP-2和纖溶酶的能力,從而對基質(zhì)膜和間質(zhì)基質(zhì)成份進(jìn)行降解.研究表明,整合素αvβ3在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)與多種惡性腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及黑色素瘤)的發(fā)展進(jìn)程呈正相關(guān).大量的研究證實(shí),整合素αvβ3在腫瘤生成、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7-8].
3 與αvβ3特異結(jié)合的RGD配體及其功能
無論是天然的還是合成的RGD肽,其與整合素的親和性和特異性都取決于RGD氨基酸殘基側(cè)鏈,特別是天冬氨酸的側(cè)鏈[9].除此之外,這些殘基與整合素及RGD周邊基團(tuán)的相互作用也能影響肽鏈的折疊,從而改變RGD序列的構(gòu)象特點(diǎn).RGD的三維構(gòu)象有利于RGD序列突出分布于藥物分子表面,使其發(fā)揮更好的靶向作用[10].大多數(shù)線形RGD肽在體內(nèi)循環(huán)的半衰期較短,這是因?yàn)榫形肽鏈的天冬氨酸殘基容易被蛋白酶水解[11],而環(huán)化的結(jié)構(gòu)則能夠避免上述情況的發(fā)生,所以環(huán)形RGD肽類更加穩(wěn)定,且具有更強(qiáng)的受體結(jié)合性和受體特異性,因此環(huán)化成為提高RGD肽結(jié)合能力常用的方法.
c(RGDf-N(Me)-V)又名EMD121974或Cilengitide,是一種環(huán)化RGD肽.Cilengitide能在nmol濃度下競爭性抑制玻連蛋白和纖維蛋白原與特定整合素的結(jié)合,其與整合素αvβ3的結(jié)合能力高于與αIIbβ3整合素結(jié)合能力的1000倍[12],這說明其能與αvβ3特異高效結(jié)合.Cilengitide的限制性環(huán)化結(jié)構(gòu)和插入的D氨基酸殘基改變了RGD序列的構(gòu)象特點(diǎn),使其更有利于與整合素αvβ3的結(jié)合.在Cilengitide的系列衍生物中,由于c(RGDFK)的賴氨酸殘基(K)是進(jìn)行下一步化學(xué)結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)位點(diǎn),所以其常被用于醫(yī)療上的藥物傳輸.
RGD4C是另一種含2個二硫鍵的RGD肽(ACDCRGDCFCG),其對腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制能力最強(qiáng),其抑制能力是含單個二硫鍵RGD環(huán)肽的20倍,是線形RGD多肽的100倍[13].RGD4C已被作為化學(xué)藥物的載體,成功用于腫瘤血管的靶向治療[14].RGD4C可作為靶向配體被用于運(yùn)送細(xì)胞增殖抑制藥物,也可用重組的方法將其整合到蛋白或病毒中.但是,RGD4C還具有局限性,其能折疊出不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu),除了典型的二環(huán)結(jié)構(gòu),還有其它的單環(huán)和二環(huán)結(jié)構(gòu),而其它結(jié)構(gòu)與整合素的親和特異性低于典型的二環(huán)結(jié)構(gòu)約10倍[15].
通過將RGD配體連接到不同載體系統(tǒng),可以提高RGD配體的親和能力和藥代動力學(xué).研究[17]表明,RGD多價聚合物在nmol濃度下,與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的αvβ3整合素的親和力比單獨(dú)的RGD提高了250倍.用64Cu標(biāo)記了2種RGD復(fù)合物———RGD肽四聚體和RGD肽八聚體,并在整合素αvβ3高表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞瘤動物模型中進(jìn)行PET成像.結(jié)果顯示,與RGD四聚體相比,RGD八聚體對整合素αvβ3的親和力和結(jié)合特異性都明顯提高[18].由此可見,RGD在體內(nèi)的穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)過程能通過合成RGD多聚體進(jìn)行提高.此外,多聚體不僅能大幅度提高親和能力,還能促進(jìn)細(xì)胞的內(nèi)吞作用,與脂質(zhì)體、納米顆粒、蛋白質(zhì)和其他聚合物載體系統(tǒng)連接的RGD多價聚合物,比單獨(dú)的RGD肽更有可能通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[19-20].
