摘 要: 生物活性肽是一類對生物機(jī)體有益且易被機(jī)體吸收的小分子聚合物, 是由 2~20 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)片段, 其功能性質(zhì)由氨基酸組成和排列順序決定。植物是生物活性肽的天然寶庫, 植物源生物活性肽種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎, 是近年來的研究熱點(diǎn)。生物活性肽被視為營養(yǎng)保健品和功能食品成分, 除了含有豐富的營養(yǎng)價值之外, 還具有抗氧化、降血壓、抑菌、降血脂和維持血糖水平平衡等功能, 可利用其功能治療、控制和預(yù)防慢性疾病, 對食品、醫(yī)藥和美容等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。本文綜述了近 5 年從植物中獲取生物活性肽的最新進(jìn)展, 系統(tǒng)地總結(jié)了抗氧化肽、降壓肽、抗菌肽、降血糖肽和降血脂肽的作用機(jī)制, 與目前最常見的健康問題進(jìn)行對應(yīng)說明。對生物活性肽的制備方法、分離純化和鑒定技術(shù)進(jìn)行總結(jié)比較, 并對生物活性肽的未來發(fā)展趨勢以及在實(shí)際應(yīng)用中遇到的問題進(jìn)行展望, 為未來植物源生物活性肽的進(jìn)一步研究開發(fā)與應(yīng)用提供參考。
近年來, 由于飲食不均衡、作息不規(guī)律和生活壓力過大等種種因素引起的如高血脂、高血壓和高血糖等一系列健康問題日趨嚴(yán)重, 尋求一種天然來源、效果明顯且對人體健康無不良作用的治療藥物已經(jīng)迫在眉睫。生物活性肽是從蛋白質(zhì)中釋放出來的, 其功能活性取決于氨基酸的組成及排列順序, 能夠滿足人體健康的不同需求, 具有無副作用且易被人體吸收的優(yōu)點(diǎn)[1]。植物作為生物活性肽的一種寶貴來源, 與動物相比, 植物資源更豐富、高度可再生且成本更低, 從植物中獲取生物活性肽將會成為一種發(fā)展趨勢[2‒3]。特別是近年來, 植物活性肽的許多優(yōu)異功能被發(fā)掘, 例如抗氧化、抗癌、降血壓、抑菌、改善記憶力、降血脂和維持體內(nèi)血糖平衡等, 正基于此優(yōu)異品質(zhì), 生物活性肽在醫(yī)藥行業(yè)具有優(yōu)良的應(yīng)用前景, 世界各國研究學(xué)者欲開發(fā)功能肽作為人工合成藥物的理想替代品[4]。不僅如此, 除了治療作用之外, 還能預(yù)防或降低一些疾病的發(fā)生風(fēng)險[5]。目前, 關(guān)于生物活性肽的綜述專注于一種功能的肽類或者是一種作物中發(fā)現(xiàn)的活性肽, 還未系統(tǒng)地介紹不同植物源的功能肽及制備分離技術(shù)。本文從植物源出發(fā), 系統(tǒng)地總結(jié)了生物活性肽的功能、制備、分離純化和鑒定技術(shù), 以期為后續(xù)活性肽的深入研究及應(yīng)用開發(fā)提供參考。
1 生物活性肽的概述
生物活性肽是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物, 是一種特定的蛋白質(zhì)片段, 是由 2~20 個氨基酸組成的序列, 其分子量小于 10 kDa[6‒7]。由于生物活性肽是一類小分子化合物, 消化后的生物活性肽能夠被腸道直接吸收, 從而增加其在生物體內(nèi)的利用度。植物源生物活性肽按照其發(fā)揮的功能劃分可分為抗氧化肽、降血壓肽、抗菌肽、降血糖肽、降血脂肽、抗癌肽和抗炎肽等。
2 常見的幾種植物源生物活性肽
機(jī)體在代謝過程中會有自由基產(chǎn)生, 當(dāng)自由基的過度產(chǎn)生或者自由基得不到及時清除時會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化防御機(jī)制失衡, 從而引發(fā)機(jī)體組織的氧化損傷和細(xì)胞凋亡。自由基的增加不僅僅會加快機(jī)體的衰老速度, 甚至還會引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問題(如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心腦血管疾病等)[8]。迄今為止, 解決這些因自由基過多引起的健康問題的方法大多都是使用藥物進(jìn)行干預(yù)治療, 而利用生物活性肽的功能進(jìn)行干預(yù)或許是一個不錯的選擇。
