摘要：整合素αvβ3是一種能特異性識別RGD序列的膜受體蛋白，其與含RGD(Arg-Gly-Asp)模體的蛋白質(zhì)結(jié)合的特異性在腫瘤細胞的粘附、遷移、浸潤及腫瘤血管新生中起重要作用．由于整合素αvβ3在多種腫瘤細胞表面高表達而在正常細胞中低表達或不表達，因此其成為腫瘤治療的理想靶點．腫瘤新生血管為腫瘤的生長提供營養(yǎng)，因此近年來抑制腫瘤血管新生也成為腫瘤治療的重要途徑．有研究顯示，幾種RGD毒素蛋白不但以整合素αvβ3為靶點靶向結(jié)合到腫瘤部位從而具有直接抗腫瘤細胞增殖、黏附、遷移及浸潤功能，而且它們還具有抗腫瘤血管新生的作用，因此RGD毒素蛋白可從上述兩方面抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移．本文就整合素αvβ3為靶向的RGD配體結(jié)構(gòu)特點及其在腫瘤治療中的靶向治療和抗血管新生應(yīng)用及前景加以綜述．
在新生血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞表面，最為廣泛高表達的整合素是αvβ3．αvβ3與細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)結(jié)合的配體，通常是ECM蛋白上的RGD模體(RGDmotif)．
RGD模體是某些蛋白質(zhì)分子中的3肽序列Arg-Gly-Asp，為細胞識別的最小結(jié)構(gòu)單位．現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，RGD模體廣泛存在于細胞外基質(zhì)的玻連蛋白(vitronectin，VN)、纖連蛋白(laminin，LN)及層連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)中，是細胞表面整合素(integrins)與ECM的結(jié)合位點．
除細胞外基質(zhì)中含有RGD模體外，RGD模體也能被病毒和細菌等病原體所利用［3-5］．這些病原體通過RGD與宿主細胞的特定整合素結(jié)合，經(jīng)過細胞吞噬作用進入宿主細胞．此外，在蛇毒、水蛭及蜱類毒腺分泌物質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了RGD模體蛋白．這些來源于動物毒腺的RGD分泌蛋白，可憑借蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上特有的RGD分子序列，成為細胞外基質(zhì)與細胞整合素間結(jié)合的強效競爭性拮抗劑，進而通過封閉整合素的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制血小板聚集，最終達到抑制血管新生，抗腫瘤細胞增殖、黏附、遷移和浸潤等作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡［6］．模擬病原體，用人工合成產(chǎn)物研究RGD與整合素的靶向細胞識別和細胞內(nèi)攝作用，已成為診斷治療腫瘤，及其藥物研發(fā)的目標．以整合素為靶點的RGD配體研究，已成為腫瘤病理學(xué)和藥理學(xué)研究熱點．
由于αvβ3是較為廣泛表達于新生血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞表面，而在靜止的血管內(nèi)皮細胞和正常細胞中低表達的整合素，已成為抗血管新生和抗腫瘤藥物的作用靶點，針對其進行的RGD配體研究也取得了較好的進展，
1 腫瘤血管新生與轉(zhuǎn)移
腫瘤血管新生與生理性血管新生具有明顯不同，這包括異常的血管構(gòu)造、內(nèi)皮細胞與周圍細胞連接的改變、反常的血流、滲透性的增加、細胞成熟的延遲等．多數(shù)腫瘤的增長都起始于無血管小瘤，新血管的形成為腫瘤組織提供了必要的營養(yǎng)與氧氣，使腫瘤得以快速生長．
腫瘤細胞通過轉(zhuǎn)移向全身擴散．轉(zhuǎn)移的發(fā)生經(jīng)過幾個步驟:首先，腫瘤細胞失去E-鈣粘蛋白依賴的細胞間粘附，獲得遷移表型并從相鄰細胞中脫離，穿過基質(zhì)膜并侵入到間質(zhì)基質(zhì)中;然后，腫瘤細胞穿入血管和淋巴管從而進入循環(huán)系統(tǒng)(這個過程叫內(nèi)滲);最后，腫瘤細胞隨血流運行，黏附于血小板和白血球并形成栓子，停留于靶器官的微循環(huán)中，從血流中退出(這個過程叫外滲)，并在靶器官組織中瘋狂生長．