血管生成是固體瘤生長和粘附的重要過程.激活整合αvβ3可能觸發(fā)胞內(nèi)信號通路,促進(jìn)血管的生長和分化.因此,抑制血管生成被認(rèn)為是一種很有前途的腫瘤治療途徑.
在蛇毒、水蛭及蜱類毒腺分泌物質(zhì)中已發(fā)現(xiàn)了多種RGD模體蛋白.去整合素是指來源于蛇毒的RGD模體毒素蛋白,是目前被研究最為廣泛的一種,其種類可根據(jù)蛇種來源分為數(shù)十種.Triflavin是從竹葉青蛇類分離出的RGD毒素蛋白,能夠阻止和抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移,并且實(shí)驗(yàn)證明,其能通過抑制整合素αvβ3進(jìn)而有效的抑制血管生成[21].另外,從蝮蛇體內(nèi)分離出的Contortrostatin[22 RGD毒素蛋白,也是強(qiáng)效的整合素αvβ3拮抗劑,無論是體內(nèi)還是體外都能強(qiáng)力抑制血管生成,業(yè)已證明,與docetaxel聯(lián)合使用對前列腺癌有較好的抑制效用,此外,還有蛇毒obtustatin,僅包含41個氨基酸分子,是一種低分子量的整合素抑制劑.由于整合素在密集增殖的微血管內(nèi)皮細(xì)胞上高度表達(dá).Obtustain的這種性質(zhì)顯示,其非常適于發(fā)展成為抗血管生成途徑的抗腫瘤藥物[23].來源于水蛭類的Decorsin,是從北美水蛭體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的含有39個氨基酸的RGD模體蛋白,Ornatin在水蛭Placobdellaornata體內(nèi)發(fā)現(xiàn),與Decorsin有40%的同源性,純化的與重組的Ornati 都含有6個半胱氨酸殘基和1個RGD序列.Ornatin能有效的抑制纖維蛋白原與整合素的結(jié)[24].來源于蜱類Dermacentorvariabilis的RGD模體毒素蛋白Variabilin,僅有5kD并包含1個RGD模體,其能有效拮抗整合素αIIbβ3和αvβ3[25].Savignygrin從軟體蜱Ornithodoros savignyi中發(fā)現(xiàn),它含有1個RGD序列的血小板聚集抑制劑[26].但是,除了在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的RGD毒素蛋白具有抗血管新生作用,另外的2類RGD毒素蛋白并沒有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù),表明其對抗血管新生也有效果.
RGD可運(yùn)載阿霉素(doxorubicin,DOX)到血管新生內(nèi)皮細(xì)胞.體外試驗(yàn)表明,doxo-RGD4C(doxorubicin-RGD4C復(fù)合物)和單純的阿霉素具有相同的治療作用,除同樣具有抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長、遷移和浸潤的功能外[30],還能降低對正常細(xì)胞的毒副作用.這其中的原因便在于腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)某些整合素,尤其是整合素αvβ3高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面,而正常細(xì)胞內(nèi)整合素表達(dá)量則很低.RGD特異識別高表達(dá)的整合素αvβ3,從而造成腫瘤治療中的靶向定位.現(xiàn)已成功合成了幾種doxorubicinRGD4C復(fù)合物,以提高阿霉素的靶向治療;同時,這些復(fù)合物還被設(shè)計成受腫瘤分泌的酶激活的藥物前體,以進(jìn)一步降低其毒副作用,并提高腫瘤靶向特異性[31].例如,現(xiàn)在已研究出一種具有纖溶酶特異作用位點(diǎn)的藥物前體,使得藥物前體在整合素αvβ3上積聚后由纖溶酶水解并釋放母體藥物,從而使阿霉素恢復(fù)細(xì)胞抑制活性.這種藥物前體和纖溶酶的作用效果已經(jīng)在體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí).幾種RGD肽靶向的阿霉素藥物前體中,單環(huán)的RGD4C配體比二環(huán)的RGD4C對整合素表現(xiàn)出更高的親和性,此結(jié)果與3.1論述的結(jié)果相反[32].同時,單環(huán)RGD4C肽比二環(huán)RGD4C肽水溶性更佳,因此現(xiàn)在的阿霉素復(fù)合物均用RGD單環(huán)肽制備而成.