從植物中獲取的抗氧化肽能夠最大程度地減少自由基對細(xì)胞的損傷和對機(jī)體的傷害, 是一種對人體有益的功能性化合物。蛋白酶通過水解蛋白質(zhì)特定的肽鍵達(dá)到釋放活性的目的, 而蛋白酶種類的選擇與蛋白水解物的抗氧化活性密切相關(guān), ZAKY 等[9]從米糠蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)用復(fù)合蛋白酶水解米糠蛋白的水解度最高達(dá)到 20.25%, 通過對米糠蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除實(shí)驗(yàn)、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium salt, ABTS]自由基抑制實(shí)驗(yàn)和金屬螯合活性的測定發(fā)現(xiàn)用風(fēng)味蛋白酶水解米糠蛋白所釋放出來的肽的抗氧化活性最強(qiáng)。WALI 等[10]用 4 種不同的蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)對鷹嘴豆芽蛋白進(jìn)行處理, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)中性蛋白酶處理得到的肽具有更高的抗氧化活性。這說明蛋白酶的專一性決定了蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn), 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被不同的蛋白酶水解特定的肽鍵后暴露出的不同的疏水氨基酸決定了其抗氧化活性的強(qiáng)弱。
蛋白質(zhì)在酶水解的過程中會產(chǎn)生不同分子量大小的肽, 分子量大小與抗氧化活性的強(qiáng)弱有關(guān)。低分子量肽(<3 kDa)的抗氧化能力總是高于高分子量肽, 這可能是因?yàn)榈头肿恿康目寡趸哪軌蚋行У嘏c自由基發(fā)生反應(yīng), 且更容易被人體所吸收[11]。MESHGINFAR 等[12]用堿性蛋白酶水解番茄種子蛋白, 并用超濾的方法將番茄種子蛋白水解物分離成不同分子量大小的肽組分。其中分子量小于3 kDa 的肽組分的抗氧化活性(73.15% DPPH 清除率和 60.1%磷鉬酸銨還原能力)要高于其他較大分子量組分(>3 kDa)的抗氧化活性。SUN 等[13]采用離子交換色譜、凝膠過濾色譜和半制備反相高效液相色譜法對桑葉蛋白水解物進(jìn)行分離純化, 發(fā)現(xiàn)分子量為 0.45~1.40 kDa 的寡肽的 DPPH 和 ABTS自由基清除活性最強(qiáng)(分別為 87%和 33%), 證明了桑葉蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性與分子量的分布有關(guān), 并且發(fā)現(xiàn)較低分子量肽(<1 kDa)是最有效的抗氧化劑。不僅如此, 蛋白質(zhì)在酶水解之前對蛋白質(zhì)底物進(jìn)行預(yù)處理也能夠改善和提高生物活性肽的生物活性[14]。蛋白質(zhì)預(yù)處理最常見的方法有超聲預(yù)處理、脈沖電場、微波和高壓等, 將蛋白質(zhì)底物用超聲波預(yù)處理后再進(jìn)行酶解不僅可以提高蛋白質(zhì)的水解度, 還可以加快蛋白質(zhì)的酶解速度[15]。這可能是因?yàn)槌暡〞䦟Φ鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響, 使酶解反應(yīng)過程中酶和底物能夠更有效地發(fā)生碰撞, 從而達(dá)到所需要的預(yù)期效果, 提高生物利用度[16]。由此可看出抗氧化活性與人體健康密切相關(guān), 利用生物活性肽的抗氧化功能可以降低許多疾病的患病風(fēng)險, 將抗氧化活性應(yīng)用于功能食品這一領(lǐng)域?qū)泻芎玫陌l(fā)展前景。
高血壓是世界范圍內(nèi)的一個重大的健康問題, 特別是近些年來, 人們面對的壓力增大、飲食和作息不規(guī)律, 高血壓等問題也接踵而來。一些治療高血壓的藥物雖然能夠維持人體的血壓處于一個正常水平, 但長期服用也會對健康帶來一定的影響, 而從植物中獲取降壓功能的生物活性肽可以作為市售降壓藥物的理想替代品, 其生物學(xué)機(jī)制主要是抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (angiotensin-converting enzyme, ACE), 從而通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)來調(diào)節(jié)體內(nèi)血管收縮壓和舒張壓[17]。
