国产亚洲一级黄色_欧美日韩性感尤物在线_日高清无码在线免费视频_看黄色黄大色黄片免费_亚洲一区二区三区日产_日韩丝袜清纯自拍_中文字幕2019年中文字幕_AV无码精品蜜桃亚洲_嫩草影院一二三永久在线观看_国产午夜国产免费不卡

首頁 > 多肽文獻(xiàn) > 新型自組裝多肽水凝膠對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞作用的體外研究
新型自組裝多肽水凝膠對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞作用的體外研究
瀏覽量:613 | 2024/5/14 16:07:23


摘要:目的 觀察新型自組裝肽TRSAWmx水凝膠對(duì)在體外小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞粘附效果、增殖能力及成骨分化能力的影響。 方法 通過原子力顯微鏡觀察新型水凝膠的自組裝性能;以倒置顯微鏡對(duì)貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù),比較不同材料細(xì)胞的粘附;以CCK-8檢測和評(píng)價(jià)不同材料上細(xì)胞的增殖;通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面的生長;茜素紅-S染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成;檢測材料上培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以及細(xì)胞ALP、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等基因的表達(dá)。結(jié)果 TRSAWmx能自組裝成納米纖維結(jié)構(gòu);在接種30、60、90 min時(shí),TRSAWmx組細(xì)胞粘附數(shù)明顯高于空白組(P<0.05);3、5、7 d 時(shí)TRSAWmx組細(xì)胞有著更佳的增殖活力(P<0.05);在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3、7、14 d時(shí),TRSAWmx組ALP活性明顯高于RADA16-Ⅰ組(P<0.05);培養(yǎng)14 d后,TRSAWmx組茜素紅-S染色可見鈣結(jié)節(jié)形成多,成骨相關(guān)基因ALP、OCN、VEGF表達(dá)水平更高(P<0.05)。 結(jié)論 新型自組裝多肽納米水凝膠TRSAWmx在體外能有效提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞粘附、增殖和成骨分化能力。


目前臨床上應(yīng)用的合成骨替代材料,如羥基磷灰石、陶瓷材料等,存在不利于細(xì)胞粘附以及生物相容性差等缺點(diǎn)[1]。為了解決上述的問題,需要新的材料來對(duì)其表面進(jìn)行修飾或是替換,水凝膠材料是很好的選擇。RADA16-Ⅰ由16肽氨基酸組成,是自組裝多肽水凝膠的代表,其能在水相離子或生理鹽溶液觸發(fā)下,分子水平組裝成β折疊,并往復(fù)形成互補(bǔ)離子鍵,最終組裝成納米纖維,其纖維直徑10~20 nm,孔徑5~200 nm,含水量大于99%[2, 3, 4]。研究表明,水凝膠結(jié)構(gòu)能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)及其微環(huán)境,為細(xì)胞提供良好的體外生長環(huán)境,有利于細(xì)胞的粘附、增殖和分化[5];但是,目前作為支架材料的水凝膠缺乏促進(jìn)成骨分化的能力。Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是甲狀旁腺類激素相關(guān)蛋白(PTHrP)C末端結(jié)構(gòu)域PTHrP(107~111)五肽片段,能夠介導(dǎo)PTH/PTHrP受體非相關(guān)性受體,在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和分化[6, 7, 8]。此外,Osteostatin在骨缺損兔體內(nèi)能促進(jìn)骨再生[9, 10]。本研究通過利用Osteostatin片段對(duì)傳統(tǒng)RADA16-Ⅰ進(jìn)行修飾,期望得到兼顧粘附和促成骨相關(guān)性能的自組裝多肽納米水凝膠材料。


1 材料與方法


1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

MC3T3-E1 Subclone 14小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(ATCC),多肽RADA16-Ⅰ(AcN-RADARADARADA-RADA-CONH2,相對(duì)分子質(zhì)量為1 671.76)、RADA16/TRSAW(相對(duì)分子質(zhì)量為2 387.54)和TRASW(相對(duì)分子質(zhì)量為619.58),α-MEM培養(yǎng)基,胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.04% EDTA (Gibco公司),14 mm圓形蓋玻片(NEST公司),CCK-8檢測試劑盒(同仁公司),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(南京建成),茜素紅-S(Sigma公司),羅丹明鬼筆環(huán)肽,DAPI(碧云天公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。


1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 通過肽固相合成法[11]

