摘要：目的探討功能化自組裝納米多肽DGEAmx水凝膠對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)的粘附、增殖和成骨分化的影響。 方法 原子力顯微鏡觀察功能化自組裝多肽形成的納米級(jí)結(jié)構(gòu)特征；用倒置顯微鏡對(duì)貼壁細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)，對(duì)比細(xì)胞粘附情況；用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面形貌；檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、成骨分化特異性基因Ⅰ型膠原(ICAM-1)和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)成骨效果。結(jié)果 原子力顯微鏡觀察功能化自組裝多肽DGEAmx可以形成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；倒置顯微鏡對(duì)貼壁細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)結(jié)果顯示在30、60、90 min時(shí)DGEAmx組對(duì)比RADA16-Ⅰ組粘附細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3、5、7天， DGEAmx組MSCs增殖較RADA16-Ⅰ組明顯增高(P<0.05)；DGEAmx組成骨誘導(dǎo)3、7、14 d后， ALP活性高于RADA16-Ⅰ組(P<0.05)；Real-time PCR結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)3、7、14 d 后DGEAmx組較RADA16-Ⅰ組有更高的ICAM-1和OCN的表達(dá)(P<0.05)。 結(jié)論 功能化自組裝多肽DGEAmx納米纖維水凝膠支架能促進(jìn)MSCs粘附、增殖和成骨分化，作為骨組織工程支架材料有良好的應(yīng)用潛力。
自組裝多肽作為一種人工合成的、結(jié)構(gòu)類(lèi)似于天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的凝膠支架，可以在水溶液中自發(fā)組裝成網(wǎng)狀納米纖維，并且在與鹽離子相遇時(shí)迅速成形。纖維直徑10～20 nm，孔徑5～200 nm，水容量>99%。與傳統(tǒng)支架材料相比，自組裝多肽納米纖維水凝膠具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、有良好的生物相容性、可降解、無(wú)毒性及免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，成為新型組織工程支架材料研究方向之一[3, 4, 5]。自組裝多肽RADA16-Ⅰ(AcN-RADARADARADARADA-CONH2)由天然氨基酸合成，其形成的水凝膠支架能夠?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)提供良好條件[6]。最近，多個(gè)有生物活性的肽序列(如RGD、SKP等)被用來(lái)修飾RADA16-Ⅰ構(gòu)建功能化自組裝多肽水凝膠支架。研究表明，這些功能化自組裝多肽水凝膠支架較純的RADA16-Ⅰ水凝膠支架促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和分化。Ⅰ型膠原是骨組織中的重要構(gòu)成成分，是重要的骨支架來(lái)源，而其中的DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)序列能夠與α2β1整合素受體作用，促進(jìn)細(xì)胞粘附[7, 8]。細(xì)胞與材料的粘附是細(xì)胞在材料表面遷移、增殖和分化的前提�；诖�，我們通過(guò)固相合成法[9]將DGEA結(jié)合到RADA16-Ⅰ的C端，合成功能化自組裝多肽RADA16-DGEA (AcN-RADARADARADARADA-GG-DGEA-CONH2)，以期獲得一種有良好細(xì)胞粘附效果的支架材料。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明DGEA肽不能自組裝成纖維結(jié)構(gòu)，也不能形成水凝膠；RADA16-DGEA能組裝成短納米纖維，但纖維間不相互搭載，并且不能形成水凝膠；將RADA16-DGEA和RADA16-Ⅰ等比混合制備成的DGEAmx可以形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和水凝膠。本實(shí)驗(yàn)將MMCs接種至RADA16-Ⅰ和DGEAmx支架上培養(yǎng)，研究小鼠MSCs在支架材料上的粘附、增殖和分化情況，為其進(jìn)一步作為骨組織工程支架的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由第三軍醫(yī)大學(xué)國(guó)家-地方聯(lián)合組織 工程實(shí)驗(yàn)室提供，多肽DGEA(相對(duì)分子質(zhì)量431.25)、 RADA16-Ⅰ(相對(duì)分子質(zhì)量1 712.76)和RADA16-DGEA(相對(duì)分子質(zhì)量2 199.21)(純度≥95%)，C57BL/6小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、C57BL/6小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(廣州賽業(yè))，0.25%胰蛋白酶(HyClone)，14 mm圓形蓋玻片(NEST)，CCK-8檢測(cè)試劑盒(Sigma)，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(建成，中國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(Life technologies)。
低速離心機(jī)(Thermo，德國(guó))，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，超聲波清洗機(jī)(Kejingda，中國(guó))，原子力顯微鏡(Asylum Research，美國(guó))，激光共聚焦熒光顯微鏡 (Nikon,日本)，酶標(biāo)儀(Varioskan Flash,美國(guó))。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 制備自組裝多肽溶液10 mg肽粉溶于 1 mL 超純水中，混勻后用超聲處理30 min去除粘性，得到1%質(zhì)量體積比的母液。將RADA16-DGEA母液與RADA16-Ⅰ母液按體積比1 ∶1混合，得到1%DGEAmx母液。
