摘要:目的 研究蜂毒肽(Melittin,Mel)與依布硒啉(Ebselen,EbSe)對(duì) 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)的協(xié)同抗菌活性和機(jī)制。方法 96微孔板實(shí)驗(yàn)結(jié)合分光光度法(visiblespectrophotometry,UV-vis)檢測蜂毒肽-依布硒啉的抗金黃色葡萄球菌作用;電子顯微鏡(electronmicroscopy,EM)觀察蜂毒肽-依布硒啉處理后金黃色葡萄球菌的細(xì)胞形態(tài)。通過5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoicacid),DTNB]獲得電子后顯色的能力,觀察蜂毒肽-依布硒啉對(duì)細(xì)菌硫氧蛋白還原酶(thioredoxinreductase,TrxR)活性的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測蜂毒肽-依布硒啉對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)量的影響;使用活性氧清除劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)復(fù)測上述指標(biāo)。結(jié)果 蜂毒肽與依布硒啉具有協(xié)同殺菌作用,可協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌 TrxR,顯著上調(diào)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)活性氧產(chǎn)量。DTT挽救實(shí)驗(yàn)證明蜂毒肽-依布硒啉對(duì)細(xì)菌造成損傷是通過活性氧途徑實(shí)現(xiàn)。結(jié)論 蜂毒肽可通過協(xié)同依布硒啉靶向金黃色葡萄球菌 TrxR,上調(diào)胞內(nèi)活性氧的大量產(chǎn)生,介導(dǎo)細(xì)菌死亡。
金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcusaureus,S.aureus)是導(dǎo)致人類感染性疾病中最常見的病原菌之一[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,由金黃色葡萄球菌引起的感染占臨床感染性疾病的第2位,僅次于大腸埃希菌[2]。而近年來越來越多耐藥性金黃色葡萄球菌菌株的出現(xiàn),已然成為臨床治療感染性疾病的棘手難題之一[3]。遺憾的是,目前大多一線抗生素已無法從容應(yīng)對(duì)臨床上日益嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌感染現(xiàn)狀。鑒于上述情況,找尋高效安全的抗生素或先導(dǎo)藥物,已成為當(dāng)今醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的迫切需求。
蜂毒肽(Melittin,Mel)是一種水溶性多肽,是蜂毒的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)小劑量的蜂毒肽可產(chǎn)生廣泛的抗炎作用[4-7]。不僅如此,蜂毒肽還對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌[8]甚至耐甲氧西林金黃色葡 萄 球 菌 (Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)等多種細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌活性。且已有研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)抗生素的聯(lián)合使用可進(jìn)一步提高蜂毒肽的抗菌活性[9],但其機(jī)制并不明確,仍待研者們進(jìn)一步探索。
本團(tuán)隊(duì)長期致力于抗菌活性物質(zhì)及其新靶標(biāo)的篩選研究工作[10-16],且前期已以硫醇氧化還原系統(tǒng)(thiol-dependentredoxsystem,TDRS)作 為 靶 標(biāo),篩選出含硒化合物-依布硒啉(Ebselen,EbSe)。而我們的研究發(fā)現(xiàn),依布硒啉可通過與金黃色葡萄球菌 的 硫 氧 還 蛋 白 還 原 酶 (thioredoxinreductase,TrxR)形成難以還原的硒硫鍵,以阻斷電子流傳遞,破壞細(xì)菌胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài),誘導(dǎo)細(xì)菌死亡[13];同時(shí),依布硒啉在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中則可作為宿主細(xì)胞TrxR的底物,幫助電子流的傳遞,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[17]。此外,依布硒啉是一種已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的藥物,具有良好的人體耐受性及生物安全性[18],是理想的抗菌活性候選藥物。
