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化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜對多肽二硫鍵的定位
瀏覽量:239 | 2024/5/14 14:55:10


摘要:二硫鍵是一種與多肽及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的化學(xué)鍵. 當(dāng)多肽中存在多個半胱氨酸時, 形成的二硫鍵可能會存在多種配對方式. 快速且精準(zhǔn)地定位多肽中多對二硫鍵對研究多肽的結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系十分重要. 本文開發(fā)了一種基于化學(xué)裂解和生物質(zhì)譜的新方法, 對利那洛肽中3對二硫鍵進(jìn)行了精準(zhǔn)定位. 通過解析裂解后特異肽段的二級質(zhì)譜圖, 確定利那洛肽中3對二硫鍵的配對方式分別為Cys1-Cys6, Cys2-Cys10和Cys5-Cys13. 該方法為二硫鍵的定位研究提供了新思路.


二硫鍵(Disulfide bond)是多肽和蛋白質(zhì)中一種常見的翻譯后修飾, 它是氨基酸序列中2個半胱氨酸(Cysteine)殘基的巰基基團(tuán)(—SH)發(fā)生氧化反應(yīng)失去2個氫(H)形成的共價鍵(—S—S—). 二硫鍵并不是非常穩(wěn)定, 氧化形成的二硫鍵也可以被還原形成游離的巰基, 所以通常二硫鍵是動態(tài)變化的化學(xué)鍵[1]. 二硫鍵廣泛存在于多肽和蛋白質(zhì)中, 并不局限于蛋白質(zhì)的大小、 功能和類型. 對于小于50個氨基酸的多肽, 可能含有少量的二硫鍵; 而對于一些大的蛋白質(zhì), 可能含有成百上千個二硫鍵[2]. 蛋白質(zhì)和多肽中的二硫鍵對其熱力學(xué)、 力學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性至關(guān)重要, 同時也參與對蛋白酶的抗性和活性的調(diào)節(jié)[3]. 精準(zhǔn)、 快速地定位蛋白質(zhì)和多肽中二硫鍵配對方式是研究其結(jié)構(gòu)與功能的重要內(nèi)容之一.


早期定位二硫鍵的主要方法分為非片段法和片段法[4]. 非片段法包括 X 射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法和多維核磁共振波譜法等, 它們可以提供分子水平上的二硫鍵信息[3], 其最大的優(yōu)勢為檢測方式非破壞性, 可以實現(xiàn)樣品的重復(fù)利用[5]; 非片段法檢測時需要的樣品量較大且純度要求較高, 由于該方法提供的結(jié)構(gòu)信息有限, 所以不作為二硫鍵定位的典型方法. 片段法包括對角線法、 二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、 酶解法、 化學(xué)裂解法、 部分還原測序法和氰化半胱氨酸裂解法等[3]. 酶解法的應(yīng)用種類繁多, 包括2種酶交叉酶切[6]、 復(fù)合酶切[7]及3種酶交叉組合[8]等方式, 可實現(xiàn)對蛋白或多肽碎裂的目的. 但是酶解法也有一定的局限性, 多數(shù)酶解的實驗條件偏堿性, 會增加二硫鍵交換幾率, 且一些蛋白質(zhì)可能抗酶解或含有鄰位Cys, 因而不適用于酶解法. 從虎紋捕鳥蛛粗毒中分離得到的多種虎紋捕鳥蛛毒素就屬于不適合酶解法的多肽, 采用部分還原和分步序列測定法可有效解決此問題[9,10], 但是該方法的缺點是步驟多、 會產(chǎn)生中間產(chǎn)物且工作量大. 此外, 酶切質(zhì)譜法聯(lián)合氰基化裂解法也可以實現(xiàn)對臨位Cys的二硫鍵的定位研究[11].


隨著生物質(zhì)譜的發(fā)展, 基質(zhì)輔助激光解吸離子源[12,13]和電噴霧離子源[14,15,16]質(zhì)譜逐漸應(yīng)用到二硫鍵的定位研究中. 先將完整的蛋白質(zhì)或多肽酶解成含有不同定位信息的肽段, 用質(zhì)譜檢測各個肽段的具體信息后, 通過專業(yè)的二硫鍵特異性搜索軟件實現(xiàn)對二硫鍵配對方式的表征. 復(fù)合酶切法和化學(xué)修飾法結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜得到了較好的應(yīng)用[17].