2 αvβ3在腫瘤發(fā)展中的功能
能夠調(diào)節(jié)血管新生的信號分子包括生長因子受體、酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯(lián)受體及整合素，而整合素信號通路在腫瘤血管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用．整合素表達于血管內(nèi)皮細胞表面，在血管新生期間調(diào)節(jié)細胞遷移與存活;而如果整合素表達于腫瘤細胞表面，將通過增強腫瘤細胞穿過血管壁的浸潤和運動而促進腫瘤轉(zhuǎn)移．有效的腫瘤浸潤需要對浸潤前沿處的細胞外基質(zhì)進行部分降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是此過程中起主要作用的酶．αvβ3整合素能與細胞間質(zhì)成份(如:纖連蛋白、玻連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白)上的RGD序列相結(jié)合，可在血管新生期間發(fā)生顯著上調(diào)，而在沉寂的內(nèi)皮細胞中卻無此反應(yīng)．
整合素αvβ3在腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移中具有特異作用，是因為其具有招募和激活MMP-2和纖溶酶的能力，從而對基質(zhì)膜和間質(zhì)基質(zhì)成份進行降解．研究表明，整合素αvβ3在腫瘤細胞表面的表達與多種惡性腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)母細胞瘤及黑色素瘤)的發(fā)展進程呈正相關(guān)．大量的研究證實，整合素αvβ3在腫瘤生成、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［7-8］．
3 與αvβ3特異結(jié)合的RGD配體及其功能
無論是天然的還是合成的RGD肽，其與整合素的親和性和特異性都取決于RGD氨基酸殘基側(cè)鏈，特別是天冬氨酸的側(cè)鏈［9］．除此之外，這些殘基與整合素及RGD周邊基團的相互作用也能影響肽鏈的折疊，從而改變RGD序列的構(gòu)象特點．RGD的三維構(gòu)象有利于RGD序列突出分布于藥物分子表面，使其發(fā)揮更好的靶向作用［10］．大多數(shù)線形RGD肽在體內(nèi)循環(huán)的半衰期較短，這是因為線形肽鏈的天冬氨酸殘基容易被蛋白酶水解［11］，而環(huán)化的結(jié)構(gòu)則能夠避免上述情況的發(fā)生，所以環(huán)形RGD肽類更加穩(wěn)定，且具有更強的受體結(jié)合性和受體特異性，因此環(huán)化成為提高RGD肽結(jié)合能力常用的方法．
c(RGDf-N(Me)-V)又名EMD121974或Cilengitide，是一種環(huán)化RGD肽．Cilengitide能在nmol濃度下競爭性抑制玻連蛋白和纖維蛋白原與特定整合素的結(jié)合，其與整合素αvβ3的結(jié)合能力高于與αIIbβ3整合素結(jié)合能力的1000倍［12］，這說明其能與αvβ3特異高效結(jié)合．Cilengitide的限制性環(huán)化結(jié)構(gòu)和插入的D氨基酸殘基改變了RGD序列的構(gòu)象特點，使其更有利于與整合素αvβ3的結(jié)合．在Cilengitide的系列衍生物中，由于c(RGDFK)的賴氨酸殘基(K)是進行下一步化學(xué)結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)位點，所以其常被用于醫(yī)療上的藥物傳輸．
RGD4C是另一種含2個二硫鍵的RGD肽(ACDCRGDCFCG)，其對腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的抑制能力最強，其抑制能力是含單個二硫鍵RGD環(huán)肽的20倍，是線形RGD多肽的100倍［13］．RGD4C已被作為化學(xué)藥物的載體，成功用于腫瘤血管的靶向治療［14］．RGD4C可作為靶向配體被用于運送細胞增殖抑制藥物，也可用重組的方法將其整合到蛋白或病毒中．但是，RGD4C還具有局限性，其能折疊出不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，除了典型的二環(huán)結(jié)構(gòu)，還有其它的單環(huán)和二環(huán)結(jié)構(gòu)，而其它結(jié)構(gòu)與整合素的親和特異性低于典型的二環(huán)結(jié)構(gòu)約10倍［15］．