將Osteostatin與 RADA16-Ⅰ C末端相連,合成自組裝多肽RADA16-TRSAW (AcN-RADARADARADARADA-GG-TRSAW-CONH2) 肽粉。自組裝多肽母液的制備向肽粉(每10 毫克分裝)內(nèi)加入1 mL無菌超純水,移液槍吹打混勻后,超聲波清洗機(jī)室溫超聲處理30 min去除溶液粘性,得到1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的多肽母液。取RADA16-Ⅰ和RADA16-TRSAW母液等體積混合,得到1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))TRSAWmx母液。


1.2.2 原子力顯微鏡(AFM)觀察自組裝多肽的纖維結(jié)構(gòu)

用超純水分別稀釋TRSAW、RADA16-Ⅰ、RADA16-TRSAW和TRSAWmx母液,得到0.5‰(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的稀釋液,超聲波清洗機(jī)室溫超聲處理30 min。取不同多肽稀釋液各5 μL分別滴加到清潔的圓形云母片上,靜置15 s后,用100 μL超純水沿液滴邊緣沖洗3次。30 ℃室溫靜置,待云母片自然干燥 后,AFM進(jìn)行觀察。AFM參數(shù)設(shè)置為輕敲模式,掃描區(qū)域?yàn)? μm×2 μm,掃描頻率是1.0 Hz;掃描探針(Model:Arrow UHFAuD)參數(shù):彈性系數(shù)(k)為6(1.5~21.0)N/m,材質(zhì)Si,無涂層,尖端半徑為(10±2)nm。


1.2.3 自組裝多肽水凝膠的制作和MC3T3-E1細(xì)胞接種

分別將1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))RADA16-Ⅰ和TRSAWmx母液與20%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))無菌蔗糖溶液按體積比1 ∶1混合,制成0.5%水凝膠工作液。取14 mm 圓形清潔蓋玻片置于24孔培養(yǎng)板內(nèi),向每張蓋玻片上分別滴加100 μL工作液。沿每孔內(nèi)壁,緩慢加入含10%胎牛血清+1%雙抗+50 μg/mL抗敗血酸+ 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM成骨培養(yǎng)液,培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的孵箱中靜置1 h。MC3T3-E1細(xì)胞常規(guī)消化離心后,成骨培養(yǎng)液制成5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,待凝膠固化成型后,吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔接種1 mL MC3T3-E1細(xì)胞懸液于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),隔天換液。


1.2.4 MC3T3-E1細(xì)胞在自組裝多肽水凝膠的粘附性能

分別向24孔板中放入14 mm圓形蓋玻片,并滴加RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液并使其成膠。在空白蓋玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠、TRSAWmx水凝膠上滴加1 mL MC3T3-E1細(xì)胞懸液,分別在第10、30、60、90分鐘吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗1次,以除去未粘附的細(xì)胞,隨機(jī)選取視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。


1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況
在96孔板內(nèi),滴加RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液各50 μL/孔,培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的孵箱中靜置1 h成膠后,分別在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝膠、TRSAWmx水凝膠上滴加100 μL 密度為5×104/mL 的MC3T3-E1細(xì)胞懸液。每天換液,在培養(yǎng)的1、3、5、7 d,吸去孔中培養(yǎng)基,按每10 ∶1的比例混合成骨培養(yǎng)液和CCK-8試劑,每孔加入100 μL CCK-8混合液,培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育1 h后,以酶標(biāo)儀在450 nm處測D(450)值。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞在水凝膠表面的生長


細(xì)胞在水凝膠中培養(yǎng)3、7、14 d后,吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30 min,用PBS清洗3次,0.2%Triton X-100室溫通透10 min,PBS清洗3次,加入5% BSA封閉1 h,隨后PBS清洗3次,加入配置好的羅丹明 -鬼筆環(huán)肽(5 U/mL) 工作液,室溫避光孵育30 min。用PBS清洗3次, 10 μg/mL的DAPI染液浸沒樣本,室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次,封片后,激光共聚焦熒光顯微鏡拍照。


1.2.7 ALP活性檢測

細(xì)胞在水凝膠中培養(yǎng)3、7 d和14 d后,吸凈孔內(nèi)的培養(yǎng)基,PBS清洗2次,每孔加入1%Triton X-100(100 μL)反復(fù)吹打,顯微鏡觀察細(xì)胞破碎。嚴(yán)格按照堿性磷酸酶試劑盒說明在96孔板內(nèi)進(jìn)行加樣,以酶聯(lián)免疫檢測儀在520 nm處測定D(520),同時(shí)用BCA法測定蛋白濃度,并計(jì)算ALP的活力。