上述方法都屬于Bottom-up法, 而傳統(tǒng)的Top-down法不適用于二硫鍵的定位研究, 主要原因是二硫鍵封閉區(qū)域的碎片化不充分, 碎片提供的結(jié)構(gòu)信息不足. 新的電子轉(zhuǎn)移/高能碰撞解離技術(shù)可以提高碎片化效率, 使得Top-down法應(yīng)用于二硫鍵定位研究成為可能. 該方法減少了對多肽或蛋白的前期處理, 簡化了實驗流程, 能更直觀地表征二硫鍵的鏈接方式[18]. 但是, 該方法的缺點是僅限于多肽內(nèi)單個二硫鍵, 對于多對二硫鍵的定位效果不佳.


利那洛肽是首個治療便秘的鳥苷酸環(huán)化酶C激動劑[19,20], 它是由14個氨基酸構(gòu)成的多肽, 其序列為H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH, 其中含有6個Cys, 可形成3對二硫鍵, 在如此短的序列中可能存在的配對方式有15種. 在人工合成的過程中很重要的一個環(huán)節(jié)就是高效、 快速、 準(zhǔn)確地完成二硫鍵的正確配對, 同時避免生成副產(chǎn)物影響其結(jié)構(gòu)和功能[21,22,23]. 為了開發(fā)一種快速且精準(zhǔn)地定位多對二硫鍵的方法, 本文以利那洛肽作為研究樣本, 發(fā)展了一種基于化學(xué)裂解和生物質(zhì)譜的新方法. 首先, 在酸性條件下用三(2-羧乙基)膦(TCEP)對利那洛肽部分還原, 用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)進(jìn)行氰基衍生化反應(yīng); 隨后, 在堿性條件下進(jìn)行化學(xué)裂解; 最后, 對碎裂肽段進(jìn)行質(zhì)譜檢測, 所得譜圖結(jié)果經(jīng)人工分析明確多肽二硫鍵的配對方式.


1 實驗部分


1.1 試劑與儀器
醋酸利那洛肽(Linaclotide acetate)購于美國MedChemExpress公司; 1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)、 鹽酸胍(GuHCl, 純度≥99%)、 α-氰-4-羥基肉桂酸(CCA)和二硫蘇糖醇(DTT)均購于美國Sigma公司; 三(2-羧乙基)膦(TCEP)、 乙腈(ACN, 質(zhì)譜純)和甲酸(FA, 質(zhì)譜純)均購于美國Thermo Scientific公司; 氨水(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 檸檬酸(純度>99.5%)購于上海生工生物工程有限公司; 肌紅蛋白(Mb)購于中國源葉生物公司. C18 脫鹽柱購于美國Waters公司. 實驗所用超純水均由Synthesis型Milli-Q超純水系統(tǒng)制備(美國Mllipore公司, 18.2 MΩ·cm).

5800型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS, 美國AB SCIEX公司); 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng): 液相系統(tǒng)為NanoAquity系列超高壓液相色譜(美國Waters公司), 質(zhì)譜檢測系統(tǒng)為Q-Exactive系列四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(Quadrupole-Orbitrap, 美國Thermo Scientific公司); Centrifuge 5424型冷凍離心機(德國Eppendorff公司).


1.2 實驗過程
1.2.1 分子量檢測樣品的制備 稱量0.1 mg利那洛肽固體溶解于150 μL水中; 取30 μL利那洛肽溶液加入10 μL DTT溶液(50 mmol/L DTT+50 mmol/L NH4HCO3), 以850 r/min轉(zhuǎn)速于57 ℃振蕩孵育30 min, 得到分子量檢測樣品.
1.2.2 部分還原和化學(xué)裂解 實驗用樣品的制備分為4步反應(yīng)(見Scheme 1). 稱量0.14 mg利那洛肽固體溶解于50 μL水中, 加入1.93 mg檸檬酸和57.32 mg鹽酸胍, 稀釋為終體積100 μL的pH=3.0溶液. 加入4 μL TCEP溶液(0.1 mol/L TCEP+0.1 mol/L 檸檬酸, pH=3.0), 于25 ℃恒溫靜置反應(yīng)10 min. 然后, 加入80 μL CDAP溶液(0.1 mol/L CDAP+0.1 mol/L 檸檬酸, pH=3.0), 于25 ℃恒溫靜置反應(yīng)15 min后, 立刻用 C18 脫鹽柱脫鹽并冷凍干燥, 備用.