通過將RGD配體連接到不同載體系統(tǒng)，可以提高RGD配體的親和能力和藥代動力學(xué)．研究［17］表明，RGD多價聚合物在nmol濃度下，與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中的αvβ3整合素的親和力比單獨的RGD提高了250倍．用64Cu標記了2種RGD復(fù)合物———RGD肽四聚體和RGD肽八聚體，并在整合素αvβ3高表達的膠質(zhì)細胞瘤動物模型中進行PET成像．結(jié)果顯示，與RGD四聚體相比，RGD八聚體對整合素αvβ3的親和力和結(jié)合特異性都明顯提高［18］．由此可見，RGD在體內(nèi)的穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)過程能通過合成RGD多聚體進行提高．此外，多聚體不僅能大幅度提高親和能力，還能促進細胞的內(nèi)吞作用，與脂質(zhì)體、納米顆粒、蛋白質(zhì)和其他聚合物載體系統(tǒng)連接的RGD多價聚合物，比單獨的RGD肽更有可能通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞［19-20］．
血管生成是固體瘤生長和粘附的重要過程．激活整合αvβ3可能觸發(fā)胞內(nèi)信號通路，促進血管的生長和分化．因此，抑制血管生成被認為是一種很有前途的腫瘤治療途徑．
在蛇毒、水蛭及蜱類毒腺分泌物質(zhì)中已發(fā)現(xiàn)了多種RGD模體蛋白．去整合素是指來源于蛇毒的RGD模體毒素蛋白，是目前被研究最為廣泛的一種，其種類可根據(jù)蛇種來源分為數(shù)十種．Triflavin是從竹葉青蛇類分離出的RGD毒素蛋白，能夠阻止和抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的粘附和遷移，并且實驗證明，其能通過抑制整合素αvβ3進而有效的抑制血管生成［21］．另外，從蝮蛇體內(nèi)分離出的Contortrostatin［22 RGD毒素蛋白，也是強效的整合素αvβ3拮抗劑，無論是體內(nèi)還是體外都能強力抑制血管生成，業(yè)已證明，與docetaxel聯(lián)合使用對前列腺癌有較好的抑制效用,此外，還有蛇毒obtustatin，僅包含41個氨基酸分子，是一種低分子量的整合素抑制劑．由于整合素在密集增殖的微血管內(nèi)皮細胞上高度表達．Obtustain的這種性質(zhì)顯示，其非常適于發(fā)展成為抗血管生成途徑的抗腫瘤藥物［23］．來源于水蛭類的Decorsin，是從北美水蛭體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的含有39個氨基酸的RGD模體蛋白，Ornatin在水蛭Placobdellaornata體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，與Decorsin有40%的同源性，純化的與重組的Ornati 都含有6個半胱氨酸殘基和1個RGD序列．Ornatin能有效的抑制纖維蛋白原與整合素的結(jié)［24］．來源于蜱類Dermacentorvariabilis的RGD模體毒素蛋白Variabilin，僅有5kD并包含1個RGD模體，其能有效拮抗整合素αIIbβ3和αvβ3［25］．Savignygrin從軟體蜱Ornithodoros savignyi中發(fā)現(xiàn)，它含有1個RGD序列的血小板聚集抑制劑［26］．但是，除了在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的RGD毒素蛋白具有抗血管新生作用，另外的2類RGD毒素蛋白并沒有直接的實驗證據(jù)，表明其對抗血管新生也有效果．