基于團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ),本文以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象,探究蜂毒肽的抗菌活性,并進(jìn)一步探討其是否可與依布硒啉共同靶向 TrxR 發(fā)揮協(xié)同抗菌活性。
1 材料與方法
金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC25923TM 菌株,多重耐藥金黃色葡萄球菌1072763、0883453、1074029菌株,由宜昌市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。根據(jù)細(xì)菌的起始數(shù)量不同,本文涉及到的不同實(shí)驗(yàn)選用低濃度藥物組(2.5μmol/L蜂毒肽與1μmol/L依布硒啉)和高濃度藥物組(10μmol/L 蜂毒肽與40μmol/L 依布硒啉)。其中,最小抑菌濃度,抗生素后效應(yīng)及 DTT 挽救實(shí)驗(yàn)使用菌量較小,選用低濃度藥物組;而5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、透射電鏡,流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)所用菌量較大,選用高濃度藥物組。
恒 溫 培 養(yǎng) 箱 (中 國 BPX-52);恒 溫 搖 床 (中 國TS-100C);-80℃超低溫冰箱(美國 ThermoFisherScientific);純水儀(美國 Milli-QIntegral);移液器(德國 Eppendorf);錐形瓶(中國蜀牛);瞬時(shí)離心機(jī)(德國 TOMOS);微型離心機(jī)(美國 Bio-Rad);電子天平(中國 TE212-L/TE2101-L);振蕩混勻儀(美國 Vortex-2GenieSI);金屬接種環(huán)(中國生工)。
依布 硒 啉 (美 國 Target MoleculeCorp;貨 號(hào)60940-34-4;批 號(hào) 20210506);蜂 毒 肽 (美 國 Sell-eck);蛋白胨(英國 OXOID);酵母提取物(英國 OXOID);二甲基亞砜(Sigma-Aldrich);瓊脂糖(西班牙BIOWEST),甘 油 (中 國 塞 維 爾 生 物 科 技 有 限 公司);硫氧還蛋白(瑞典IMOC);BCA 蛋白定量試劑盒(中國普利萊)。
取高壓滅菌過后的潔凈槍頭,從生長金黃色葡萄球菌 ATCC25923TM 、1072763、0883453、1074029菌株的固體溶菌肉湯(Luria-Bertani,LB)培養(yǎng)基平板上挑取單克隆,分別置于提前分裝好的 LB 培養(yǎng)液中,搖床培養(yǎng)8h(37 ℃,180r/min),取第二代對(duì)數(shù)生長期菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
取上述1.4金黃色葡萄球菌 ATCC25923TM ,用 LB培養(yǎng)液調(diào)整至 A600nm =0.4,按1∶1000稀釋混勻后,加入不同濃度梯度的蜂毒肽、依布硒啉、蜂毒肽-依布硒啉混勻,處理完成后,轉(zhuǎn)移混合液至96微孔板,每孔200μL。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),并在不同時(shí)間點(diǎn)于酶標(biāo)儀上測定 A600nm。
根據(jù)Bliss獨(dú)立模型計(jì)算協(xié)同指數(shù),以確定蜂毒肽與依布硒啉是否具有協(xié)同殺菌活性,使用計(jì)算公式如下[19]:S =(Fx/F0)(Fy/F0)-(Fxy/F0)。F0:無藥物作用下細(xì)菌生長速率;Fx,Fy:x、y藥物單獨(dú)作用下細(xì)菌生長速率;Fxy:x、y藥物聯(lián)合作用下細(xì)菌生長速率;S:協(xié)同指數(shù)(S值大小在0 ~ 1之間表示兩者具有協(xié)同作用,且數(shù)值越接近1表示兩藥協(xié)同作用越強(qiáng))。
取上述1.4金黃色葡萄球菌 ATCC25923TM ,用 LB培養(yǎng)液調(diào)整至A600nm=0.4,分別加入蜂毒肽、依布硒啉、蜂毒肽-依布硒啉,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育10min。4℃,8000r/min,5min離心處理后,棄去上清并用 PBS重復(fù)洗滌3次,2.5%戊二醛固定 PBS 重 懸 液,使 用 電 鏡 (electron microscopy,EM)觀察細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu),采集圖像并保存。