化學(xué)裂解反應(yīng)在1 mol/L NH3·H2O溶液中進(jìn)行. 取20 μL鹽酸胍溶液(6 mol/L鹽酸胍+1 mol/L NH3·H2O)復(fù)溶制備的凍干樣品, 加入 50 μL 1 mol/L NH3·H2O溶液, 于25 ℃恒溫靜置反應(yīng)1 h. 反應(yīng)結(jié)束后, 立即將樣品冷凍抽干. 最后, 加入50 μL TCEP溶液(0.1 mol/L)復(fù)溶凍干的樣品, 于37 ℃恒溫靜置反應(yīng)30 min.


1.2.3 MALDI-TOF質(zhì)譜檢測 選擇10 mg/mL CCA溶液作為基質(zhì), 分別將還原前、 后的利那洛肽溶液與基質(zhì)混合并取0.75 μL點在靶板上, 自然干燥后, 采用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析, 激光源為335 nm波長的Nd:YAG激光器, 加速電壓為20 kV, 分別采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù). 質(zhì)譜儀先用Myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正. 樣品反射模式質(zhì)量掃描范圍為800~3000. 對實驗得到的譜圖采用Data Explorer軟件進(jìn)行處理和分析.


1.2.4 Q-Exactive液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測 將待測樣品用流動相A稀釋至10 pmol/μL. 液相系統(tǒng)色譜柱為PepMap C18(75 μm ×25 cm), 柱溫為45 ℃. 流動相A為水相(含0.1% FA), 流動相B為有機相ACN溶液(含0.1% FA); 色譜流速為300 nL/min; 洗脫梯度為0~55 min 95%~70%A, 5%~30%B; 上樣量為2 μL. 質(zhì)譜掃描方式為正離子模式, 數(shù)據(jù)采集方式為數(shù)據(jù)依賴模式, 在一級全掃描和二級碎片離子掃描間進(jìn)行自動切換. 一級掃描使用Orbitrap軌道離子阱, 掃描范圍為m/z 200~2000, 分辨率為70000. 隨后進(jìn)行二級掃描, 自動選擇一級強度前10位的母離子進(jìn)行碎裂并用Orbitrap進(jìn)行掃描, 碎裂方式為高能碰撞解離, 掃描起始范圍為m/z 110, 分辨率為17500, 掃描采用動態(tài)排除模式, 動態(tài)排除時間為30 s. 最后, 用 Xcalibur Qual Browser打開質(zhì)譜產(chǎn)生的原始RAW文件, 按照肽段的理論碎裂方式人工查找目標(biāo)離子的一級和二級質(zhì)譜圖.


2 結(jié)果與討論


采用MALDI-TOF/TOF MS測定了還原前后利那洛肽的分子量. 圖1(A)為還原前利那洛肽的一級質(zhì)譜圖, m/z 1526.3274, 1548.3103和1564.2809處的峰分別為利那洛肽的[M+H]+峰、 [M+Na]+峰和[M+K]+峰. 根據(jù)利那洛肽的理論氨基酸序列計算得到理論[M+H]+峰值為1532.4447, 由此說明實測樣品的單同位素分子離子峰比理論序列單同位素分子離子峰少6 Da, 推測該多肽樣品中可能含有由6個Cys組成的3對二硫鍵. 圖1(B)為經(jīng)DTT還原后利那洛肽的一級質(zhì)譜圖, m/z 1532.4758, 1554.4402和1570.4138處的峰分別為DTT還原后利那洛肽的[M+H]+峰、 [M+Na]+峰和[M+K]+峰, 與根據(jù)利那洛肽的理論序列計算得到的[M+H]+峰值(1532.4447)相同, 進(jìn)一步佐證了這3對二硫鍵的存在. 此外, 利那洛肽含有大量Cys, 可能在合成的過程中形成分子間二硫鍵. MALDI-TOF質(zhì)譜檢測僅得到利那洛肽的[M+H]+峰、 [M+Na]+峰和[M+K]+峰[圖1(A)], 在譜圖中相應(yīng)的位置未發(fā)現(xiàn)由分子間二硫鍵形成的二聚體峰. 由此證明, 研究中采用的利那洛肽不存在分子間二硫鍵.