此外,紫杉醇(PTX)藥物前體中含有二價的c(RGDyk)結(jié)構(gòu)域.實(shí)驗(yàn)證實(shí),復(fù)合物PTX-RGD2在MDA-MB-435乳腺腫瘤與整合素結(jié)合的積聚量,與單純的PTX的RGD肽二聚體相同[33].因此,其可通過RGD與整合素αvβ3結(jié)合而提高腫瘤治療的靶向性.
RGD與攜帶阿霉素的脂質(zhì)體連接也可用于整合素αvβ3的靶向治療.有研究者[34]對RGD類似物(RGDm)修飾的穩(wěn)定脂質(zhì)體(stabilizedliposomes,SL)攜帶阿霉素在腫瘤部位的積聚,以及向腫瘤細(xì)胞內(nèi)傳遞的情況進(jìn)行了研究.流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦的結(jié)果顯示,與SL-DOX相比,細(xì)胞對RGDm-SL-DOX的結(jié)合及攝取均顯著增加.這表明,RGDm修飾的SL可作為特定藥物靶向載體,其通過受體介導(dǎo)的方式將藥物分子有效靶向至特定腫瘤部位.除此之外,也有以聚乙二醇(PEG)作為連接物連接RGD和脂質(zhì)體的報道.另有文獻(xiàn)報道,上文中提到的RGD10被類脂分子改良后,更容易進(jìn)入包含阿霉素的脂質(zhì)體[35].而C26腫瘤模型實(shí)驗(yàn)也證明,這些脂質(zhì)體的連接和內(nèi)化比單純的阿霉素具有更好的抑瘤效果.
3.3.2RGD介導(dǎo)的核酸靶向轉(zhuǎn)染 RGD引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)染的能力在體內(nèi)體外都獲得證實(shí).RGD 引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)染的方式有2種:一是RGD肽共價結(jié)合于PEI,然后再將RGD修飾的PEI與DNA或siRNA形成共聚物;另一種是將RGD肽鏈直接與聚合物主鏈合成在一起(RGD-PEG-PEI)[36].RGD靶向的核酸載體則包括非病毒類和病毒類2種,非病毒類核酸載體包括陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體和陽離子肽類等,病毒類核酸載體則有腺病毒途徑和非腺病毒途徑[37,38].
4問題與展望
自從發(fā)現(xiàn)血管新生是腫瘤生長的重要因素,腫瘤新生血管問題成為公認(rèn)的治療癌癥的有效目標(biāo).αvβ3整合素在新生血管表面表達(dá),但不是在EC細(xì)胞表面表達(dá),這種有限的表達(dá)使其成為理想的靶點(diǎn).為了開發(fā)這種靶向藥物運(yùn)輸?shù)奶匦,目前的研究將αvβ3整合素的識別序列RGD肽插入蛋白質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)體、病毒和其他的基因運(yùn)輸載體,通過其靶向作用,將小分子藥物、核酸類藥物等運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi).而這種化學(xué)合成和重組體聚合物的途徑都是可行的,都能促進(jìn)藥物靶向領(lǐng)域中RGD介導(dǎo)的藥物運(yùn)輸?shù)膹V泛應(yīng)用.
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