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兩條腫瘤靶向抑制肽的修飾及作用靶點的初步研究
瀏覽量:708 | 2024/5/14 16:17:13


[摘要]:目的 探討兩條腫瘤靶向抑制肽(QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS)經(jīng)化學修飾后(N端乙;、C端酰胺化)的穩(wěn)定性,并初步探討其作用靶點。方法 3H-TdR摻入法、CCK-8法分別探討多肽修飾前后對A549細胞增殖、活力的影響;高效液相色譜法(HPLC)測定多肽在10%血清條件下,不同時間點(12、24 h)的剩余量,評價其修飾前后在血清中的穩(wěn)定性;構(gòu)建GST標簽的多肽(GST-多肽)融合蛋白表達載體,在大腸桿菌中誘導表達、純化;免疫共沉淀法鑒定GST-多肽融合蛋白能否與VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合。結(jié)果 多肽RKRKRKKSRYIVLS經(jīng)化學修飾后在10%血清環(huán)境下對A549細胞增殖的抑制率由(2.63±6.19)%提高至(48.50±7.14)%(P<0.01),對A549細胞活力的抑制率由(1.30±7.90)%提高至(20.80±5.90)%(P<0.01),24 h后多肽在血清中的剩余量由(56.04±1.81)%提高至(64.64±0.30)%(P<0.01);多肽QKRKRKKSRKKH化學修飾前后在10%血清環(huán)境下對A549細胞增殖的抑制率分別為(28.38±5.63)%、(34.25±10.90)%(P>0.05),對A549細胞活力的抑制率分別為(8.09±5.84)%、(15.07±8.09)%(P>0.05),24 h后多肽在血清中的剩余量由(72.72±2.60)%提高至(77.43%±1.78)% (P<0.05);免疫共沉淀表明這兩條多肽均能與VEGFR-1、 VEGFR-2結(jié)合。結(jié)論 VEGFR-1、VEGFR-2為這兩條腫瘤靶向抑制肽的作用靶點;多肽RKRKRK KSRYIVLS、QKRKRKKSRKKH修飾后在血清環(huán)境下穩(wěn)定性明顯提高,修飾后的RKRKRKKSRYIVLS對A549細胞增殖及活力的抑制能力明顯增強。


血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)為促血管生成最主要的因子,能夠促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。本課題組此前運用生物信息學對VEGF片段VEGF125-136進行改造、篩選得到兩條全新多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS。初步研究發(fā)現(xiàn)這兩條多肽在無血清環(huán)境下能夠明顯抑制肺腺癌細胞株A549的增殖、多肽經(jīng)放射性核素99mTc或188Re標記后能夠靶向聚集于荷A549裸鼠的腫瘤部位,提示這兩條多肽有望作為分子探針或靶向藥物用于腫瘤的分子顯像及靶向治療[1, 2, 3],但其確切作用靶點尚需進一步探討。本研究旨在對這兩條腫瘤靶向抑制肽進行化學修飾,進一步提高其在血清中的穩(wěn)定性,并對其可能的作用靶點進行初步探討,即能否與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)結(jié)合、是與VEGFR-1還是VEGFR-2結(jié)合,為其用于腫瘤的分子顯像或靶向治療奠定基礎。


1 材料與方法


1.1 主要材料

胎牛血清(HyClone),DMEM培養(yǎng)基(HyClone)、A549細胞(中國科學院上海典藏細胞庫)、GST抗體(碧云天)、VEGFR-1與VEGFR-2抗體(Santa Cruz,美國)、Protein A+G Agarose(Santa Cruz,美國)、3H-TdR (中科院上海原子核研究所)、CCK-8(碧云天)、蛋白電泳常規(guī)設備由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院中心實驗室提供。


1.2 實驗方法
1.2.1 多肽的合成、化學修飾及與GST融合

常規(guī)固相法合成多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKK-SRYIVLS,化學修飾法對多肽N端乙;(Ac)、C端酰胺化(NH2),分別得到Ac-QKRKRKKSRKKH-NH2、Ac-RKRKRKKSRYIVLS-NH2。GST-多肽融合蛋白表達及純化的簡要步驟如下:體外人工合成編碼多肽的全長基因,并定向插入到pGEX4T-1載體中,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pGEX4T-1-多肽,測序正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導表達,超聲破碎后Glutathione Sepharose 4B進行純化,蛋白電泳鑒定融合蛋白的表達、純化效果。