植物蛋白水解物中 ACE 的抑制活性是治療高血壓的關(guān)鍵, 這是因?yàn)?ACE 是治療高血壓的重要靶點(diǎn), 肽的 ACE抑制活性取決于 N 或 C 末端氨基酸殘基對 ACE 活性位點(diǎn)的親和力, 而低分子量肽更容易與 ACE 活性位點(diǎn)相結(jié)合。因此, 較低分子量肽(<3 kDa)可以作為 ACE 活性的優(yōu)選抑制劑[18‒19]。AONDONA 等[20]用超濾的方法將芝麻蛋白水解物分成不同分子量大小的組分進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)低分子量芝麻肽(<1 kDa)具有很好的 ACE 抑制能力(81%), 而較大分子量肽 (3~10 kDa) 表現(xiàn)出更強(qiáng)的腎素抑制特性(75%~85%)。ZHENG 等[21]用凝膠色譜法、反相高效液相色譜法純化的裸燕麥球蛋白水解產(chǎn)物中鑒定出了一種新的ACE抑制肽 SSYYPFK (890.4 Da), 并且通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了這種 ACE 抑制肽可以降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓。SONKLIN 等[22]用菠蘿蛋白酶水解脫脂綠豆粕, 用超濾的方法將綠豆粕蛋白水解物分離成不同的肽組分, 其中分子量<1 kDa 的肽組分是最活躍的 ACE 和腎素抑制劑, 并且從小于 1 kDa 的肽組分中鑒定出了 5 種肽(LPRL、YADLVE、LRLESF、HLNVVHEN、PGSGCAGTDL)具有降壓作用, 其中 LRLESF 是最有效的 ACE 抑制劑[半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration, IC50)為 5.4 µmol/L]。由于 YADLVE 在 N 末端有酪氨酸、C 末端有谷氨酸, 因此被認(rèn)為是最強(qiáng)的腎素抑制劑, 其抑制率高達(dá) 97%。通過對自發(fā)性高血壓大鼠口服給藥后, 血壓顯著降低。這表明低分子量肽(<3 kDa)相對于高分子量肽(>3 kDa)顯示出更優(yōu)異的 ACE 抑制能力, 具有更好的降壓效果。
肽的降壓活性還與蛋白酶的種類有關(guān)。不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同, 制備所得到的肽的結(jié)構(gòu)會有所差異, 從而導(dǎo)致肽的降壓活性不一致。堿性蛋白酶是一種絲氨酸酶, 偏向于形成末端帶有疏水氨基酸的肽, 胰蛋白酶更傾向于切割與芳香氨基酸或者是不帶電的支鏈氨基酸殘基結(jié)合的肽鍵, 而胃蛋白酶更偏愛裂解疏水性和芳香族殘基[23]。因此, 暴露的疏水氨基酸可以顯著提高多肽的 ACE 活性。SHU 等[24]用 3 種不同的商業(yè)酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶)對腰果蛋白進(jìn)行水解并分析分子量小于 3500 Da多肽的 ACE 活性, 發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物比其他兩種酶的水解產(chǎn)物的 ACE 抑制活性高, 并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了腰果肽可以在小鼠體內(nèi)發(fā)揮降壓作用。PABLO‐ OSORIO 等[25]用 4 種不同的蛋白酶(堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和 α 糜蛋白酶)對奇亞籽蛋白進(jìn)行處理, 發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶水解物 ACE 抑制活性最強(qiáng)(IC50=0.128 mg/mL)。