將DGEA、RADA16-Ⅰ、RADA16-DGEA和DGEAmx的母液用超純水稀釋20倍，各取5 μL稀釋液分別滴加到新剝開(kāi)的云母片上，15 s后用100 μL超純水沖洗3次，去除未粘附材料。待云母片上肽樣品自然干燥后用原子力顯微鏡觀察[10]。操作模式為輕敲模式，掃描探針參數(shù)為矩形基座200 μm，針高10 μm，彈性系數(shù)8 N/m，Si尖端半徑為10 nm，掃描區(qū)域?yàn)? μm×2 μm，掃描頻率是1.0 Hz。
將1% RADA16-Ⅰ和DGEAmx母液分別與20%無(wú)菌蔗糖溶液等體積混合，配制成0.5%水凝膠工作液。將14 mm圓形蓋玻片放置在24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，100 μL工作液滴加在蓋玻片上。緩慢向孔內(nèi)加入1 mL完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板 放于 37 ℃培養(yǎng)箱中靜置40 min。凝膠成型后，更換2次培養(yǎng)基以平衡pH，間隔 30 min，每次更換2/3～3/4 體積的培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)板放置于 37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基后，將傳至第3代的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基重懸成1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每孔加入500 μL。培養(yǎng)板置于37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中，第2天換液，此后每隔1 d 換液1 次。
在24孔板內(nèi)放置蓋玻片并用RADA16-Ⅰ和DGEAmx成膠。在蓋玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠、DGEAmx水凝膠上接種MSCs，分別在第10、30、60、90分鐘吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗3 次去除未粘附細(xì)胞，并對(duì)材料上的貼壁細(xì)胞進(jìn)行拍照。隨機(jī)選取視野對(duì)貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)。
在96孔培養(yǎng)板分別滴加50 μL RADA16-Ⅰ和DGEAmx工作液，成膠后分別在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝膠、DGEAmx水凝膠上滴加100 μL密度為3×104個(gè)/mL 的第3代MSCs細(xì)胞懸液。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天，每組中各取1個(gè)孔加入1 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育1 h，以酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值[D(450)]。將各測(cè)試孔的D(450)減去調(diào)零孔D(450)。
在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置蓋玻片，分別用RADA16-Ⅰ和DGEAmx成膠，在空白孔、RADA16-Ⅰ 水凝膠、DGEAmx水凝膠上加入3×104個(gè)/孔 的第3代MSCs。分化培養(yǎng)14 d后，吸盡孔內(nèi)液體，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，0.2%Triton X-100處理10min，PBS清洗3次，5%BSA封閉1 h，PBS清洗3次，加入羅丹明-鬼筆環(huán)肽(5 U/mL)溶液浸沒(méi)樣本，室溫孵育30 min，PBS清洗3次，用10 μg/mL的DAPI染色5 min。PBS清洗3次，滴加抗熒光淬滅封片液封片。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照。
在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別用RADA16-Ⅰ和DGEAmx成膠，在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝膠、DGEAmx水凝膠上加入3×104個(gè)／孔的第3代MSCs。分化培養(yǎng)3、7、14 d后，吸盡孔內(nèi)液體，用PBS清洗3次，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液并反復(fù)吹打。鏡下觀察已無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，按ALP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)ALP活性。空白管調(diào)零后在酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔光密度值D(520)。
將第3代MSCs按3×104個(gè)／孔的數(shù)量接種到 6孔培養(yǎng)板的空白孔、RADA16-Ⅰ水凝膠和DGEAmx水凝膠上，以成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔1 d換液1次。在第3、7、14天時(shí)將各組培養(yǎng)基去除后，PBS清洗3次，按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)胞總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以30 μL體系將1 μg各組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后按照TaKaRa SYBR Green一步法定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，體系為25 μL，95 ℃預(yù)溫5 min，隨后進(jìn)行95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，最后72 ℃延伸2 min，并進(jìn)行溶解曲線的測(cè)定。