1.2.8 茜素紅-S染色

細(xì)胞在水凝膠中誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后,吸凈孔內(nèi)的培養(yǎng)基,PBS清洗2次,4%多聚甲 醛固定20 min后,PBS清洗3次,加入茜素紅-S染液室溫下染色10 min,PBS清洗殘留染液,隨機(jī)取視野拍照。


1.2.9 RT-PCR
在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別用RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液成膠,在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝膠、TRSAWmx水凝膠上加入3 mL 1×105/mL的MC3T3-E1細(xì)胞懸液。培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的孵箱中,在培養(yǎng)第14天后,吸凈培養(yǎng)基,PBS清洗3次,隨后加入TRIzol提取RNA,各取1 μL mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后根據(jù)TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。β-actin、ALP、 骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)引物序列見表 1。使用2-△△Ct對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以x±s表示。


2 結(jié)果


2.1 原子力顯微鏡觀察不同材料的納米結(jié)構(gòu)
原子力顯微鏡下分別觀察RADA16-Ⅰ 、RADA16-TRSAW、TRSAW和TRASWmx 4組短肽的納米結(jié)構(gòu),TRSAW呈云絮狀,無法形成納米纖維狀結(jié)構(gòu)。RADA16-TRSAW自組裝成粗細(xì)不規(guī)則的斑片狀納米纖維,長徑為(523.7±142.9)nm,纖維之間未連接搭載,表明功能片段的加入會(huì)影響RADA16-Ⅰ β折疊形成,從而影響多肽自組裝成長的納米纖維。但是,將RADA16-Ⅰ與RADA16-TRSAW按1 ∶1比例混合后得到的TRSAWmx纖維長徑為(810.2±96.7)nm,直徑為(17.6±2.1)nm;RADA16-Ⅰ纖維長徑為(847.7±87.8)nm,直徑為(12.8±1.7)nm。TRSAWmx納米纖維直徑大于RADA16-Ⅰ(P<0.05)。兩者均能形成長的納米纖維(圖 1)。

2.2 不同時(shí)相點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面的粘附情況
計(jì)數(shù)后得到的細(xì)胞個(gè)數(shù),各組數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理10 min時(shí),空白組與RADA16-Ⅰ組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 2);30、60 min和90 min時(shí),空白組分別與RADA16-Ⅰ組和TRSAWmx組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),RADA16-Ⅰ組與TRSAWmx組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 不同時(shí)相點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面的增殖及生長形態(tài)變化
CCK-8檢測細(xì)胞增殖結(jié)果如圖 3所示,培養(yǎng)1 d時(shí),空白組與RADA16-Ⅰ和TRSAWmx組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),RADA16-Ⅰ組與TRSAWmx組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);第3、5、7天各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)如圖 4所示,MC3T3-E1細(xì)胞分別接種于不同材料表面誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3、7 d和14 d后,各組中細(xì)胞骨架纖維沿細(xì)胞長軸分布,連續(xù)排列,各時(shí)間點(diǎn)TRSAWmx組細(xì)胞數(shù)目較空白組和RADA16-Ⅰ組均有明顯增加(P<0.05)。

2.4 不同時(shí)相點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面的ALP活性檢測和茜素紅-S染色結(jié)果
ALP試劑盒檢測各時(shí)間點(diǎn)ALP活性,在3、7、14 d時(shí)各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 5)。這提示TRSAWmx上培 養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞能夠表達(dá)更高的堿性磷酸酶活性,成骨分化效果優(yōu)于RADA16-Ⅰ 水凝膠。

通過14 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后茜素紅-S染色觀察鈣結(jié)節(jié)的生成情況結(jié)果如圖 6所示,空白組細(xì)胞密度較小,僅有少量鈣結(jié)節(jié)形成;RADA16-Ⅰ組細(xì)胞密度較大,可見數(shù)個(gè)鈣結(jié)節(jié)形成;TRSAWmx組可見大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)著色。

2.5 自組裝水凝膠對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞OCN、ALP和VEGF基因表達(dá)的影響
根據(jù)Real-time PCR檢測結(jié)果,將空白組表達(dá)量定義為1,每組的相對(duì)表達(dá)量如圖 7所示。TRSAWmx組培養(yǎng)細(xì)胞的ALP、OCN和VEGF基因表達(dá)明顯高于空白組和RADA16-Ⅰ組(P<0.05)。

3 討論


自組裝納米多肽水凝膠RADA16-Ⅰ能夠在水相離子或生理鹽溶液觸發(fā)下,形成含水量可超過99%的納米纖維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究證明,這種含水量高的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)及微環(huán)境[12],為細(xì)胞提供三維的培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖、分化和相關(guān)生長因子的分泌有良好的促進(jìn)作用[13, 14, 15, 16]。同時(shí),其納米級(jí)的直徑10~20 nm及形成的微小孔徑 5~200 nm[2, 3, 4]可用于骨髓中干細(xì)胞的富集,以提高成骨活性[5]。