服用降壓藥無疑是目前降低血壓最高效的方法, 但長期使用高血壓藥物進(jìn)行治療顯示出對人體較大的傷害, 尤其是高血壓患者的年輕化因?yàn)樗幬锏母弊饔卯a(chǎn)生了抗拒心理[26]。此時, 肽無副毒作用的優(yōu)勢盡然發(fā)揮, 肽不僅可以作為一種治療手段成為制藥行業(yè)的新寵, 還可以通過功能食品的渠道進(jìn)行身體的內(nèi)部調(diào)節(jié), 從而達(dá)到人體血壓的平衡。
耐藥菌株的出現(xiàn)是對人類健康的最大挑戰(zhàn), 為尋求新的有效抗菌藥物來保護(hù)公眾健康敲響了警鐘。人們迫切需要找到抗菌肽等替代品解決抗生素危機(jī)[27‒28]。而抗菌肽正是人們目前找到的最理想的抗生素替代物, 并且越來越多的抗菌肽資源被發(fā)現(xiàn)并被深入研究�？咕姆譃� 3 種類型: 抗菌、抗真菌以及抗病毒化合物�？咕哪軌蚱茐牟≡募�(xì)胞膜, 破壞其結(jié)構(gòu)完整性從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[29]。天然抗菌肽擁有與傳統(tǒng)抗生素同樣的殺菌能力, 并且抗菌肽具有明顯的優(yōu)勢, 不僅能夠有效地調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力, 而且不易出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性, 是目前最有發(fā)展前途的廣譜抗生素候選藥物之一[30]。近些年對于抗菌肽的研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展, GARZON 等[31]從高粱廢谷物蛋白水解物中分離出了加密在高粱蛋白中的抗菌肽, 并且通過最小濃度抑制方法評估了其抗菌活性。KONG 等[32]運(yùn)用離子交換色譜和反相高效液相色譜結(jié)合的方法對棉籽蛋白酶解物進(jìn)行純化, 并且從純化的棉籽蛋白酶解物中鑒定出了 3 種新型抗菌肽(HHRRFSLY、KFMPT 和 RRLFSDY)。這些抗菌肽能夠破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜, 從而達(dá)到抑菌效果。通過分子對接發(fā)現(xiàn)這 3 種抗菌肽能夠通過氫鍵和鹽橋與表面蛋白的活性位點(diǎn)相結(jié)合, 進(jìn)而達(dá)到殺菌作用。HEYMICH等[33]從鷹嘴豆貯藏蛋白酶解物中鑒定出了 21 種抗菌肽, 對病原菌、腐敗細(xì)菌以及 2 種耐藥菌株均具有抗菌活性, 其最低抑菌濃度為 15.6 μmol/L, 與傳統(tǒng)的食品防腐劑相比, 抗菌肽的抗菌活性更高。從植物蛋白中分離出來的抗菌肽含有疏水性氨基酸, 而肽的疏水性會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的功能紊亂, 以致細(xì)菌細(xì)胞壁的破壞, 從而達(dá)到抑菌效果。
目前, 用于治療的抗生素藥物種類十分有限, 隨著抗生素耐藥性危機(jī)的出現(xiàn), 促使人們尋找新的藥物解決無藥可醫(yī)的危險境地。肽就是這樣一種新型抗生素替代物的代表, 抗菌肽的發(fā)現(xiàn)為解決抗生素危機(jī)提供了方向, 對未來抗菌肽的開發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ)。
糖尿病是一種慢性代謝性疾病, 最典型的特性為體內(nèi)血糖失調(diào), 糖尿病患者往往會增加其他相關(guān)疾病的患病風(fēng)險。近幾年來, 糖尿病的患病率正在以驚人的速度上漲, 治療糖尿病并預(yù)防其并發(fā)癥一直是一個棘手的問題, 而抗糖尿病功能肽的發(fā)現(xiàn)很好地解決了這一問題[34]�？固悄虿‰氖峭ㄟ^抑制 α 淀粉酶、α 葡萄糖苷酶和二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)發(fā)揮作用的, 能夠有效地降低血清葡萄糖水平, 從而達(dá)到治療糖尿病的目的[35]。有些研究已經(jīng)證明了蛋白質(zhì)水解物中含有抗糖尿病活性的肽 , 從燕麥球蛋白中獲取的燕麥肽能夠有效地抑制Caco-2 細(xì)胞中 DPP-Ⅳ的活性, 對 α 葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用[36]。