1.2.2 GST-多肽融合蛋白與VEGFR-1、VEGFR-2的免疫共沉淀

A549細胞接種于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶,密度約為1×104個/mL,共15 mL,DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)常規(guī)培養(yǎng)。24 h后每個培養(yǎng)瓶中分別加入相應的GST-多肽融合蛋白GST-QKRKRKKSRK KH及GST-RKRKRKKSRYIVLS,其終濃度分別為80、185 nmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)基,PBS洗滌細胞1次,加入含蛋白酶抑制劑的IP細胞裂解液,4 ℃,30 min后離心,收集上清并行蛋白定量。取600 μg樣品,加入1 μg GST抗體或VEGFR-1抗體或VEGFR-2抗體為實驗組,1 μg IgG為陰性對照,4 ℃搖晃過夜。加入20 μL Protein A+G Agarose,4 ℃搖晃3 h,離心棄上清,IP細胞裂解液洗滌沉淀5次,棄上清,用1×SDS-PAGE上樣緩沖液重懸沉淀,煮沸冷卻后行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜至PVDF,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜3次,一抗即VEGFR-1抗體或VEGFR-2抗體或GST抗體4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下孵育2 h。TBST洗膜3次后ECL顯影。


1.2.3 3H-TdR摻入法比較多肽修飾前后對A549細胞增殖的抑制能力

A549細胞接種于96孔板,約5 000個/孔,總體積100μL,DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄上清。滅菌PBS洗滌細胞2次后加入DMEM培養(yǎng)基,血清終濃度分別為0%、10%,每孔(5個平行孔)分別加入修飾前后的多肽(終濃度240 μmol/L),空白對照加入相同體積PBS,總體積100 μL/孔,培養(yǎng)18 h后加入3H-TdR,37 kBq/孔,培養(yǎng)6 h。棄培養(yǎng)液,200 μL PBS洗滌2次,40 μL胰酶充分消化后加入超純水200 μL/孔,靜置20 min,多頭細胞樣品收集器收集細胞于玻璃纖維濾紙,雙蒸水洗滌9次,次氯酸固定2次,80 ℃,40 min烘干,濾紙置于膜片閃爍液,避光2 h,液閃儀測量放射性計數(shù)率并換算成衰變率(Bq)。抑制率=(對照組Bq-實驗組Bq)/對照組Bq×100%。


1.2.4 CCK-8法比較多肽修飾前后對A549細胞活力的影響
A549細胞接種于96孔板,約3 000個/孔,DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄上清,PBS洗滌1次后加入DMEM培養(yǎng)基(血清終濃度分別為0%、10%),每孔(4個平行孔)分別加入修飾前后的多肽(終濃度240μmol/L),空白對照加入相同體積PBS,總體積100 μL/孔。培養(yǎng)20 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,細胞培養(yǎng)箱孵育2 h。96孔板置于多功能酶標儀,450 nm測定光密度值[D(450)]。

抑制率=[對照組D(450)值-實驗組D(450)值]/對照組D(450)值×100%


1.2.5 HPLC法測定多肽修飾前后在10%血清條件下的穩(wěn)定性

A549細胞接種于96孔板,約5 000個/孔,總體積100 μL,DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)24 h后棄上清、滅菌PBS洗滌細胞。實驗組加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、修飾前后多肽(終濃度240 μmol/L,總體積100 μL/孔,5復孔),繼續(xù)培養(yǎng)12、24 h后分別取50 μL樣品進行HPLC分析,得到實驗組多肽濃度(μmol/L)。另設0 h組:DMEM培養(yǎng)基中不含胎牛血清,加入多肽后立即用HPLC法測量多肽濃度,其余同實驗組。計算多肽剩余百分比=實驗組多肽濃度(μmol/L)/0 h組多肽濃度(μmol/L)×100%。


1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗,多組計量資料數(shù)據(jù)采取單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。


2 結(jié)果


2.1 多肽的合成、化學修飾及與GST融合

成功合成目標多肽并經(jīng)化學修飾得到Ac-QKRK RKKSRKKH-NH2、Ac-RKRKRKKSRYIVLS-NH2,HPLC純化,質(zhì)譜鑒定,純度達95%以上。


