液相分析中,在適當(dāng)?shù)姆治龇椒l件下,單一化合物的色譜峰應(yīng)是對稱、尖銳的峰型。如果色譜圖上出現(xiàn)的是雙峰:
(3)如果確保進(jìn)樣的是光學(xué)純的單一物質(zhì),且該結(jié)構(gòu)在此色譜條件中穩(wěn)定,仍然出現(xiàn)了雙峰,通常被稱為色譜雙峰,也就是單一物質(zhì)在色譜圖中出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象。這種情況非常容易誤導(dǎo)分析者的判斷,那么色譜雙峰該如何判別區(qū)分?是什么原因產(chǎn)生,又該如何解決呢?可以從以下幾方面思考色譜雙峰的產(chǎn)生的原因。
1.色譜柱或保護(hù)柱污染或塌陷
這是遇到色譜雙峰首先考慮的方面,如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都出現(xiàn)雙峰(出峰越快,出現(xiàn)雙峰的可能性越少),尤其采用單一純物質(zhì)時,可以判定色譜柱出問題(柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失)。如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭端堵塞,將色譜柱反接沖洗維護(hù),一般情況下可以解決。如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭填料受污染或鍵合相流失可能性更大,這時可以對色譜柱維修處理或者使用新的色譜柱,維修建議交由廠家處理。
解決方案:將保護(hù)柱拿掉,檢測色譜雙峰是否有改善。如果沒有使用保護(hù)柱,那就是色譜柱污染或者堵塞(可以通過壓力判斷),最好的方法是將色譜柱反過來接,用流動相或其它溶劑沖洗、酸洗,將堵在柱頭的殘留物沖掉,一般情況下可以解決色譜雙峰問題。如果依舊不行,那就是強(qiáng)吸附物質(zhì)污染了色譜柱,則有必要采取色譜柱再生的方法。
2.溶劑效應(yīng)
這是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因,即樣品溶劑與流動相的相容性不好,導(dǎo)致單一物質(zhì)出現(xiàn)色譜雙峰。例如當(dāng)以中等極性的溶劑作為進(jìn)樣溶劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而流動相體系中以強(qiáng)極性水為主,樣品進(jìn)樣體積較大時,很可能出現(xiàn)色譜雙峰現(xiàn)象。主要是由于樣品溶劑與流動相極性相差太大,流動相來不及將進(jìn)樣溶劑稀釋,從而引起色譜柱內(nèi)的環(huán)境突然發(fā)生較大的變化(即極性不均勻),造成組分洗脫不均勻,導(dǎo)致色譜峰裂分或分叉。對極性比較敏感的化合物容易產(chǎn)生此種情況,通常表現(xiàn)在出峰時間較早的色譜峰裂分,對較晚的色譜峰影響較小,且第二峰比第一峰小,常伴有拖尾。
解決方案:調(diào)整樣品的進(jìn)樣溶劑,盡可能與流動相溶劑保持一致;此外,減小樣品的進(jìn)樣體積,亦可以減少色譜雙峰的發(fā)生。
3.進(jìn)樣量過載
通常表現(xiàn)為雙峰緊靠在一起,基本上齊高不拖尾。主要是由于樣品進(jìn)樣濃度很高或進(jìn)樣體積很大,色譜柱過載,從而出現(xiàn)色譜雙峰。如果降低進(jìn)樣量將樣品稀釋后再進(jìn)樣,色譜雙峰基本就可以改善。
解決方案:將樣品稀釋,同時減少進(jìn)樣體積。
4.流動相的酸堿度
這種情況主要針對弱酸堿性化合物而言。流動相中酸堿pH值不僅與峰拖尾相關(guān),同時也可能出現(xiàn)色譜雙峰。通常是第二峰比第一峰小,當(dāng)出峰時間較早時,兩峰高差距較大,第二峰較小,甚至消失;當(dāng)出峰時間較長時,峰高趨于相等。主要可能是樣品在流動相中存在酸堿解離平衡,化合物同時存在已解離和未解離兩種分子狀態(tài)。我們曾采用HPLC制備分離過一類膽汁酸類成分,流動相中加入0.01%甲酸,雖色譜峰不拖尾,但幾乎每個膽汁酸類色譜峰裂分成雙峰。當(dāng)提高流動相中甲酸的濃度至0.05%和0.1%,可以明顯看到膽汁酸色譜峰的裂分距離縮小,明顯的由色譜雙峰向單峰融合。
解決方案:改變流動相中酸堿的pH值,提高酸堿的濃度,在更強(qiáng)的酸堿性條件進(jìn)行分析。
5.樣品的互變異構(gòu)
如果某一物質(zhì)出現(xiàn)雙峰,兩峰緊靠且不拖尾,條件稍加變化,如pH、溫度改變,雙峰消失或減小,例如紅霉素等。有的樣品采用LC/MS分析時,紫外色譜圖雖不易觀察到雙峰,但質(zhì)譜總離子流圖出現(xiàn)較為明顯的色譜雙峰。這可能與特定的物質(zhì)有關(guān),由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個動態(tài)平衡存在,如酮式和烯醇式互變。
解決方案:了解樣品性質(zhì),調(diào)整色譜方法,如改變流動相或進(jìn)樣溶劑中pH值、緩沖鹽,降低或升高柱溫箱的溫度等,以減少互變異構(gòu)的發(fā)生,促使樣品在分析條件中主要以單一構(gòu)型為主。
6.儀器參數(shù)設(shè)置不合理
參比波長設(shè)置錯誤,例如設(shè)置分析波長254nm,參比波長400nm,這個對于大多數(shù)化合物可能沒影響。但是如果被測化合物,在400nm處也有強(qiáng)的紫外吸收,比254nm更強(qiáng)。這樣其出峰時,由于背景的抵扣作用,本來一個峰會變成對稱的二個峰,而且如果將二峰之間的峰谷反轉(zhuǎn)180度,恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設(shè)置更大,或者取消。