取上述1.4金黃色葡萄球菌 ATCC25923TM ,用 LB培養(yǎng)液調(diào)整至 A600nm =0.4。1∶1000稀釋混勻后,與不同濃度梯度的蜂毒肽、依布硒啉、蜂毒肽-依布硒啉孵育。處理完成后,轉(zhuǎn)移混合液至96微孔板,每孔200μL。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24h,于酶標(biāo)儀上每間隔2h測定A600nm。將96微孔板內(nèi)菌液轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中,4 ℃,8000r/min,離心5min處理后,棄去上清并用PBS重復(fù)洗滌3次。加入200μLLB培養(yǎng)液重懸菌體,重新置于96微孔板。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6h,于酶標(biāo)儀上每間隔1h測定 A600nm。
取 上 述 1.4 中 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ATCC25923TM ,用 LB培養(yǎng)液調(diào)整至A600nm=0.4。分別加入蜂毒肽、依布硒啉、蜂毒肽-依布硒啉,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育10min。4 ℃,8000r/min,離心5min處理后,棄去上清并用 PBS重復(fù)洗滌3次。加入200μL裂解液(50mmol/LTris-HCl,2mmol/LEDTA,pH7.5)重懸菌體后,超聲5min直至菌液澄清(2mm 變幅桿,20%功率。頻率為超聲3s,間隔6s),全程冰上操作。離心處理(4 ℃,10000r/min,20min)后取上清。取10μL 蛋白液按1∶10稀釋后作為蛋白量待測樣本。取標(biāo)準(zhǔn) BSA 蛋白樣品,依次稀釋為 1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL、0 mg/mL,取25μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品、待測樣品及200μLBCA 工作液加入96微孔板中混勻,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30min后,酶標(biāo)儀上測定 A562nm。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每組待測樣品濃度,進(jìn)行標(biāo)記。
取待測樣本(含25μg蛋白)定容至20μL,與90μL1 mmol/L DTNB、5μmol/L 硫 氧還蛋白(Trx)、200μmol/L NADPH,在50 mmol/L TrisHCl、2mmol/LEDTA(pH7.5)體系中反應(yīng)。酶標(biāo)儀上連續(xù)測定前10 min 的 A412nm,計(jì) 算 斜 率 代 表TrxR活性。同時(shí),取待測樣本(含25μg蛋白)定容至20μL,與90μL1mmol/LDTNB、100nmol/LTrxR、200μmol/L NADPH,在 50 mmol/L Tris-HCl、2mmol/LEDTA(pH7.5)體系中反應(yīng)。酶標(biāo)儀上連 續(xù) 測 定 前 10 min 的 A412nm,計(jì) 算 斜 率 代 表Trx活性。
取上述1.4 中金黃色葡萄球菌ATCC25923TM ,用LB培養(yǎng)液調(diào)整至 A600nm=0.4。加入蜂毒肽、依布硒啉、蜂毒肽-依布硒啉,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育10min。4 ℃,8000r/min,離心5min處理后,棄 去 上 清 用 PBS 重 復(fù) 洗 滌 3 次,最 后 用PBS重懸。將10mmol/L活性氧熒光探針 H2DCFDA 加入800μL重懸液,于37℃孵育30min后,于流式細(xì)胞儀(FITC通道)檢測熒光強(qiáng)度。
取 上 述 1.4 中 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ATCC25923TM ,用 LB培養(yǎng)液調(diào)整至 A600nm =0.4。加入4mmol/LDTT 混 勻 后,再 與 不 同 濃 度 梯 度 的 蜂 毒肽、依布 硒 啉、蜂 毒 肽-依 布 硒 啉 孵 育 10 min。同1.9步驟處理后上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度。
使 用 GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用 x±s表示,組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
分光光度法檢測蜂毒肽與依布硒啉對(duì)金黃色葡萄 球 菌 ATCC 25923TM 作 用 的 最 小 抑 菌 濃 度(MIC)。結(jié)果顯示,蜂毒肽可顯著抑制金黃色葡萄球菌 ATCC25923TM 生 長 (P<0.01),MIC 為 10μmol/L。同樣,依 布 硒 啉 作 用 于 金 黃 色 葡 萄 球 菌ATCC25923TM 的 MIC為20μmol/L;而2.5μmol/L蜂毒肽聯(lián)合1μmol/L 依布硒啉則更加明顯地抑制細(xì)菌生長(P<0.01),使蜂毒肽與依布硒啉的使用濃度分別降低4倍和20倍(圖1)。
3 討論