WANG 等[37]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了核桃蛋白水解肽的抗糖尿病活性, 核桃蛋白水解物通過超濾的方法分離出3種不同分子量大小的多肽組分, 發(fā)現(xiàn)中等分子量(3~10 kDa)的核桃水解肽表現(xiàn)出最高的 α-葡萄糖苷酶抑制率(61.73%), 能夠有效地降低血糖水平。KARIMI 等[38]發(fā)現(xiàn)玉米胚芽蛋白水解物的抗糖尿病潛力與蛋白酶的種類有關(guān), 研究表明風(fēng)味蛋白酶水解物(<2 kDa)對α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳(41.3%), 堿性蛋白酶水解物(2~10 kDa)表現(xiàn)出最強(qiáng)的 α-淀粉酶抑制活性(71.3%)和最強(qiáng)的 DPP-Ⅳ的抑制活性(45.9%)。
抗糖尿病功能肽能維持機(jī)體血糖水平處于相對平衡狀態(tài), 對機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮著重要作用。由于水解過程產(chǎn)生的不是單一肽, 而是混合肽類化合物, 還需要經(jīng)過一系列的分離純化才能得到抗糖尿病肽, 當(dāng)其作為一種治療藥物被研發(fā)時, 需要進(jìn)一步進(jìn)行人體臨床驗(yàn)證。
隨著生活水平的提高以及生活節(jié)奏的加快, 人們在久坐不動并且缺乏運(yùn)動的同時攝入一些高膽固醇的食物會導(dǎo)致體內(nèi)血脂水平升高, 長期的高脂飲食不僅會導(dǎo)致肥胖還會引起血脂異常以及一系列代謝紊亂的并發(fā)癥。目前市面上降血脂的藥物種類繁多, 治療效果明顯, 但不足之處是這些藥物價格不僅昂貴還會有一定的副作用。降血脂的作用途徑主要是通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝和甘油三酯水平[39]。YANG 等[40]發(fā)現(xiàn)在堿性蛋白酶 2.4 L、pH 7.9、水解溫度62.4℃、酶含量 6.98%、底物濃度 4.13%、水解時間 4.23 h的條件下得到的核桃粕肽能夠改善長期高脂飲食大鼠的脂質(zhì)代謝, 對肝臟也有一定的保護(hù)作用。AJAYI 等[41]發(fā)現(xiàn)用菠蘿蛋白酶產(chǎn)生的莧菜蛋白水解物鑒定出了 3 個具有胰脂肪酶抑制活性的肽(FPFPPTLGY、 FGAPR 和FPFVPAPT), 其中 FPFVPAPT 對膽固醇酯酶具有抑制活性, 能夠加快膽固醇代謝從而有效降低血液中膽固醇水平, 并且能夠有效地預(yù)防和治療動脈硬化。
血脂過高容易引起血管堵塞, 是患者中風(fēng)的原因之一, 危險性極高且患病后的后遺癥明顯, 目前對于高血脂患者的治療方案大多是長期服用阿托伐他汀類藥物降低血液粘稠度[42]。降血脂肽的研究可以從根源對此類疾病進(jìn)行預(yù)防, 在功能食品的開發(fā)中占有巨大優(yōu)勢。
除了上述功能活性外, 生物活性肽還有改善人體記憶力、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗癌等功能。從植物中獲取的生物活性肽往往是多種功能并存。REN 等[43]發(fā)現(xiàn)了核桃水解肽(<3 kDa)具有較強(qiáng)的抗氧化作用, 對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用, 并且在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)核桃肽能夠改善小鼠記憶力和學(xué)習(xí)障礙。在小米的研究中也驗(yàn)證了肽類可以具有多種活性, 小米蛋白水解物對胰脂肪酶有抑制作用和抗炎作用, 并發(fā)現(xiàn)抗炎肽中甘氨酸的含量最高[44]。XU 等[45]從大米蛋白水解物中分離純化出了具有免疫調(diào)節(jié)作用的六肽(YGIYPR), 在 12.5~100.0 μg/mL 的范圍內(nèi)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的增殖, 即使在最小的劑量下也能達(dá)到很好的增殖效果。CHEN 等[46]從黑豆蛋白水解物中分離出具有抗氧化和抗癌活性肽, 分子量小于4 kDa 的黑豆肽具有最高的 DPPH 自由基清除活性和羥基自由基清除活性(IC50=96.19、30.53 μg/mL), 對人肝(human hepatoellular carcinomas, HepG2)、肺(macrophage chemotactic factor-7, MCF-7)、宮頸(helen lane, Hela)癌細(xì)胞的生長具有抑制作用。多功能肽用于醫(yī)學(xué)既能夠解決某些疾病問題, 又能預(yù)防和減少并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)率, 這一發(fā)現(xiàn)對醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到了一定的推動作用。