在確認(rèn)利那洛肽存在3對二硫鍵后, 采用部分還原、 化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對二硫鍵進(jìn)行了定位研究. 多肽在酸性條件下加入還原劑TCEP會發(fā)生部分還原反應(yīng), 形成僅有1對二硫鍵被還原的3種結(jié)構(gòu)形式. 在加入CDAP進(jìn)行衍生化反應(yīng)后, S原子連上1個氰基生成—SCN, 在堿性條件下裂解. 然后, 在部分還原條件下, 連有氰基的Cys左側(cè)斷裂形成新的肽段片段, 末端的Cys形成新的五元環(huán)[24,25]. 最后, 利用質(zhì)譜分析這些新的肽段片段, 從而對多肽中二硫鍵進(jìn)行定位. 對于含有3對二硫鍵的利那洛肽, 經(jīng)過部分還原、 氰基化和堿性條件下化學(xué)裂解反應(yīng)后, 理論上共計可以產(chǎn)生8個片段離子, 不同配對方式所產(chǎn)生8個片段離子的組合方式不同.


首先, 對部分還原后化學(xué)裂解樣品的一級質(zhì)譜進(jìn)行分析, 找到肽段片段的母離子峰, 根據(jù)母離子的組合方式推測出潛在的二硫鍵配對方式. 然后, 對這些片段離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析, 確認(rèn)這些片段離子對應(yīng)的氨基酸序列.


在一級質(zhì)譜譜圖中檢測到2個離子峰([M+H]+): m/z 644.1625和956.3060, 可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys1-Cys6被打開而形成的2個化學(xué)裂解片段峰. 對這2個片段峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的序列分析圖如圖2所示(圖中藍(lán)色代表b離子, 紅色代表y離子, 綠色代表b-H2O離子). 圖2(A)為片段峰m/z 644.1625的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖, 檢測到3個b離子和1個b-H2O離子, 分別為b1(m/z 232.02), b2(m/z 361.06), b3(m/z 524.13)和b2-H2O(m/z 343.05). 這些完整的b系列離子驗證了片段峰m/z 644.1625對應(yīng)氨基酸序列為Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys. 圖2(B)為片段m/z 956.3060的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖, 檢測到4個b離子、 3個y離子和2個b-H2O離子, 分別是b1(m/z 243.05), b2(m/z 340.11), b3(m/z 411.14), b4(m/z 514.16), y1(m/z 182.08), y2(m/z 285.09), y7(m/z 714.26)和b5-H2O(m/z 597.19), b6-H2O(m/z 653.53). 這些完整的b系列離子和部分y系列離子驗證了片段m/z 956.3060對應(yīng)氨基酸序列為Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr.

離子峰([M+H]+) m/z 926.2957和571.0655可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys2-Cys10被打開而形成的2個化學(xué)裂解片段峰. 除這2個片段峰外, 理論片段峰值為121.0436, 分子量偏小, 在質(zhì)譜中未檢測到. 對這2個片段峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的序列分析圖如圖3所示. 圖3(A)是片段峰m/z 926.2957的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖, 檢測到4個b離子, 1個y離子和1個b-H2O離子, 分別是b1(m/z 258.05), b2(m/z 421.12), b3(m/z 524.13), b5(m/z 741.18), y2(m/z 186.12)和b4-H2O(m/z 609.13), 這些完整的b系列離子驗證了片段峰m/z 926.2957對應(yīng)氨基酸序列為Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala. 圖3(B)為片段峰m/z 571.0655的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖, 檢測到2個b離子和1個分子離子峰, 它們分別是b2(m/z 287.00), b4(m/z 553.06)和[M+H]+(m/z 571.07), 表明片段峰m/z 571.0655對應(yīng)的氨基酸序列為Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr.