GST-QKRKRKKSRKKH、GST-RKRKRKKSRYIVLS融合蛋白經(jīng)誘導表達及純化后的電泳結(jié)果見圖 1。結(jié)果表明2個目的蛋白均為可溶性,相對分子質(zhì)量約為28×103,可用于下一步的免疫共沉淀實驗。

2.2 GST-多肽融合蛋白與VEGFR-1、VEGFR-2的免疫共沉淀
GST-QKRKRKKSRKKH與A549細胞孵育后,免疫共沉淀法檢測其與VEGFR1的結(jié)合:提取A549細胞的總蛋白,首先用抗GST抗體免疫沉淀含GST多肽的蛋白復合物,分別用VEGFR1抗體(圖 2A上)、GST抗體(圖 2A下)行Western blot檢測顯示,通過免疫沉淀獲得的蛋白復合物中含VEGFR1蛋白,而IgG對照組未檢出;然后,利用抗VEGFR1抗體進行反向免疫共沉淀含VEGFR1的蛋白復合物,分別用GST抗體(圖 2B上)、VEGFR1抗體(圖 2B下)行Western blot檢測顯示,經(jīng)免疫沉淀獲得的蛋白復合物中含有GST-多肽,而IgG對照組未檢出。提示GST-QKRKRKKS RKKH能夠與A549細胞中的VEGFR1相互結(jié)合。同 理提示 GST-QKRKRKKSRKKH與VEGFR2(圖 2C、D),GST-RKRKRKKSRYIVLS與VEGFR1(圖 3A、B)及VEGFR2(圖 3C、D)能夠相互結(jié)合。

2.3 多肽修飾前后在10%血清條件下的穩(wěn)定性
與A549細胞共培養(yǎng)12、24 h后,QKRKRKKSRK KH在10%血清條件下的剩余百分比分別為(80.14±1.81)%、(72.72±2.60)%,修飾后分別提高至(82.46±0.84)%(P<0.05)、(77.43±1.78)%(P<0.05);RKRKRKKSRYIVLS在10%血清條件下 的剩余百分比分別為(70.52±1.55)%、(56.04±1.81)%,修飾后提高至(77.90±1.19)%(P<0.01)、(64.64±0.30)%(P<0.01)。這提示多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS修飾后在10%血清中的穩(wěn)定性明顯提高。

2.4 3H-TdR摻入法比較多肽修飾前后對A549細胞增殖的抑制能力
培養(yǎng)基中不含血清時,多肽QKRKRKKSRKKH對A549細胞增殖的抑制率為(35.58±17.00)%,當培養(yǎng)基中血清濃度為10%時,QKRKRKKSRKKH修飾前后對A549細胞增殖的抑制率分別為(28.38±5.63)%、(34.25±10.90)%,三者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖 4),即多肽在10%血清環(huán)境下對A549細胞增殖的抑制能力未見明顯降低。
培養(yǎng)基中不含血清時,多肽RKRKRKKSRYIVLS對A549細胞增殖的抑制率為(55.49±10.31)%,當培養(yǎng)基中血清濃度為10%時,RKRKRKKSRYIVLS對A549細胞增殖的抑制率降為(2.63±6.19)%,修飾后提高至(48.50±7.14)%,三者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖 4),即多肽在10%血清環(huán)境下抑制A549細胞增殖能力顯著下降(P<0.01),經(jīng)修飾后抑制能力顯著提高(P<0.01),提示RKRKRKKSRYIVLS易被血清降解,經(jīng)修飾后在血清中的穩(wěn)定性明顯提高。


2.5 CCK-8法比較多肽修飾前后對A549細胞活力的影響
培養(yǎng)基中不含血清時,多肽QKRKRKKSRKKH對A549細胞活力的抑制率為(8.29±5.50)%,當培養(yǎng)基中血清濃度為10%時,QKRKRKKSRKKH修飾前后對A549細胞活力的抑制率分別為(8.09±5.84)%、(15.07±8.09)%,三者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖 5),即多肽在10%血清環(huán)境下對A549細胞活力的抑制能力未見明顯變化。

