液相色譜的基本原理是依靠混合物所包含的不同組分在兩相中溶解、分配以及吸附等存在的差異,如果兩相處于相對運動狀態(tài),讓各組分在兩相內持續(xù)進行上述反應之后實現(xiàn)有效分離,根據(jù)既定順序通過固定相流出,按照相應的柱后檢測方式確;旌衔飪炔煌M分實現(xiàn)有效分離,如圖1。在實踐工作中,兩相中必然存在一相處于固定狀態(tài),通常稱之為固定相,即色譜柱,而另一相處于流動狀態(tài),即流動柱,一般也能夠稱其為溶劑。液相色譜儀往往包含了高壓色譜泵、進樣器、色譜柱、柱溫箱以及檢測系統(tǒng)構成。
2、高效液相色譜儀的故障分析
2.1 高壓輸液系統(tǒng)
(1)常見故障
高壓輸液系統(tǒng)一般來說包含了貯液器以及高壓泵等,這里的貯液器主要發(fā)揮出存儲流動相的功能,輸液管頂部位置配備了過濾器。貯液器以及流動相如果受到污染可能會導致過濾器出現(xiàn)堵塞問題,對流速穩(wěn)定性帶來影響,導致基線出現(xiàn)變化,同時在色譜圖中形成多余的峰;底值必然會提升,導致樣品內低濃度組分難以有效檢測。高壓泵屬于HPLC系統(tǒng)持續(xù)穩(wěn)定運行的關鍵動力源,若其無法持續(xù)穩(wěn)定運行導致系統(tǒng)壓力出現(xiàn)較大范圍的波動,抽取流動量產生變化,很容易影響最終檢測結果。高壓泵常見故障表現(xiàn)為泵頭氣泡或者密封圈滲漏等。
(2)應對措施
一是應當確保貯液器定期進行清洗,可選擇酸、水等,再使用超純水復洗。如果貯液器屬于溶劑瓶,在實際應用90天之后需要更換,防止微生物對檢測結果造成影響。二是應當對流動相過濾器做到每月定期實施超聲波清洗,每年定期予以更換。三是配置流動相需要選擇HPLC級的試劑,如果使用其他級別的試劑要經由0.45μm的過濾設備實施過濾。四是流動相正式使用之前需要通過超聲波脫氣15分鐘,同時在其中配備在線脫氣設備,能夠有效避免氣泡對檢測結果帶來的影響。儀器設備長期使用是導致密封圈滲漏的關鍵性因素,所以應當在各次作業(yè)結束后選擇相應的容積將泵內的緩沖液進行全面清理,防止鹽析出后導致柱塞桿發(fā)生磨損。
2.2 進樣系統(tǒng)
(1)常見故障
進樣系統(tǒng)一般包括手動與自動兩個類型,目前來說較為普遍運用的六通閥屬于手動進樣器,不管二者屬于何種類型,在實際應用中普遍發(fā)生的故障是進樣閥堵塞,從而導致系統(tǒng)壓力增加,接頭滲漏對進樣量的準確性帶來影響。
(2)應對措施
對進樣離心系統(tǒng)故障予以解決時,應當對濾膜的相關樣品部件實施科學處理,對離心系統(tǒng)進行處理時應當對高速濾膜離心機閘閥實施有效過濾,在確保這一作業(yè)有效完成后,再實施通過濾膜的操作,要確保這一過程的持續(xù)穩(wěn)定進行,應當對0.45um的高速濾膜閘閥予以全面過濾,讓這一閘閥的濾膜在實際應用的過程中可以獲得準確的增加速度。除此之外,為避免進樣色譜系統(tǒng)流動狀態(tài)下形成較多緩沖性含鹽,在日常使用液相色譜儀之后應當?shù)谝粫r間通過有效策略對其中各個部件實施反復清洗,洗針也能夠有效避免出現(xiàn)樣品殘留。
2.3 檢測系統(tǒng)
(1)常見故障
檢測器一般來說可以把樣品濃度轉變?yōu)殡娦盘,在實際作業(yè)中較為普遍的一種便是紫外檢測器,但其可能存在的故障集中在基線噪聲、飄移以及燈故障上。
(2)應對措施
針對基線噪聲問題來說,首先需要對電壓情況進行全面檢測,確保工作站和檢測器信號輸出有效接觸;其次確保采用HPLC級容器;最后要對檢測池進行全方位檢測,確保不存在氣泡,保持高壓泵的持續(xù)可靠運行。針對基線飄移問題來說,首先要仔細察看貯液瓶的情況;其次應當避免檢測器溫度不存在較大程度的變化;最后要觀察檢測器與色譜柱是否受到污染。而對于燈故障來說,通常所選擇的處理方式是直接進行更換。
2.4 分離系統(tǒng)
(1)常見故障
分離系統(tǒng)屬于高效液相色譜儀的關鍵部件之一,柱壓以及柱效參數(shù)會在很大程度上決定其運行壽命,如果色譜柱的柱壓超過或低于標準值,在實際使用過程中很容易導致檢測結果出現(xiàn)偏差,該色譜柱應當及時報廢處理。
(2)應對措施
在處理分離系統(tǒng)故障問題的過程中應選擇如下措施:
首先,在色譜柱pH規(guī)定值之內科學調控流動相的pH值;其次,選擇色譜純試劑以及超純水,進行樣品分析之前經由針筒實施過濾,選擇0.45um濾膜,流動相以及樣品內所包含的固體顆粒網常常會導致色譜柱出現(xiàn)堵塞問題,導致柱壓增加;再次,借助在線過濾器以及保護柱,因為流動相以及樣品過濾后不能夠確保固體顆粒物百分百清除,如果進入色譜柱之后很容易導致柱壓增加,因此需要予以充分重視;最后,應當選擇強溶劑對色譜柱實施全方位清洗,在實際使用之后可以選擇緩沖鹽對流動相進行清理,再選擇乙腈或者甲醇實施清洗。
2.5 峰拖尾
(1)常見故障
在高效色相色譜儀的實際使用時,色譜圖可能產生峰拖尾的現(xiàn)象,該問題產生的原因一般是受到柱效降低或峰干擾的問題,在很大程度上降低了最終檢測結果的準確性,導致色譜儀難以持續(xù)穩(wěn)定運行。
(2)應對措施
針對上述問題,可以選擇如下解決策略:一是對柱進行更換,盡可能避免讓其處于低腐蝕環(huán)境下。二是應當適當降低連接點,對連接點予以優(yōu)化調整。三是在弱腐環(huán)境下對色譜柱實施更換。四是安裝在線過濾器,對燒結不銹鋼予以更換。五是減少流動相pH值,通過增加堿或三乙胺純化柱的方式提高緩沖液濃度。六是提高柱直徑,減少樣品數(shù)量,選擇高容量固定相。
3、對高效液相色譜儀的日常維護
3.1 高效液相色譜儀開機以及關機時的注意事項
在做好分析準備工作后,需依次將穩(wěn)壓電源、高壓輸液泵、柱溫箱、檢測器等打開,而在完成以上各部件的自檢后,再把和儀器相連的電腦打開,讓相應的工作軟件處于運行狀態(tài)。結束分析后,需先將工作軟件關閉,再按照打開時相反的順序關閉各部件。
3.2 對于流動相的要求
一般情況下,高效液相色譜儀所采用的流動相均為有機溶劑與水,且沸點也比較低,當然也可能是緩沖溶液的混合物。為了能夠正常使用此儀器,要求全部的流動相一定要是色譜純級的,且在過濾了雜質和將氣泡排除后,方可以干凈地貯存瓶中對其予以儲存。
(1)針對流動相的物理性能要求。
對分析物的溶解能力要強,如此可將檢驗精密度提高;且還需有較小的黏度,保證柱降壓在合理范圍內;同時沸點也不能高,以便在制備分離過程中更好地回收樣品。
(2)流動相的過濾。
在使用前,應借助0.45 μm(或0.22 μm)的水溶性濾膜來過濾全部的流動相,以將其中的雜質微粒去掉。
(3)對流動相進行脫氣。
流動相使用之前一定要做脫氣處理,不然便極易導致氣泡出現(xiàn)在系統(tǒng)內,破壞泵的工作和基線的穩(wěn)定性。
常用脫氣方法包括:
第一,在線真空脫氣法。
該法即在儲液系統(tǒng)中串聯(lián)真空脫氣裝置,并聯(lián)系起膜過濾器,讓流動相在脫氣后再進入輸液泵。此種方法具有理想效果,且對于多元溶劑體系較為適用。
第二,超聲脫氣法。
此法多用于實驗室中,即在超聲波水浴中同時放入完成配置的 流動相和容器,接受15~30min超聲。
第三,抽真空脫氣法。
利用微型真空泵降壓至0.05~0.07 MPa,并把所溶解的氣體B1除去。因為抽真空會改變混合溶劑組成,所以在對多元溶劑混合之前,需先對其進行脫氣,確保不會改變混合后的組分。
3.3 泵的維護
堅決不允許在泵內留存含有緩沖鹽的流動相,特別是在停泵過夜或時間更長的情況下。在完成分析檢測后,應以純水沖洗泵,再采用相應溶劑予以清洗。一般可通過甲醇或甲醇與水的混合溶液來清洗反相鍵合固定相。如果有流動相做緩沖鹽,則在緩沖鹽和有機溶劑交換前,需以2%甲醇水溶液清洗泵,防止結晶形成于有機相的鹽中,損壞泵的各個組件。
4、結語
不論是在工業(yè)生產,還是科研學習中,高效液相色譜儀均發(fā)揮了重要作用,而要想讓儀器得到有效利用,必須在高效利用的同時,將經驗與歷史數(shù)據(jù)聯(lián)系起來對其展開良好維護。借助分析、排除故障,可知曉使用前的檢測與使用后的沖洗流路環(huán)節(jié)是不可缺少的,確保儀器能夠長時間使用的關鍵就是保持儀器部件干凈,未被灰塵污染。對此,要求使用者在使用時養(yǎng)成正確習慣,在操作過程中嚴格遵循相關規(guī)程,第一時間對一些關鍵部件予以檢查維護,包括泵、色譜柱、檢測池等,如此方可在試驗過程中將故障及時排除和解決,讓儀器能夠被更長久的使用,促進數(shù)據(jù)準確性、穩(wěn)定性的顯著提升。