RGD可運載阿霉素(doxorubicin，DOX)到血管新生內(nèi)皮細胞．體外試驗表明，doxo-RGD4C(doxorubicin-RGD4C復(fù)合物)和單純的阿霉素具有相同的治療作用，除同樣具有抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長、遷移和浸潤的功能外［30］，還能降低對正常細胞的毒副作用．這其中的原因便在于腫瘤細胞表面高表達某些整合素，尤其是整合素αvβ3高表達于腫瘤細胞表面，而正常細胞內(nèi)整合素表達量則很低．RGD特異識別高表達的整合素αvβ3，從而造成腫瘤治療中的靶向定位．現(xiàn)已成功合成了幾種doxorubicinRGD4C復(fù)合物，以提高阿霉素的靶向治療;同時，這些復(fù)合物還被設(shè)計成受腫瘤分泌的酶激活的藥物前體，以進一步降低其毒副作用，并提高腫瘤靶向特異性［31］．例如，現(xiàn)在已研究出一種具有纖溶酶特異作用位點的藥物前體，使得藥物前體在整合素αvβ3上積聚后由纖溶酶水解并釋放母體藥物，從而使阿霉素恢復(fù)細胞抑制活性．這種藥物前體和纖溶酶的作用效果已經(jīng)在體外細胞培養(yǎng)的實驗中得到證實．幾種RGD肽靶向的阿霉素藥物前體中，單環(huán)的RGD4C配體比二環(huán)的RGD4C對整合素表現(xiàn)出更高的親和性，此結(jié)果與3.1論述的結(jié)果相反［32］．同時，單環(huán)RGD4C肽比二環(huán)RGD4C肽水溶性更佳，因此現(xiàn)在的阿霉素復(fù)合物均用RGD單環(huán)肽制備而成．
此外，紫杉醇(PTX)藥物前體中含有二價的c(RGDyk)結(jié)構(gòu)域．實驗證實，復(fù)合物PTX-RGD2在MDA-MB-435乳腺腫瘤與整合素結(jié)合的積聚量，與單純的PTX的RGD肽二聚體相同［33］．因此，其可通過RGD與整合素αvβ3結(jié)合而提高腫瘤治療的靶向性．
RGD與攜帶阿霉素的脂質(zhì)體連接也可用于整合素αvβ3的靶向治療．有研究者［34］對RGD類似物(RGDm)修飾的穩(wěn)定脂質(zhì)體(stabilizedliposomes，SL)攜帶阿霉素在腫瘤部位的積聚，以及向腫瘤細胞內(nèi)傳遞的情況進行了研究．流式細胞實驗和激光共聚焦的結(jié)果顯示，與SL-DOX相比，細胞對RGDm-SL-DOX的結(jié)合及攝取均顯著增加．這表明，RGDm修飾的SL可作為特定藥物靶向載體，其通過受體介導(dǎo)的方式將藥物分子有效靶向至特定腫瘤部位．除此之外，也有以聚乙二醇(PEG)作為連接物連接RGD和脂質(zhì)體的報道．另有文獻報道，上文中提到的RGD10被類脂分子改良后，更容易進入包含阿霉素的脂質(zhì)體［35］．而C26腫瘤模型實驗也證明，這些脂質(zhì)體的連接和內(nèi)化比單純的阿霉素具有更好的抑瘤效果．
3.3.2RGD介導(dǎo)的核酸靶向轉(zhuǎn)染 RGD引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)染的能力在體內(nèi)體外都獲得證實．RGD 引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)染的方式有2種:一是RGD肽共價結(jié)合于PEI，然后再將RGD修飾的PEI與DNA或siRNA形成共聚物;另一種是將RGD肽鏈直接與聚合物主鏈合成在一起(RGD-PEG-PEI)［36］．RGD靶向的核酸載體則包括非病毒類和病毒類2種，非病毒類核酸載體包括陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體和陽離子肽類等，病毒類核酸載體則有腺病毒途徑和非腺病毒途徑［37，38］．
4問題與展望
自從發(fā)現(xiàn)血管新生是腫瘤生長的重要因素，腫瘤新生血管問題成為公認的治療癌癥的有效目標．αvβ3整合素在新生血管表面表達，但不是在EC細胞表面表達，這種有限的表達使其成為理想的靶點．為了開發(fā)這種靶向藥物運輸?shù)奶匦裕壳暗难芯繉ⅵ羦β3整合素的識別序列RGD肽插入蛋白質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)體、病毒和其他的基因運輸載體，通過其靶向作用，將小分子藥物、核酸類藥物等運輸至細胞內(nèi)．而這種化學(xué)合成和重組體聚合物的途徑都是可行的，都能促進藥物靶向領(lǐng)域中RGD介導(dǎo)的藥物運輸?shù)膹V泛應(yīng)用．
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