培養(yǎng)基中不含血清時,多肽RKRKRKKSRYIVLS對A549細胞活力的抑制率為(13.24±3.59)%,當培養(yǎng)基中血清濃度為10%時,RKRKRKKSRYIVLS對A549細胞活力的抑制率降為(1.30±7.90)%,修飾后提高至(20.80±5.90)%,三者間差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01),即多肽在10%血清環(huán)境下對A549細胞活力的抑制能力明顯下降(P<0.05),經(jīng)修飾后抑制能力明顯提高(P<0.01,圖 5),提示RKRKRKKSRYIVLS易被血清降解,經(jīng)修飾后在血清中的穩(wěn)定性明顯提高。


3 討論


腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與血管生成密切相關,VEGF是促血管生成最主要的因子,其受體VEGFR高表達于腫瘤細胞及新生血管內(nèi)皮細胞,在其他細胞中低表達或不表達,抑制VEGF/VEGFR通路能明顯抑制腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移,提示VEGF/VEGFR通路為腫瘤分子顯像及靶向治療的重要靶點[4, 5, 6, 7]。本課題組前期運用生物信息學方法對VEGF片段VEGF125-136改造,并經(jīng)生物學實驗篩選得到兩條全新多肽QKRK-RKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS,這兩條多肽不但不會促進腫瘤細胞的增殖,反而在無血清環(huán)境下對A549細胞增殖的抑制能力分別達到了35.58%、55.49%,且荷瘤裸鼠SPECT顯像表明其具有腫瘤靶向性[1, 2, 3]。


本研究表明,與無血清環(huán)境比較,10%血清條件下多肽QKRKRKKSRKKH對A549細胞增殖的抑制作用有降低趨勢、RKRKRKKSRYIVLS的抑制作用明顯下降(圖 3),提示這兩條多肽在血清中穩(wěn)定性較差,這或許是該多肽在體抑制腫瘤細胞增殖作用較弱的主要原因,故需要對該兩條多肽進行修飾,以提高其穩(wěn)定性。對多肽末端進行封閉是增加多肽穩(wěn)定性的常見途徑[8],N端乙;堑鞍踪|(zhì)最常見的修飾方法之一,能增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[9, 10],C端酰胺化對多肽二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用[11]。對多肽而言,N端乙;(或)C端酰胺化可以減少多肽的整體電荷,使其與母本蛋白更為接近,提高其對蛋白酶、端解酶及合成酶等外肽酶的抵抗力。故我們對兩條多肽進行保護性的化學修飾,即N端乙酰化(Ac)、C端酰胺化(NH2),分別得到Ac-QKRKRKKSRKKH-NH2、Ac-RKRKRKKSR YIVLS-NH2。10%血清條件下,Ac-RKRKRKKSRYIVLS-NH2對A549細胞增殖、活力的抑制作用均明顯高于修飾前,說明修飾后RKRKRKKSRYIVLS在血清環(huán)境下的穩(wěn)定性明顯提高(經(jīng)HPLC證實),為下一步的在體研究奠定了基礎。HPLC結(jié)果表明修飾后的QKRKRKKSRKKH在10%血清條件下的穩(wěn)定性提高,但其抑制A549細胞增殖及活力的能力未見明顯變化,說明QKRKRKKSRKKH無論修飾與否在血清環(huán)境下均能明顯抑制A549細胞增殖,可以直接用于下一步的在體實驗。

這兩條多肽具有腫瘤靶向性,且能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖,但其作用靶點尚不十分清楚,而作用靶點的闡明對其用于腫瘤的分子顯像及靶向治療至關重要。課題組前期通過生物信息學方法預測發(fā)現(xiàn),這兩條多肽理論上的作用靶點可能包括VEGFR、EGFR、αvβ3、FLT-3、HGFR、Tie-2、VIPR-2等。GST融合蛋白作為工具蛋白被廣泛應用于分子生物學研究,有研究報道可用于免疫共沉淀[12],本研究通過對多肽與GST進行融合表達,得到可溶性融合蛋白GST-QKRKRK KSRKKH、GST-RKRKRKKSRYIVLS,然后采用免疫共沉淀法證實這兩條多肽均能與VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合,即VEGFR-1、VEGFR-2為這兩條多肽的作用靶點,多肽可能通過封閉VEGFR-1、VEGFR-2對 A549細胞增殖起抑制作用。是否還存在VEGFR-1、VEGFR-2之外的其他作用靶點是下一步研究的方向。


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