3 植物源生物活性肽的制備、分離純化與鑒定
獲取生物活性肽最常用的方法是酶解法, 與微生物發(fā)酵法相比, 蛋白酶水解時間短且更易控制水解條件, 但肽的生物活性與提取條件密切相關(guān)。PEI 等[47]用酶解法從青稞中提取抗菌肽, 研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對青稞水解物抗菌活性的影響, 發(fā)現(xiàn)青稞用胰蛋白酶酶解 4 h 后, 肽的抗菌活性達(dá)到最高值, 并且利用磁性脂質(zhì)體吸附技術(shù)純化出了一種新型的抗菌肽(大麥素), 而大腸桿菌對大麥素十分敏感。TOK等[48]在對大麥籽粒的研究中發(fā)現(xiàn)了胰蛋白酶水解物具有多種功能活性(抗氧化、抗糖尿病和抗菌)。LIU 等[49]采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解法水解松仁蛋白, 發(fā)現(xiàn)松仁肽具有清除自由基的能力, 并且發(fā)現(xiàn) 200 μg/mL 的松仁蛋白水解物作用于 HepG2 細(xì)胞時, 其活力為 97.38%, 證明松仁肽對細(xì)胞沒有毒性且不會對細(xì)胞有抑制作用。不僅如此, 松仁蛋白水解物還能降低 D-半乳糖致衰老小鼠血清、心臟和肝臟中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量, 提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性。酶解法是獲取肽類化合物最溫和的方法, 所獲得的酶解產(chǎn)物往往具有多種活性, 因此也是目前獲取肽的最常用方法。
微生物菌種在自身生產(chǎn)代謝過程中會有蛋白酶的產(chǎn)生, 而這些蛋白酶會對蛋白質(zhì)起到降解作用, 使蛋白質(zhì)降解為分子量更小的肽段或氨基酸。微生物發(fā)酵法相對于酶解法而言, 其最大優(yōu)勢在于以低成本獲取高活性高產(chǎn)量的肽。WEI 等[50]發(fā)現(xiàn)豆腐乳在微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生抗氧化肽和 ACE 抑制肽, 并且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間與肽的生物活性有關(guān), 其生物活性隨著發(fā)酵而顯著增加。SHARMA 等[51]利用植物乳桿菌 NCDC374 處理亞麻籽乳制備功能肽并進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化, 以接種量和發(fā)酵時間為影響因素, 蛋白水解率、抗氧化活性和 ACE 抑制率為響應(yīng)值得到最佳工藝。當(dāng)接種量為 4.2%, 發(fā)酵時間為 126 h 時, ACE 抑制率和 DPPH抑制活性達(dá)到最大(41.35%、67.38%)。發(fā)酵往往需要的時間較長, 而過長的時間可能會帶來一些安全隱患(如污染), 這也是微生物發(fā)酵法未來需要解決的問題。
肽的合成方法主要包括化學(xué)合成法和基因重組法。化學(xué)合成法主要應(yīng)用于已知肽鏈的合成, 通過氨基酸的縮合來實(shí)現(xiàn)。化學(xué)合成法能夠通過改變氨基酸的種類和排列順序改善肽的性質(zhì), 因此, 合成肽往往具有更高的生物利用度[52]。基因重組法是將基因整合到宿主中進(jìn)行克隆表達(dá)以獲取重組多肽, 解決了傳統(tǒng)制備方法的局限性, 但表達(dá)過程中會受到表達(dá)系統(tǒng)的影響[53]�；瘜W(xué)合成法和基因重組法都是對已知序列的肽鏈進(jìn)行合成, 開發(fā)周期較長, 且提取成本相對較高。因此, 合成法并沒有被普遍應(yīng)用于肽的制備[54]。針對于活性肽在不同領(lǐng)域的應(yīng)用, 制備方法的選擇十分重要, 生物活性肽的常見制備方法整理見表 1。
蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中含有未被水解的蛋白質(zhì)、未完全水解產(chǎn)生的多肽以及完全水解產(chǎn)生的游離氨基酸。為了能夠更加清楚地了解肽的活性、作用機(jī)制及其結(jié)構(gòu), 需要通過分離純化以及鑒定完成。根據(jù)混合肽的物理性質(zhì)和分子極性的差異進(jìn)行分離, 可以采取不同的分離方法。在實(shí)驗(yàn)室中最常用的分離技術(shù)有超濾、凝膠過濾色譜、離子交換色譜、液相色譜和電泳等。在未來的研究中可以運(yùn)用一些新技術(shù)去獲取更高純度和高活性的生物活性肽。
生物活性肽分離純化的第一步往往是通過超濾實(shí)現(xiàn)。超濾是根據(jù)超濾膜的孔徑不同對不同分子量大小的生物活性肽進(jìn)行截留分離, 是一種物理分離方式, 優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且不會對生物活性產(chǎn)生影響。但對于一些分子量大小相近的生物活性肽無法通過超濾膜進(jìn)行分離, 因此超濾法只能用于生物活性肽的粗分離。XIA 等[58]使用超濾膜(3 kDa)將綠豆蛋白水解物分離成兩個組分, 發(fā)現(xiàn)分子量小于 3 kDa 的肽組分抗氧化活性更強(qiáng), 并從中鑒定出了8 個多肽, 其中 WGN、AW、RGWYE、GVPFW 不僅具有較高的抗氧化活性, 還對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用, 并且能夠特異性調(diào)控 HepG2 細(xì)胞的 MDA 含量、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性和總谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。LI 等[59]使用 3 kDa 的超濾管對大孔樹脂脫鹽的黑豆蛋白肽進(jìn)行粗分離并對其 ACE 抑制活性進(jìn)行測定, 發(fā)現(xiàn)超濾后的組分 ACE 抑制活性增強(qiáng), 超濾前黑豆蛋白水解物 ACE 抑制活性為 72.38%, 脫鹽處理后 ACE 抑制活性為 74.45%, 而超濾處理后的黑豆肽(<3 kDa)能夠抑制80.53%的 ACE 活性。超濾膜是一種快速分離的方式, 由于其濾孔容易被堵塞, 并且分離出來的產(chǎn)物純度不夠高, 一般還需要對超濾產(chǎn)物進(jìn)一步純化。
色譜法是分離純化中應(yīng)用最廣泛的方法, 在肽的分離純化中主要會用到凝膠過濾色譜、離子交換色譜、高效液相色譜以及反相高效液相色譜。
凝膠過濾色譜法是以分子篩的形式根據(jù)分子的大小差異進(jìn)行分離。當(dāng)肽溶液流過色譜柱時, 大分子會在孔隙外以相對較快速度先出來, 相反, 小分子會進(jìn)入固定相基質(zhì)孔隙中以較慢的速度后出來, 從而根據(jù)分子量大小達(dá)到分離效果。這種分離方式操作簡單、條件溫和、成本較低且無污染, 廣泛應(yīng)用于多肽的分離純化。但其分離效果受到填充料種類、洗脫速度和色譜柱體積等因素的影響。YAO 等[60]使用 Sephadex G-25 凝膠過濾將質(zhì)量濃度為 25 mg/mL 的油茶籽粕蛋白水解液(<1 kDa)以 1 mL/min 的洗脫速度進(jìn)行洗脫, 分離出了 3 個組分的 ACE 抑制肽, 最高 ACE 抑制率達(dá)到 79.24%, IC50=0.678 mg/mL。在核桃蛋白水解物的研究中使用凝膠過濾、高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)純化并鑒定出了 3 種 ACE 抑制肽, 其中 GVVPHN 是由 6 個氨基酸組成的純化肽, 其抑制率最高[61]。
離子交換色譜是利用固定相和流動相中電荷間的相互作用, 使多肽所攜帶的電荷與離子交換劑中相反的電荷相結(jié)合達(dá)到分離目的。離子交換技術(shù)又分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜, 對于固定相的選擇取決于流動相所攜帶的電荷為陰離子還是陽離子。KONG 等[62]使用 SP Sephadex C-25 葡聚糖凝膠柱純化脫脂核桃粕蛋白水解物(<5 kDa), 用乙酸緩沖液(pH 4)平衡柱子, 用含有 2 mol/L NaCl 的 10 mmol/L 的乙酸溶液對分子量小于 5 kDa 的肽進(jìn)行梯度洗脫, 收集到了兩個級分的 DPP-Ⅳ抑制肽, 并發(fā)現(xiàn)含有堿性氨基酸殘基的肽級分具有更高的 DPP-Ⅳ的抑制活性。MIJITI 等[63]用 C18 反相柱色譜和離子交換色譜從小茴香種子中分離出對細(xì)菌(大腸桿菌、金色葡萄球菌)和真菌(白色念珠菌)均具有抗菌作用的抗菌肽。