目前,大量研究表明,通過向RADA16-Ⅰ 肽的C末端連接功能短肽片段,能夠提高肽支架的相關(guān)生物組織特異性功能[3, 17, 18]。運(yùn)用此種方法得到的新 型肽水凝膠能夠在形成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的同時(shí),功能基團(tuán)并未參與納米絲纖維的β折疊形成,而是作為側(cè)鏈突出于β折 疊之外,以此種方式發(fā)揮作用[14, 17, 18]。Pan等[19] 證明將BMP-2相關(guān)蛋白(P24) 修飾RADA16-Ⅰ 后能增強(qiáng)材料促BMSCs增殖、黏附和異位成骨的能力。Tao等[20]采用BMP-7相關(guān)功能序列SNV和KPS改裝RADA16-Ⅰ所合成的水凝膠材料是一種較好的髓核組織工程材料。在課題組前期研究中,我們已經(jīng)將在細(xì)胞粘附過程中起重要作用的DGEA序列同RADA16-Ⅰ多肽C末端相接,成功地構(gòu)建了自組裝多肽納米水凝膠支架材料DGEAmx[21],提高了細(xì)胞的粘附性。在成骨修復(fù)過程中,研究者更關(guān)注如何誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化。


PTHrP基因編碼翻譯后加工主要產(chǎn)生3個(gè)具有很高活性的氨基酸末端PTHrP(1~36)PTHrP(38~94)以及PTHrP(107~139)[22],能通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞作用,在新骨形成和骨塑形過程中起到重要調(diào)節(jié)作用[23]。Osteostatin是PTHrP C末端結(jié)構(gòu)域PTHrP(107~111)五肽片段,能夠介導(dǎo)PTH/PTHrP受體非相關(guān)性受體,在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和分化[24]。


本研究中,我們通過肽固相合成法在RADA16-Ⅰ的C端與PTHrP(107~111)五肽連接得到RADA16-TRSAW,并將其與RADA16-Ⅰ等體積混合得到TRSAWmx混合液,創(chuàng)新設(shè)計(jì)并構(gòu)建出兼顧粘附和促成骨相關(guān)性能的自組裝多肽納米水凝膠TRSAWmx。TRSAWmx水凝膠纖維直徑大于RADA16-Ⅰ水凝膠纖維(P<0.05),但其仍具有納米級(jí)的直徑,能自組裝成長的納米纖維。TRSAWmx的細(xì)胞粘附能力較RADA16-Ⅰ無明顯差異,說明功能片段的加入不影響細(xì)胞在水凝膠上的粘附。細(xì)胞在TRSAWmx水凝膠上培養(yǎng)有著更佳的生長活力和骨誘導(dǎo)分化性能。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,自組裝水凝膠TRSAWmx促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞粘附、增殖和分化效果優(yōu)于單純的自組裝水凝膠RADA16-Ⅰ。


本研究初步證明,通過將RADA16-Ⅰ的C末端與PTHrP(107~111)氨基酸活性末端相接,構(gòu)建的新型自組裝納米水凝膠TRSAWmx在體外能夠兼顧細(xì)胞粘附和促成骨相關(guān)性能。這為后期可與脫鈣骨基質(zhì)、羥基磷灰石等相復(fù)合,進(jìn)一步研究復(fù)合后材料的體內(nèi)相關(guān)生物學(xué)性,以及進(jìn)一步運(yùn)用于臨床個(gè)體化治療[24]奠定了良好理論基礎(chǔ)。


免責(zé)聲明:本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí),版權(quán)歸原作者及原雜志所有,如有侵權(quán),可聯(lián)系刪除。文章標(biāo)注有作者及文章出處,如需閱讀原文及參考文獻(xiàn),可閱讀原雜志

上篇: 用于軟組織修復(fù)的肽基功能生物材料
下篇: 非侵入性透血腦屏障藥物遞送研究進(jìn)展
返回列表
全:種類繁多,修飾齊全
快:快速發(fā)貨,順豐包郵
優(yōu):專業(yè)團(tuán)隊(duì),品質(zhì)保證
24:客服在線,高效快捷

微信掃碼聯(lián)系客服
電話:0551-65177703  郵箱:pb@peptidesbank.com   地址:安徽省合肥市四川路868號(hào)云谷創(chuàng)新園A6棟3層
皖I(lǐng)CP備2024046425號(hào)-1