引物根據(jù)NCBI上Primer-BLAST設(shè)計(jì)并經(jīng)過(guò)比對(duì)，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小為：ICAM-1正向引物：5′-AGCGGCTGACGTGTGCAGTAAT-3′，反向引物：5′-TCTGAGACCTCTGGC-TTCGTCA-3′，115 bp；OCN正向引物：5′-CGCTACCTGTATCAATGGCTGG-3′，反向引物：5′-CTCCTGAAAGCC-GATGTGGTCA-3′，123 bp；β-actin正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，反向引物：5′-AGGTCT-TTGCGGATGTCCACGT-3′,135 bp。結(jié)果以Ct值表示，β-actin為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。
數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
2 結(jié)果
3 討論
自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料在細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[11, 12, 13]。自組裝多肽溶解后迅速形成納米纖維,并在接觸鹽離子后形成水凝膠支架材料。這種納米纖維支架形成與細(xì)胞外基質(zhì)相類(lèi)似的結(jié)構(gòu),含水量高并且具有高孔隙度，是培養(yǎng)組織細(xì)胞的良好載體。由于這類(lèi)材料是由天然氨基酸合成,降解產(chǎn)物沒(méi)有毒性，可以避 免引起炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。相關(guān)研究已證明RADA16-Ⅰ 可以增強(qiáng)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)因子分泌能力[14, 15, 16]。此外,還可以通過(guò)在其C端用肽合成固相法將具有不同功能的短生物活性多肽片段(一般不超過(guò)15個(gè)氨基酸片段)與其結(jié)合，構(gòu)建新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料,從而提高其生物學(xué)活性[5]。Horii等[3]將功能基序AKL、DGR和PRG分別結(jié)合到RAD16- ⅠC端，并與RAD16-Ⅰ混合制備的三維支架可增強(qiáng)MC3T3-E1 細(xì)胞的粘附、增殖和成骨分化能力；Pan等[17]用BMP-2 相關(guān)蛋白(P24)修飾RAD16-Ⅰ形成RAD16-P24，再混合聚乳酸- 羥基乙酸共聚物形成復(fù)合材料，研究表明這種復(fù)合材料增強(qiáng)了BMSCs 的增殖、粘附能力和異位骨形成。盡管功能化自組裝多肽延長(zhǎng)了RADA16-I的C末端后會(huì)影響自組裝多肽原有的凝膠性,提示功能序列影響到RADA16-Ⅰ β折疊結(jié)構(gòu)形成，從而中斷長(zhǎng)納米纖維的自組裝，但當(dāng)其與RADA16-Ⅰ等體積混合后,表現(xiàn)出與RADA16-I相似的凝膠特性。
細(xì)胞與材料的粘附是細(xì)胞在材料表面遷移、增殖與分化的前提。但將有粘附功能序列DGEA與RAD16- Ⅰ復(fù)合并檢測(cè)其對(duì)MSCs的快速粘附效果未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們將在細(xì)胞粘附中有著重要作用的DGEA序列與RADA16-Ⅰ多肽的C 末端相連，成功復(fù)合構(gòu)建了自組裝多肽納米凝膠支架DGEAmx。DGEAmx的微觀結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的RADA16-Ⅰ類(lèi)似，能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。本研究中，我們把小鼠MSCs接種到RADA16-Ⅰ、RAD/DGEA水凝膠支架上體外培養(yǎng)，觀察支架材料上細(xì)胞的粘附、增殖和分化情況。在 接種MSCs后第30、60、90分鐘時(shí)，DGEAmx的粘附率較RADA16- Ⅰ 有顯著增強(qiáng)(P<0.05)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況證實(shí)，MSCs在DGEAmx上對(duì)比在RADA16 -Ⅰ上有更高的增殖速率。當(dāng)在特定的分化刺激培養(yǎng)條件下，肽水凝膠支架支持接種的MSCs向成骨細(xì)胞分化。ALP是細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)，其活性與成骨細(xì)胞分化呈正相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)相關(guān) 結(jié)果提示在DGEAmx水凝膠上分化培養(yǎng)的MSCs的ALP活性及成骨相關(guān)基因ICAM-1和OCN的表達(dá)明顯高于RADA16-Ⅰ (P<0.05)。上述結(jié)果表明，與經(jīng)典的自組裝多肽RADA16-Ⅰ相比，DGEAmx是更適合MSCs體外培養(yǎng)的支架材料。
自組裝多肽納米纖維支架能作為骨細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的良好載體，并且由于其力學(xué)方面的特性，作為注射材料填充不規(guī)則和微小骨缺損有明顯優(yōu)勢(shì)[18]。但對(duì)于大段骨缺損和承重部位骨缺損難以提供有效支撐。將自組裝多肽水凝膠作為修飾材料，修飾脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix,DBM)、羥基磷灰石(hydro-xyapatite，HA)等傳統(tǒng)支架材料，構(gòu)成的復(fù)合支架材料，不僅具有較強(qiáng)的力學(xué)性能，而且保持了自組裝肽納米纖維支架良好的生物活性，為該材料進(jìn)一步的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)和提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[19, 20]。
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