金黃色葡萄球菌作為一種重要的致病性微生物,可導(dǎo)致臨床多種感染性疾病,包括骨髓炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等[21],已成為目前院 內(nèi) 感 染 的 重 要 病 原菌。近年來,由于大量抗生素的廣泛使用,由多重耐藥性金黃色葡萄球菌引起的感染已對(duì)全人類的健康構(gòu)成極大威脅。蜂毒肽作為抗菌活性物質(zhì),近年來備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,但其抗菌機(jī)制仍不明晰。本實(shí)驗(yàn)旨在團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)上,首先探討蜂毒肽的抗菌機(jī)制,并以此為契機(jī),進(jìn)一步聯(lián)合使用依布硒啉,期待為治療金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的感染提供新的思路。
我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),蜂毒肽-依布硒啉組處理后的金黃色葡萄球菌胞內(nèi),活性氧產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。由此推測,蜂毒肽-依布硒啉可上調(diào)活性氧的產(chǎn)生,但隨著處理時(shí)間延長,細(xì)胞膜穿孔破裂導(dǎo)致活性氧向外逸出。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),蜂毒肽不僅具有破壞生物膜的作用[8,22],還可協(xié)同膜通透劑或 ATPase抑制劑發(fā)揮抗菌活性[23]。同時(shí),透射電鏡下直接觀察到的細(xì)胞膜損傷結(jié)果,也可進(jìn)一步幫助我們解釋細(xì)菌胞內(nèi)活性氧產(chǎn)量先升高后降低的原因。
TDRS作為細(xì)菌胞內(nèi)調(diào)控氧化還原平衡最重要的系統(tǒng),與活性氧密切相關(guān)。對(duì)革蘭氏陽性菌來說,其 TDRS就是 Trx系統(tǒng)[17]。因此,金黃色葡萄球菌的 Trx系統(tǒng)的活性可直接影響活性氧穩(wěn)態(tài)。而 Trx系統(tǒng)作為金黃色葡萄球菌的看家基因系統(tǒng)之一,其活性的維持是細(xì)菌生長代謝所必需的。因此認(rèn)為,Trx系統(tǒng)是潛在的抗生素作用靶點(diǎn)。我們團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn),依布硒啉作為一種含硒化合物,可通過影響 Trx系統(tǒng)電子流的傳遞,破壞細(xì)菌胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮抗菌活性[10-16]。這是由于 Trx系統(tǒng)中的 TrxR在原核生物與真核生物之間存在差異,其在原核生物中為低分子不含硒蛋白;同時(shí),在哺乳動(dòng)物中則為高分子含硒蛋白[24]。在本研究中,我們也通過 DTNB實(shí)驗(yàn)證實(shí),蜂毒肽可與依布硒啉協(xié)同靶向金黃色葡萄球菌 TrxR。這些結(jié)果,進(jìn)一步為將細(xì)菌 TrxR作為藥物篩選靶點(diǎn)提供了理論與實(shí)踐依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)不僅證明了蜂毒肽的強(qiáng)大抗菌活性,也發(fā)現(xiàn)其可與依布硒啉發(fā)揮協(xié)同抗菌活性,并證實(shí)蜂毒肽-依布硒啉的協(xié)同抗菌靶標(biāo)為細(xì)菌 TrxR,可通過產(chǎn)生時(shí)間依賴的活性氧來抑制金黃色葡萄球菌活性。此外,在檢測蜂毒肽-依布硒啉對(duì)3株臨床分離MDRS抗菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn),由于不同分離株各自的耐藥能力與耐抗生素的種類不同,因此蜂毒肽-依布硒啉對(duì)3株臨床分離株的抑菌濃度各不相同。這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步思考和探索。
未來,筆者認(rèn)為利用大分子標(biāo)記和化合物文庫構(gòu)建等更先進(jìn)技術(shù),可有助于進(jìn)一步發(fā)掘蜂毒肽-依布硒啉的協(xié)同抗菌靶點(diǎn)。并且通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)來改造先導(dǎo)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu),可幫助篩選出更高效安全的抗菌化合物以供進(jìn)一步的研究。此外,雖然本文的研究結(jié)果確認(rèn)蜂毒肽-依布硒啉具有良好的體外抗金黃色葡萄球菌活性,但是否能在體內(nèi)獲得一致性結(jié)果,還有待進(jìn)一步探索。期待在不久的將來,蜂毒肽-依布硒啉的協(xié)同抗菌作用可以得到更多的開發(fā)和研究,并深入到臨床應(yīng)用中。
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