離子峰([M+H]+) m/z 516.1966, 792.2581和310.0853可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys5-Cys13被打開而形成的3個化學(xué)裂解片段峰. 片段峰m/z 516.1966和310.0853只在一級質(zhì)譜中被檢測到, 由于離子化效率低導(dǎo)致串聯(lián)質(zhì)譜碎裂效果較差, 這2個片段峰的一級質(zhì)譜圖見圖4. 圖5為片段峰m/z 792.2581的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖, 檢測到4個b離子, 分別是b1(m/z 232.02), b2(m/z 346.06), b3(m/z 443.12)和b4(m/z 514.16). 這些完整的b系列離子驗證了片段峰m/z 792.2581對應(yīng)的氨基酸序列為Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly.

實驗采用化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對利那洛肽部分還原后化學(xué)裂解產(chǎn)生的片段離子進(jìn)行了質(zhì)譜分析, 結(jié)果見表1. 檢測到的m/z 644.1625和956.3060離子峰對應(yīng)二硫鍵Cys1-Cys6被打開而形成的化學(xué)裂解片段峰; m/z 926.2957和571.0655離子峰對應(yīng)二硫鍵Cys2-Cys10被打開而形成的化學(xué)裂解片段峰; m/z 516.1966, 792.2581和310.0853 3個離子峰對應(yīng)二硫鍵Cys5-Cys13被打開而形成的化學(xué)裂解片段峰. 以上結(jié)果表明, 利那洛肽的3對二硫鍵的配對方式為Cys1-Cys6, Cys2-Cys10和Cys5-Cys13.

本文以利那洛肽為例, 實現(xiàn)了分子內(nèi)3對二硫鍵的精準(zhǔn)定位分析. 對于1個多肽內(nèi)嵌套更多層的分子內(nèi)二硫鍵和分子間二硫鍵, 從理論上本文方法仍是有效的. 本文對于二硫鍵定位方法的核心步驟是在酸性條件下采用還原劑TCEP進(jìn)行部分還原反應(yīng), 形成只含有1對二硫鍵被還原的3種結(jié)構(gòu)形式. 通過對被還原的二硫鍵進(jìn)行化學(xué)裂解反應(yīng), 找到對應(yīng)的特征肽段片段, 證明該二硫鍵的配對方式. 因此, 對于多肽內(nèi)嵌套更多層的分子內(nèi)二硫鍵和分子間二硫鍵, 通過控制部分還原反應(yīng)的條件, 只要形成1對二硫鍵被還原的結(jié)構(gòu)形式都可以使用本文方法進(jìn)行二硫鍵定位. 其次, 本文方法對于多對二硫鍵進(jìn)行定位方法需要的初始樣品量在微克級別, 只要通過3步反應(yīng)即可實現(xiàn)結(jié)合生物質(zhì)譜對二硫鍵的精準(zhǔn)定位. 相比于常規(guī)的多種酶解法反應(yīng)條件的限制, 部分還原和分步序列測定法需要消耗大量的時間進(jìn)行色譜分離, 本方法則具有樣品需求量少、 簡單快速和定位精準(zhǔn)等優(yōu)點.

3 結(jié)論


構(gòu)建了一種部分還原、 化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的新方法, 對利那洛肽中3對二硫鍵配對方式進(jìn)行了精準(zhǔn)定位. 通過還原前后利那洛肽分子量與氨基酸序列理論分子量的對比, 揭示其存在3對二硫鍵; 通過串聯(lián)質(zhì)譜分析解析了化學(xué)裂解后片段的序列信息及對應(yīng)的二硫鍵配對信息. 實驗結(jié)果顯示, 利那洛肽的3對二硫鍵配對方式為Cys1-Cys6, Cys2-Cys10和Cys5-Cys13. 該方法具有樣品需求量少、 耗時短、 步驟簡單、 可操作性強、 重現(xiàn)性好及適用范圍廣等特點, 為多肽二硫鍵的配對定位分析提供了新思路.


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