每一種分離方法都具有不同的特點(diǎn), 選擇合適的分離方式能夠更好的分離混合物。單一的分離純化技術(shù)對生物活性肽進(jìn)行分離純化效果可能不佳, 需要結(jié)合多種分離純化技術(shù)的特性進(jìn)行分離。純化的效果對肽的功能活性也有一定的影響, 純度越高其功能活性越強(qiáng)。
生物活性肽經(jīng)過一系列的分離純化后, 需要對所獲得的肽序列進(jìn)行鑒定和解析, 以了解肽的結(jié)構(gòu)與其功能之間的聯(lián)系。質(zhì)譜鑒定法已經(jīng)是一項(xiàng)十分成熟的技術(shù), 常用的方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、電噴霧電離質(zhì)譜法等, 在多肽氨基酸序列鑒定中使用率最高的是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法, 此方法結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)(靈敏度高、分辨率高、適用范圍廣和鑒定速度快)。MA 等[66]用高效液相色譜-質(zhì)譜法在辣木蛋白肽中鑒定出了兩種 ACE 抑制活性較強(qiáng)的序列, 分別為 LGF 和 GLFF, 并且發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸是影響 ACE 抑制活性的關(guān)鍵因素。FAN 等[67]用電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜法從藜麥蛋白水解物中鑒定出了具有抗癌活性的肽(FHPFPR、NWFPLPR、HYNPYFPGGA), 對結(jié)合組蛋白去乙�；� 1 (histone deacetylase 1, HDAC1)具有較好的抑制活性, 能夠抑制 Caco-2 細(xì)胞中 HDAC1 的表達(dá), 從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的目的。質(zhì)譜技術(shù)在肽中的研究發(fā)揮了重要作用, 為進(jìn)一步探究生物活性肽的作用機(jī)制提供了證據(jù)。
4 結(jié)束語
生物活性肽是一種十分有發(fā)展前途的小分子化合物, 其多種功能活性都對人體有健康益處。隨著對生物活性肽研究的深入, 其多種功能被陸續(xù)發(fā)掘出來。目前對于生物活性肽的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和活性測定的方法已經(jīng)十分完善。近幾年對于生物活性肽的研究與開發(fā)涉及多個領(lǐng)域, 如在醫(yī)藥行業(yè)可以作為慢性疾病治療藥物的一種理想且安全高效的替代品, 也可以代替抗生素發(fā)揮作用, 解決目前遭遇的抗生素危機(jī)而導(dǎo)致無藥可醫(yī)的狀況; 在食品行業(yè)可以研發(fā)出具有某種功能特性的保健品, 也可以作為天然來源的食品添加劑和食品保鮮劑; 在美容行業(yè)可作為抗衰老和美容護(hù)膚的天然產(chǎn)品。
植物源生物活性肽的來源十分廣泛, 但目前研究的植物種類還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠, 例如, 山桐子等植物中生物活性肽的研究還未展開, 需要對更多的植物源進(jìn)行探索和發(fā)掘其功能活性。此外, 生物活性肽的開發(fā)應(yīng)用處于一個實(shí)驗(yàn)階段, 還缺乏人體臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 暫時無法以產(chǎn)品的形式進(jìn)入商業(yè)化大生產(chǎn), 在未來對生物活性肽的研究方面更應(yīng)該著重于人體健康的構(gòu)效關(guān)系, 早日為人類健康做出貢獻(xiàn)。
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